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1、重组重组DNADNA连接、转移、筛选与鉴定连接、转移、筛选与鉴定连接：连接：粘性末端连接、平末端连接、粘性末端连接、平末端连接、人工接头连接法，同聚物加尾连接人工接头连接法，同聚物加尾连接。第1页/共63页1 1 粘性末端连接粘性末端连接第2页/共63页粘性末端连接粘性末端连接第3页/共63页双酶切，定向克隆双酶切，定向克隆第4页/共63页 两个具有平末端的双链两个具有平末端的双链DNADNA分子连接。分子连接。 问题：低效率、串珠现象；问题：低效率、串珠现象；2、平末端连接平末端连接(blunt end ligation)(blunt end ligation) ：提高平末端提高平末端DNA

2、DNA连接的效率：连接的效率：加入大分子凝聚剂加入大分子凝聚剂, , 如：如：PEG8000PEG8000；加大连接酶的量加大连接酶的量第5页/共63页 利用末端转移酶在载体及外源双链利用末端转移酶在载体及外源双链DNADNA的的3 3端各加上一段寡聚核苷酸端各加上一段寡聚核苷酸, ,如如dA(dG)dA(dG)和和dT(dC),dT(dC),制成人工粘性末端；制成人工粘性末端； 然后在然后在DNADNA连接酶的作用下连接酶的作用下, , 连接成为重组的连接成为重组的DNADNA分子。分子。 3 3、同聚物加尾法、同聚物加尾法 (homopolymer tails joining) (homo

3、polymer tails joining) ：第6页/共63页重组重组DNADNA连接连接-同聚物加尾法同聚物加尾法 第7页/共63页 将人工合成的或来源于现有质粒的一小段将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNADNA分子分子( (在这一小段在这一小段DNADNA分子上有分子上有某种限制性内切酶的识别序列某种限制性内切酶的识别序列) ), , 加到载体或外源加到载体或外源DNADNA的分子上的分子上, , 然后通过然后通过酶切制造粘性末端，再进行连接的方法。酶切制造粘性末端，再进行连接的方法。 4 4、人工接头连接法：、人工接头连接法：Adapter:Adapter:化学合成化学合成第8页

4、/共63页连接反应体系（连接反应体系（2020l l）： 载体载体DNADNA片段；片段； 目的目的DNADNA片段；片段； T4 DNA T4 DNA 连接酶；连接酶； 10 X buffer10 X buffer第9页/共63页1 1、反应温度：、反应温度：1616度；度； 2 2、时间：过夜或、时间：过夜或1h1h；3 3、DNADNA量：量：50-100ng50-100ng；4 4、载体与目的、载体与目的DNADNA比例比例 1 1：8 8（摩尔比）；（摩尔比）；5 5、酶量、酶量连接反应注意：连接反应注意：第10页/共63页重组重组DNADNA连接、转移、筛选与鉴定连接、转移、筛选与

5、鉴定 重组重组 DNA DNA 导入宿主导入宿主 转移：转移：第11页/共63页 接合接合 (conjugation(conjugation）：）：当细胞之间、细菌当细胞之间、细菌间通过菌毛相互接触时，质粒间通过菌毛相互接触时，质粒DNA DNA 从一个细从一个细胞胞( (细菌细菌) ) 至另一细胞至另一细胞( (细菌细菌) )的转移。的转移。 转导（转导（transductiontransduction）：）：当病毒（噬菌体）从被感染的当病毒（噬菌体）从被感染的( (供体供体) )细胞细胞释放出来、再感染另一释放出来、再感染另一( (受体受体) )细胞时，发生细胞时，发生DNADNA转移及基

6、因重组。转移及基因重组。 转座转座(transposition )(transposition )：有些基因可以从一有些基因可以从一个位置移动到另一位置，由可移动的个位置移动到另一位置，由可移动的DNA DNA 序序列（插入序列和转座子）介导列（插入序列和转座子）介导。自然界的基因转移和重组自然界的基因转移和重组 ：基因转移基因转移第12页/共63页 基因转移过程中，不同基因转移过程中，不同DNADNA分子间发生的共价连接称分子间发生的共价连接称基因重组。基因重组。 包括位点特异性的重组（整合酶催化）和包括位点特异性的重组（整合酶催化）和 同源重组同源重组两种类型。两种类型。 发生在同源序列间

