考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

1、实验报告学院：第二临床医学院 专业:临床医学 年级：2013级 班级：US姓名： _学号：_日期：2014,3,8 得分：实验课程：生物化学实验实验名称：蛋白质的定量测定（五）考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验目的】学握誇马斯亮蓝G-250测定蛋白质含長的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝G-250 （C（x）massic G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分于中磺酸基的蓝色 染料，在处有黒大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成 蛋白质一考马斯亮蓝复台物蓝色溶液，引起该染料的呈大吸收Xmax的位萱发生红移，在 595nm处有是大吸收宣。由于蛋白质一考马斯亮蓝食台物在

2、595n处的光吸收远高于考马斯 亮蓝在465nm处的光吸收，因此可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质一誇马斯亮蓝 复台物溶液颜色的深浅与蛋白质的'浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适台于 蛋白质类的定是分析尤其适台于稀有蛋白质的微星分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜 色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质長在lug左右。【试剂与器材】试剂：誇马斯亮蓝试剂：誇马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质長浓度为0.85g/ml 的磷酸，用蒸憎水稀释到1000mlo标准蛋白质溶液：结晶牛血清清蛋白，预先经微長凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含長，然 后根据该蛋白的纯度

3、用0.15m（l/LNacl配制成l.Omg/ml蛋白溶液。器材:试管和试管架722型分光光度计吸長管移液枪【实验步骤】一、制作标准曲线管号0123456标准蛋白质溶液/ml00.20.40.60.81.0009%Nxl溶液/ml10.80.60.40.200誇马斯亮 蓝实剂/ml一53*535各管混匀后，静晝3血门，以0号管为空白管调零，在595晌 波长下分别测定各管溶液的 吸光度值（A595）以A595值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。二、待测蛋白质浓度测定测定方法同上，1凶待测蛋白质家5凶誇马斯亮蓝试剂，。用上述0号管调零，测出血清的 人595值。【实验结果】管号012345

4、6吸光度值0.1560.1970.2620.2920.3190.3620.119一统性o尺光JStfi)M白鄆农!s由仪器测長可得A595=0.179,可得标准蛋白质溶液为0.0790mg/ml.【注意事项】必须在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间內颜色是最稳定的。测定中蛋白-染料龟台物会有少部分吸附在比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯清洗干 净。【思考与讨论】一、誇马斯亮兰法的突出优点是：(0因为蛋白质与染料结台后产生的颜色变化很大，蛋白质一染料复台物有更高的消光系 数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。(2) 测定快速、简便，只雷加一种试剂。完成一

5、个样品的测定，只雲要5分钟左右。由于 染料与蛋白质结台的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且 在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像分钟之间，颜色的稳定性最 奸。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。(3) 干扰物质少。如干扰Swy法的K+、Na+、Mg2+、离于Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘 油、疏墓Z1醇、EDTA等均不干扰此测定法。二、此法的缺点是：(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含長不同，因此Bradford法用于不同蛋 白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用一球査白为标准蛋白质，以减少这方 面的偏差。(2) 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton 3100、十二烷基 硫酸钠(SDS)和0N的NaOH (如同0N的酸干扰Lowary法