丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定

1、内型肝炎病毒核心蛋门酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cdna文库的扩增、纯化和鉴 定 作者：作者：刘敏，张伟，陈天艳，蔺淑梅，赵良，刘锦锋，赵英仁，张树林【关键词】丙型肝 炎病毒核心蛋白摘要：目的用含丙型肝炎病毒核心(hcv core)蛋白的cdna片段构建酵母 双杂交诱饵载体,并进行人胎肝cdna文库的扩增、纯化和鉴定。方法pcr扩增含hcv core 蛋白不同大小的cdna片段，分别克隆入puc19质粒，经测序正确后，再亚克降入酵母双 杂交诱饵载体pgbkt7中。扩增人胎肝cdna文库并纯化、鉴定。结果 获得含hcv core 蛋白的cdna片段，并成功克隆入pgbkt7中。待转化的人肝c

2、dna文库滴度在5x 108 左右，纯化后的质粒dna质量浓度约lg/l。用ecor i、xho i双酶切显示插入片段大小 不一。结论成功构建了核心蛋白的酵母双杂交诱饵载体；扩增、纯化的人胎川cdna文库 的多样性很好，适合于筛选。为用酵母双杂交技术研究与hcv core蛋白相互作用的蛋白打 下坚实基础。关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白；酵母双杂交；cdna文库abstract: objective to construct the bait vector of hcv core region in yeast twohybrid system, and to amplify, purify an

3、d evaluate the cdna gene bank of human fetal liver. methods the cdna fragments encoding hcv core region were amplified by pcr, and then were cloned into puc19. after being verified by sequencing, they were subcloned into the bait vector pgbkt7 of yeast twohybrid system, subsequently amplified and pu

4、rified and then the cdna gene bank of human fetal liver was evaluated results the cdna fragments of hcv core region were amplified successfully.the cdna gene bank of human fetal fetal liver was about 5 x 10& the purified dna was about lg/l; and the built in fragments were different in size after

5、 digested with ecor i and xho i conclusion the bait vector hcv core in yeast twohybrid system 3 is constructed successfully. the diversity of cdna of human fetal liver after amplified and purified is suitable for screening these lay a rigid basis for further study of the hcv core protein and may hel

6、p us in understanding how hcv works.key words:hcv core protein; yeast twohybrid system; cdna gene bank 丙型肝炎病毒(hcv)感染是引起慢性肝炎、肝破化和肝细胞癌的主要原因，全球超过1.7亿 人口血清hcv抗体阳性。fi前对于hcv感染尚无有效的预防疫苗，病毒蛋白对hcv感染 细胞的功能影响还很不明确，利巴韦林和干扰素联合治疗仅对部分病例有效。这就迫切要求 我们进一步了解病毒与细胞间的相互作用及免疫逃避机制。缺乏hcv感染和复制的组织培 养系统、缺乏合适的hcv感染动物模型是我们进行hcv发病

7、机制研究所而临的主要障碍l o分子生物学技术的发展为我们的研究提供了新的思路。蛋白质与蛋白质的相互作川是很多生命现象的基础2。酵母双杂交系统是近年来新发展起 來的一种分析真核细胞中蛋白蛋白、蛋白dna、蛋白rna相互作川的一种有效的基因分析 方法。酵母双杂交gal4系统3是在系统1和系统2基础上的改进，具有转化效率高，假阳 性率低等优点，我们利用它来克隆与hcv核心(core)蛋白相互作用蛋白的基因，以期为hcv core蛋白功能的研究提供新依据。1材料与方法1.1材料 含hcv全长cdna质粒pcdna3.()hcv由第四军医人学微生物教研室尹文i専士 惠赠；表达载休pgbkt7酵母菌种(美

8、国clontech公司)；质粒puc19菌种(本研究室保存)； pcr试剂盒、dna重组所用的各种限制性内切酶、t4dna连接酶(gibco公司)；人肝酵母 双杂交cdna文库购自clontech公司。1.2方法121 pcr扩增克隆编码核心蛋白的引物：引物p1： 5，gccgaattcatgagca cgaatcctaaacct3 '； 引物 p2 :5 ' gcgtcgacttaggctgaagcgggcacagt3'。pcr 反应条件为：94°c 30s, 55°c 60s, 72°c 60s, 30 个循坏。1.2.2 pcr产物克

9、隆及鉴定 纯化的pcr产物用ecorl和sall双酶切，定向克隆入puc19 质粒，转化大肠杆菌dh5a,进行蓝白筛选。酶切鉴定岀含插入片段的阳性克隆命名为 puc 19core蛋白，进彳亍序列分析。1.2.3构建及鉴定诱饵载体用ecor i、sal i酶切puc19core蛋白和表达载体pgbkt7,冋 收core蛋白及pgbkt7载体片段，载体片段与插入片段连接后转化人肠杆菌dh5 a。经限 制性内切酶分析，含正确插入片段的克隆命名为pgbkt7core蛋白。1.2.4人胎肝cdna文库的扩增、纯化与鉴定按clontech公司的说明书对文库进行扩增， 用qiagen公司的操作手册对文库进行

10、纯化。取纯化的文库质粒1 u l转化e.coli dh5 a感 受态细胞，随机挑収10个-单克隆提取质粒，ecor i xhol双酶切鉴定cdna文库的多样 性。2结果2.1 core蛋白基因片段编码区的扩增可见扩增出与预期大小一致的cdna片段（图1）。core 蛋白大小为588bp0图1核心蛋白基因片段编码区扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略）fig.l age analysis of pcr products encoding cdna fragments of hcv core region genem: dnapcr marker; 1-6: hcv core2.2重组puc19core蛋

