川芎嗪对小鼠化学性肝损伤的实验研究

1、川茸嗪对小鼠化学性肝损伤的实验研究【摘要】目的研究川莒嗪(tetramethylpyrazine,tmp)对小鼠化学性肝损伤的作用及其可能机制。方法采用在体和离体两种方法观察: 在体以d-氨基半乳糖(dgalactosamine,d-gal)诱导小鼠急性肝损 伤模型，测定各组肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,gpt)、 谷草转氨酶(gl utamic-oxal acetic transaminase;got)活性，及肝组织丙二醛(malondialdehyde,mda)、 黄嘿吟氧化酶(xanthine oxidase ,xod)、谷胱甘肽过

2、氧化物酶 (glutathion peroxidase , gsh-px) 、 一 氧化氮(nitrogen monoxidum ,no)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase ,nos)、 诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase ,inos)含量。体 外实验采用小鼠离体肝细胞原代培养,并建立cc14诱导肝细胞坏死 性损伤模型，检测tmp对其的影响。结果tmp能显箸降低小鼠血清 中升高的gpt, got,降低xod活力和过氧化物终产物mda的 含量。对氧化应激引起的肝脏gsh含量下降具有升高作用。tmp 可以显著降低离体培养

3、中染毒肝细胞中的gpt水平。结论 提示 tmp对小鼠化学性肝损伤具有显著的保护作用。【关键词】川夸嗪肝损伤 肝原代培养细胞川茸嗪为中药川茸的有效成分，化学结构为四甲基比嗪 (tetramethylpyrazine , tmp),被广泛应用于心脑血管闭塞性疾病 的治疗1。川茅嗪有解痉、降压、扩张血管等广泛的生物作用。 川茸嗪在肝细胞方面的研究尚少见报道。有研究表明2，川茸嗪 能减轻大鼠肠缺血再灌注所致肝脏损伤。其机制与减少大鼠脂质过 氧化，改善atpase功能有关。本实验采用了体内给药以及建立体外 模型两种方法观察tmp对小鼠急性肝损伤的保护作用。在体实验主 要从体内降酶和抗脂质过氧化、抑制no

4、等方面研究tmp对肝损伤 的治疗作用。离体采用体外小鼠原代细胞模型,排除神经和体液因素 的影响，观察tmp对cc14染毒的小鼠肝细胞的保护作用，进一步探 讨tmp及阳性对照药物的膜保护作用机制，以便为临床用药提供 参考。1材料与方法11动物昆明种小鼠，雌雄兼用，体重2124 g (荆门职业技术学院实验动 物中心提供)。1.2药品与试剂川茸嗪注射液40 mg/2ml,(北京第四制药有限公司生产，批 号:200503020) , d半乳糖胺(d-gal),重庆医科大学提供,批 号：051215 ,四氯化碳(cc14 ),分析纯，南京化学试剂一厂生产， 批准文号：gb32226；生化检测试剂盒均购自

5、南京建成生物工程研 究所提供；刀豆蛋口 a (concanavalin a , con a ,sigma)；卩塞卩坐蓝 (mtt , sigma)； 胶原酶(collagenase ,475 u mg-1)为 sigma 产 品；二甲基亚砚(dmso,苏州正兴化工厂)；乙二醇双3 氨基乙 基)醛四乙酸(hepes)均购自和光纯药药工业株式会社。1.3动物分组昆明小鼠随机分为5组，每组10只。分别为止常对照组:生理 盐水20 ml kg- 1 ；模型组:生理盐水20 ml kg- 1 ；tmp高剂 量组:800 ml kg- 1 ；中剂量组400 ml kg- 1 ；低剂量组200 ml kg-

6、 1,灌胃1次/d,连续给药7 do于末次给药1 h后，除正常对 照组外，其他各组小鼠均腹腔注射10% d-gla (800 mg kg-1 )。禁 食不禁水,16 h后由球后静脉丛取血，分离血清备测gpt, goto处 死小鼠后，取肝称重并计算肝系数(肝脏湿重与体重之比)。1.4血清酶活性测定分离血清后用赖式改良法测gpt, got;称取肝脏总重量，测肝 重系数变化。1.5肝组织匀浆酶活性测定用考马斯亮蓝法(试剂盒)测定蛋口质含量，用硫代巴比妥酸法 (试剂盒)测定丙二醛(mda)含量，用紫外分光光度法(试剂盒)测定黄 瞟吟氧化酶(xod)活性,用二硫双硝基苯甲酸显色法(试剂盒)测定 谷胱甘肽

7、过氧化物酶(gsh-px)活性，用硝酸还原酶法(试剂盒)测定 一氧化氮(no) o1.6肝细胞分离小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，用70%的酒精棉球消毒小鼠体表后, 背位固定。再次用酒精棉球消毒其腹部,腹正中v形切口，使腹腔充 分暴露，门静脉插管并固定，向肝脏灌注37 °c预温的前灌流液(无钙镁 hank *s 平衡盐溶液，内含 0. 5 mmol l- 1 egta、25 mmol l- 1 hepes ,ph 7.4) o同时打开后腔静脉，尽量冲尽肝组织中残血，然后 打开胸腔，剪断前腔静脉，结扎后腔静脉。再用37 °c预温的灌流液(含 0.1%胶原酶、4 mmol l- lc