7、的同源重组，又称基本重组。发生在同源序列间的同源重组，又称基本重组。 同源重组依赖两分子间序列的相同或相似性，将外源同源重组依赖两分子间序列的相同或相似性，将外源DNADNA整合进宿主染色体。整合进宿主染色体。基因重组：基因重组：第13页/共63页体外重组体外重组DNADNA的转移的转移转化转化(transformation)(transformation)：普通普通 DNA DNA 的转移的转移 转染转染(transfectim)(transfectim)：病毒核酸的转移病毒核酸的转移 感染感染(infection)(infection)：病毒的侵染等。病毒的侵染等。当受体为细菌时：常采用电

8、击法、热击法（氯化钙当受体为细菌时：常采用电击法、热击法（氯化钙法）法）受体为真核生物时：电击法，基因枪，显微注射。受体为真核生物时：电击法，基因枪，显微注射。重组重组DNADNA分子导入受体：分子导入受体：第14页/共63页热击法（氯化钙法）热击法（氯化钙法） 能够接受转化作用的细菌的生理状态叫感受态能够接受转化作用的细菌的生理状态叫感受态 。连接产物连接产物第15页/共63页 外源基因导入组织或细胞的一种物理学转化方法。外源基因导入组织或细胞的一种物理学转化方法。 基因枪基因枪(gene gun)(gene gun) 微粒轰击法微粒轰击法(microparticle bombardment

9、)(microparticle bombardment)： 将载有外源基因的微米将载有外源基因的微米/ /亚微米级的金属微粒（钨或金粉）加速，高速轰击并射入受亚微米级的金属微粒（钨或金粉）加速，高速轰击并射入受体靶细胞的方法。体靶细胞的方法。基因枪转化：基因枪转化：第16页/共63页第17页/共63页电穿孔电穿孔(electroporation)(electroporation)转化：转化： 利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入细胞的转化方法。利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入细胞的转化方法。 电击仪电击仪: : Gene PulseGene Pulse 及及0.2 cm 0.2 cm

10、电击杯电击杯 电击参数：电击参数： 电容电容-10F-10F，电阻，电阻-400-400，电压，电压-1.5 kV-1.5 kV； 电击缓冲液：电击缓冲液：10% 10% 甘油或蔗糖。甘油或蔗糖。第18页/共63页DNADNA显微注射法显微注射法第19页/共63页重组重组DNADNA连接、转移、筛选与鉴定连接、转移、筛选与鉴定 插入失活筛选（抗性基因插入失活）插入失活筛选（抗性基因插入失活） 蓝白斑筛选；蓝白斑筛选； PCRPCR筛选；筛选； 酶切鉴定；核酸杂交等酶切鉴定；核酸杂交等。筛选：筛选：两个层次：重组两个层次：重组/ /非重组非重组DNADNA， 阳性克隆（菌落）阳性克隆（菌落）方法

11、：方法：第20页/共63页酶切鉴定酶切鉴定反应体系反应体系(20l) (20l) ： 质粒质粒DNA 3lDNA 3l 10 10M Buffer 2lM Buffer 2l Eco EcoR I 1lR I 1l Hin HindIII 1ldIII 1l 补灭菌超纯水至补灭菌超纯水至 20l20l 3737水浴中酶切水浴中酶切1h1h。 反应结束取反应结束取8l 8l 进行进行1%1%琼脂糖凝胶电泳检琼脂糖凝胶电泳检查酶切情况，确定插入片段大小。查酶切情况，确定插入片段大小。 选择酶切鉴定正确的克隆进一步测序，备用。选择酶切鉴定正确的克隆进一步测序，备用。 第21页/共63页重组质粒重组质

12、粒酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图1 1500bp第22页/共63页重组质粒重组质粒酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图2 2第23页/共63页核酸杂交核酸杂交 分子杂交分子杂交(molecular hybridization) (molecular hybridization) ： 检测混合样品中特定核酸分子的存在，以及其分子量大小。检测混合样品中特定核酸分子的存在，以及其分子量大小。 Southern Southern 杂交、杂交、Northern Northern 杂交杂交 原理原理: : 两条具有碱基互补序列的两条具有碱基互补序列的DNADNA分子变