11、片质粒的酶切鉴定及序列分析 鉴定正确的puc19core蛋片重组质粒 分别做止反向测序，序列分析表明所扩增的core蛋口基因序列为登录的hcv core蛋口基因 序列完全一致（图2）o图2重组puc19core蛋h质粒的ecor i、sal i双酶切鉴定（略）fig.2 age analysis of recombinant plasmid puc19core digested with ecor i , sal im: dnapcr marker ; 1-2: puc19core recombinant plasmid2.3重组pgbkt7core蛋白质粒的酶切分析 重组质粒pgbkt7co

12、re蛋口的酶切鉴定结果见 图3。图3重组pgbkt7core蛋白质粒的ecor i、sal i双酶切鉴定（略）fig.3 age analysis of recombinant plasmid pgbkt7core digested with ecor i , sal im: dnapcr marker; 13: pgbkt7 core recombinant plasmid2.4人胎肝cdna文库的扩增、纯化与鉴定 经测定，待转化的人肝cdna文库滴度在5x 108左右，纯化后的质粒dna浓度约lg/l。用ecor i , xho i双酶切鉴定cdna文库的 多样性。结果显示插入片断人小不一

13、（图4）。说明文库的多样性很好，适合于筛选。图4经ecor i . xho【双酶切的cdna文库的琼脂糖凝胶电泳结果（略）fig.4 age analysis of cdna gene bank digested with ecor i and xho i 3 讨论酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取为已知蛋口直接相互作用分子的方法3。对于一种 蛋白质，如能钓到与z相互作用的已知蛋白，将对其功能的研究具有明确的指导方向；如钓 到未知功能蛋白，对于未知功能的新蛋白的研究将提供一个新的线索。zhang等4用酵母 双杂交的方法鉴定了蛋口酶体亚单位psma7与hbxag特异相互作用，提示蛋口酶体复合 体

14、是hbxag的细胞靶位的功能基础。harvey等为研究hbv受体使川酵母双杂交方法研 究lhbsag的前s1区筛选人肝文库，筛选到一个未鉴定蛋白。这个未鉴定蛋白与谷光甘肽 s转移酶（gst）衣达成融合蛋白可以和hbv以直接方式结合。ghosh筹用酵母双杂交技 术证明了 ns5a与新鉴定的细胞转录因子srcap相互作用，可能是ns5a对细胞生长调节 的机制之一。shi等7也通过对hepg2和人肝cdna文库的酵母双杂交筛选到apoal, 个高密度脂蛋白成分，与ns5a相互作用，提示ns5a参与脂代谢紊乱的病理过程，可以解 释hcv感染后普遍存在的肝脏脂肪变性。hcv core蛋白位丁病毒多肽的氨

15、基末端，被宿主的信号肽臨切割后产牛。hcv core蛋白除 了作为核壳蛋白具有病毒颗粒纽装功能外，还具有调节细胞凋亡、脂代谢、转录、免疫呈递 等作用1810j,其氨基酸序列高度保守，临床和实验研究显示hcv core蛋白具有广泛的反式 激活作用11。core蛋口对细胞信号转导途径，尤其是nfkb、api和sre相关途径具有 明显的增强作用12；在hela和hepg2细胞系中hcv core蛋白与tnfr1胞浆区相互结合， 影响tnfr1的信号传递，增加了 tnf诱导的细胞凋亡，与细胞增殖、分化及慢性炎症形成 等有关13o在hepg2细胞中，核心蛋白激活人类cmyc基因、rsv ltr和sv40

16、早期出动 子14； hcv core蛋口与p53协同破坏宿主细胞的完整性，干扰抗原递呈和免疫反应，逃避 各种非抗原特有效应因子清除hcv感染肝细胞，使病毒得以复制150hcv进入肝细胞后，病毒基因组及其编码的蛋白与肝细胞基因及蛋白之间的相互作用是决 定hcv复制、表达、免疫逃逸、慢性感染、肝纤维化及致恶性转化的关键因索之一。hcv core蛋白具有广泛的反式激活作川。这种反式激活的作丿u机制，一方面是hcv core蛋白木 身可以与感染的靶细胞基因组中相关丿r!动子序列结合，影响基因表达；另一方而是hcv core 蛋门与感染靶细胞核中转录因子蛋门进行结合，从而对于靶细胞基因的表达产生间接的影

17、 响。与宿主多种形式蛋白相互作用，可能是hcv感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发 展的重要原因。木研究用pcdna3.0core蛋白全长cdna经pcr成功构建了融合冇hcv core 蛋白的重组表达质粒pgbkt7core蛋白，完成了胎川cdna文库的扩增、纯化和鉴定工作， 为用酵母双杂交技术研究与core蛋白相互作用的蛋白打下坚实基础。参考文献：1 rosen hr, gretch dr. hepatitis c virus: current understanding and prospects for future therapies j. mol med today, 1999,5

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19、ough exhaustive twohybrid screens j. nat genet j997,16( 1 ):2772824 zhang z, torii n, furusaka a, et al. structural and functional characterization of interaction between hepatitis b virus x protein and the proteasome complex j j biol chem, 2000,275(7):1515715165.5 harvey tj, macnaughton tb, park ds

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