13、性后分子变性后, , 在溶液中一起进行复性时在溶液中一起进行复性时, , 可以形成杂合双链可以形成杂合双链DNADNA分子。分子。 杂交的双方是杂交的双方是待测的核苷酸序列待测的核苷酸序列（克隆的基因片段或基因组（克隆的基因片段或基因组DNADNA或是细胞总或是细胞总RNARNA）及）及探针探针。第24页/共63页第25页/共63页1.引起核酸变性的因素：引起核酸变性的因素：酸、碱、热、变性剂（尿素、胍）酸、碱、热、变性剂（尿素、胍）有机溶剂（乙醇、丙酮）有机溶剂（乙醇、丙酮）2.2.核酸的复性（核酸的复性（RenaturationRenaturation）退）退火：火：互补单链重新缔合成双链

14、的过程。互补单链重新缔合成双链的过程。影响复性速度的因素：影响复性速度的因素：DNADNA大小；离子强度；大小；离子强度；DNADNA浓度浓度；第26页/共63页核酸杂交核酸杂交 Southern Southern 杂交杂交 菌落杂交菌落杂交 斑点杂交斑点杂交 第27页/共63页Southern Southern 杂交杂交 Southern blotting Southern blotting ： 用合适的限制性内切酶消化用合适的限制性内切酶消化DNA, DNA, 电泳分离电泳分离DNADNA片段片段, , 利用毛细作用利用毛细作用, , 使液体经使液体经过凝胶过凝胶, , 使使DNADNA片

15、段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物（硝酸纤维膜）片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物（硝酸纤维膜）表面，然后进行杂交。表面，然后进行杂交。作用：作用：检测特定基因的大小、拷贝数、变异等。检测特定基因的大小、拷贝数、变异等。第28页/共63页Southern Southern 杂交杂交 DNADNA的抽提、质量检测；的抽提、质量检测； 限制性内切酶操作；限制性内切酶操作； DNADNA的琼脂糖凝胶电泳分离、的琼脂糖凝胶电泳分离、0.4N NaOH0.4N NaOH碱变性；碱变性； 转膜（毛细管渗吸或电转移）；转膜（毛细管渗吸或电转移）； 80 80 处理或紫外线照射将处理或紫外线

16、照射将 DNA DNA 固定在膜上；固定在膜上； 探针制备、检测等。探针制备、检测等。Steps:第29页/共63页第30页/共63页 能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸序列。核苷酸序列。 分类分类: : 1. 1. 同位素标记同位素标记 2. 2. 非同位素标记非同位素标记: :地高辛地高辛 （digoxygenin, digoxygenin, DIGDIG） 标记核酸探针标记核酸探针, ,利用抗利用抗 DIG DIG 的抗体通的抗体通过酶联免疫反应检测。过酶联免疫反应

17、检测。探针（探针（probeprobe）：）：第31页/共63页1.1.缺口平移法缺口平移法2.2.随机引物法随机引物法第32页/共63页第33页/共63页Southern blottingSouthern blotting随机引物法随机引物法DIG DIG 标记的探针标记的探针 第34页/共63页原位杂交原位杂交 核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织，将标记的核酸探针与细胞或组织切片中核酸，核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织，将标记的核酸探针与细胞或组织切片中核酸，进行杂交进行杂交。 特点：不需要提取核酸特点：不需要提取核酸 可定性定量可定性定量 可定位。可

18、定位。第35页/共63页第36页/共63页菌落杂交菌落杂交将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使 DNA DNA 释放出来，释放出来，并使之固定在滤膜上；并使之固定在滤膜上； 然后通过分子杂交，判断哪些菌落含有与探针同源的然后通过分子杂交，判断哪些菌落含有与探针同源的 DNADNA。 第37页/共63页第38页/共63页斑点杂交斑点杂交 最简单，快速、简便检测微量最简单，快速、简便检测微量DNADNA或或RNARNA将样品点到一张硝酸纤维素膜

19、上，将样品点到一张硝酸纤维素膜上，然后进行分子杂交。然后进行分子杂交。第39页/共63页第40页/共63页Western Blotting1 1、生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白；、生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白； 2 2、SDS-PAGESDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离电泳将蛋白质按分子量大小分离; ;3 3、蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上；、蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上；4 4、将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点、将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点 蛋白质电泳、印迹蛋白质电泳、印迹第41页/

20、共63页 加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体）；体）； 二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）；酶或碱性磷酸酶）； 通过特异性反应显色进行检测。通过特异性反应显色进行检测。 5 5、免疫测定、免疫测定第42页/共63页构建基因文库筛选目的基因构建基因文库筛选目的基因 基因文

21、库：基因文库： 某生物的基因组某生物的基因组 DNA DNA 或或 cDNA cDNA 片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，经筛选后得到大量的阳片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，经筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合称性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合称。 理想地包含着该物种的全部遗传信息。理想地包含着该物种的全部遗传信息。 第43页/共63页基因文库技术基因文库技术 第44页/共63页按照外源按照外源 DNA DNA 片段的来源，基因文库分为：片段的来源，基因文库分为：基因组基因组 DNA DNA 文库（文库（genomic DNA libr

22、arygenomic DNA library）：）：cDNA cDNA 文库（文库（complementary DNA librarycomplementary DNA library）：）： cDNA cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的胞内的 mRNA mRNA 经体外反转录后形成的双链经体外反转录后形成的双链 cDNAcDNA，再将这些再将这些cDNAcDNA与合适的载体重组后导入宿主细胞。与合适的载体重组后导入宿主细胞。，这一组重组子带有该种生物的所有蛋白的编码基因。这一组重组子带有该种生物的所有蛋白的编码基因。 分类：第45页/

23、共63页基因组文库构建将某生物的全部基因将某生物的全部基因组组 DNA DNA 用限制性内切用限制性内切酶或机械力量切割成酶或机械力量切割成一定长度范围的一定长度范围的 DNA DNA 片段，与合适的载体片段，与合适的载体体外重组，并转化相体外重组，并转化相应的宿主细胞获得的应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。所有阳性菌落。第46页/共63页基因基因组文库构建过程：组文库构建过程： 高纯度大分子量基因组高纯度大分子量基因组 DNA DNA （High High molecular weight DNA, HMW DNAmolecular weight DNA, HMW DNA）的提取）的提取 载体

24、的制备；载体的制备； HMW DNA HMW DNA 的部分酶切与电泳分级分离；的部分酶切与电泳分级分离； 载体与外源片段的连接、转化或侵染宿主载体与外源片段的连接、转化或侵染宿主细胞；细胞； 重组克隆的挑取和保存。重组克隆的挑取和保存。 缺点：基因中包含内含子缺点：基因中包含内含子 第47页/共63页第48页/共63页cDNA cDNA 文库构建流程文库构建流程第49页/共63页文库筛选：文库筛选：1.1.核酸杂交核酸杂交第50页/共63页第51页/共63页2. 2. 菌液菌液PCRPCR进行重组克隆的快速筛选。进行重组克隆的快速筛选。基本方法：基本方法： 从抗性平板上挑取单菌落接种至从抗性

25、平板上挑取单菌落接种至LBLB培养基中，培养基中，振荡培养，取振荡培养，取1L1L菌液裂解制备模板，再进菌液裂解制备模板，再进行行PCRPCR筛选。筛选。第52页/共63页通过自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、通过自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列。凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列。根据分子间的特异作用的原理，实现对细胞、蛋白质、根据分子间的特异作用的原理，实现对细胞、蛋白质、基因等生物组分的准确、快速、大信息量的检测。基因等生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片（生物芯片（BiochipBiochip）：）：第53页/共63页基因芯

26、片（基因芯片（DNA DNA 芯片）：芯片）： 将将 DNA DNA 分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中靶分子的数量，进而得知样品中 mRNA mRNA 的表达量。的表达量。 进行基因突变体的检测和基因序列的测定；进行基因突变体的检测和基因序列的测定；第54页/共63页 微型化：微型化：每平方厘米固体表面上可固定十万个每平方厘米固体表面上可固定十万个 DNA DNA 片段、片段、数万个基因。一次分析可得到数万个基因的表达信息。数万个基因。一次分析可得到数万个基因的表达信息。 样品用量与试剂用量的微量化，纳克级的样品用量与试剂用量的微量化，纳克级的 mRNA mRNA 、微、微升级的杂交液。升级的杂交液。 自动化自动化：芯片制作及分析过程，杂交、洗片、芯片结果读取与芯片制作及分析过程，杂交、洗片、芯片结果读取与扫描与数据处理扫描与数据处理 都可实现自动化，工作效率高。都可实现自动化，工作效率高。第55页/共63页 将玻片用化学方法处理并联接上活性基团，如氨将玻片用化学方法处理并联接上活性基团，如氨基、醛基、巯基等，使生物分子基、醛基、巯基等，使生物分子寡核苷酸或短肽寡核