8、ac12, 0.8 mmol l- 1 mgso4 的 hbss) 继续灌流，控制流速约6 ml min- 1,持续灌流数分钟后，待肝组织韧 性消失，轻压不易恢复，停止灌流。立即将肝脏置于含完全培养基的培 养皿中，用含10-6 mol l- 1胰岛素和10 - 6 mol l- 1地塞米松的无 血清rpmi-1640培养基冲洗23次后,将肝脏转入另一盛有含胰岛 素和地塞米松的rpmi-1640培养基的平皿中，用眼科银去除肝包膜, 轻轻抖动，分散肝细胞，将此肝细胞悬液用100目滤网过滤，滤液以50 xg离心2 min ,弃上清，沉淀为肝实质细胞(hepatocytes ,hc) 3 1.7 cc

9、14致肝损伤与转氨酶的释放实验在96孔培养板中加入上述分离的肝细胞，每孔细胞数为2x 104 , 于37 °c, 5 % co2培养4 h,肝细胞单层用p高、中剂量组使升高 的肝脏系数极显著地降低(p< 0.01)o与模型组相比,tmp高、中剂 量组小鼠血清中gpt , got水平均显著下降(p< 0.01)o结果见 表1。表1 tmp对d-半乳糖胺所致肝损伤小鼠血清酶水平的影响 (略)2. 2 tmp对d-gal所致肝损伤小鼠肝匀浆中mda、xod和 gsh水平的影响模型组肝匀浆mda水平及xod活力与正常组相比明显升高 (p< 0.01)

10、 ,tmp高、中、低剂量组中,肝匀浆mda水平明显降低 (p< 0.01), tmp高、中、低给药组动物肝匀浆中xod活力与模 型组相比，明显降低；与对照组相比，模型组肝匀浆gsh水平也明 显降低(p< 0.01) , tmp高、中剂量组升高肝匀浆中降低的gsh 活九tmp低剂量给药组未见明显效果。结果见表2。表2 tmp对 d半乳糖胺所致肝损伤小鼠肝匀浆中mda, xod和gsh水平的 影响(略)2.3 tmp对d-gal所致肝损伤小鼠肝匀浆中no, nos和inos 水平的影响模型组肝匀浆no, nos, inos水平与正常组相比明显升高 (p<0

11、.01), tmp高，中剂量组均可显著降低肝匀浆中升高的 no, nos, inos含量，tmp低剂量组未见明显作用。见表3。表 3 tmp对d-半乳糖胺所致肝损伤小鼠肝匀浆中no, nos和inos 水平的影响(略)2.4形态学观察对照组肝细胞形态无明显改变，细胞界限清晰。cc14损伤后，肝 细胞经台盼蓝染色显示，细胞活性明显降低，在显微镜下，可见细胞膜 不规则，有皱缩现象tmp组及各给药组细胞形态明显好于模型组。2.5 dgll对cc14损伤肝细胞gpt的影响cc14损伤肝细胞后，促进肝细胞内酶的释放，模型组的gpt水平 较对照组明显升高。与模型组相比tmp各剂量组均能显著抑制 gpt水平

12、的升高，在与上述相同的浓度下，均可剂量依赖性地降低 gpt浓度。见表4。表4 tmp对cc14损伤肝细胞alt的影响(略)3讨论体内实验中采用d-gal腹腔注射导致小鼠急性肝损伤，实验中模 型组小鼠血清gpt, got水平明显升高，与正常对照组比较均有明 显改变，提示本实验造成了小鼠急性肝损伤5。本实验结果表 明，tmp可降低产生氧自由基酶系的活九如可降低xod活力和过 氧化物终产物mda的含量。mda可间接反映机体细胞受自由基 攻击的程度，显示细胞损伤的程度。同低剂量组相比高剂量组降低 mda的含量优于低剂量组，提示tmp高、中剂量较低剂量具有更强 的减轻脂质过氧化反应的作用,减轻过氧化作用

13、对细胞膜，rna和 蛋白质等的攻击，从而改善由过氧化反应引起的肝损伤6。gsh 广泛存在于人体的各种组织中。gsh水平降低意味着机体抗氧化能 力下降并引发机体的氧化应激反应，因此自由基生成大量增加。从本 实验可以看出，与对照组相比,模型组肝匀浆gsh水平显著降低，提示 在肝脏化学性损伤时，氧化应激消耗gsh引起肝脏gsh含量下降, 机体抗氧化能力下降并引发机体的氧化应激反应，因此自由基生成大 量增加。tmp处理后肝脏gsh之所以明显高于肝损伤组。可能与 下述机制有关：减轻氧化应激的程度使其低于肝损伤模型组； 增强组织、细胞的抗氧化能力,减弱氧化应激反应导致的肝损伤。本 实验用d-gal致急性肝

14、损伤后,模型组肝匀浆inos水平与正常组相 比显箸升高，同时模型组肝匀浆no水平也明显升高，这些主要由 inos诱导产生的no在肝损伤中主要起毒性作用。本实验结果提 示tmp组显著降低肝匀浆中升高的no，从而减轻肝脏组织中高水 平的no对肝组织的毒性作用，且tmp高剂量组较中剂量组小鼠肝 组织中no浓度进一步降低，提示tmp对肝组织中no浓度降低在 一定范圉内与剂量呈正相关。cc14中毒引起的动物gpt升高水平 与肝细胞损伤程度呈平行关系7,转氨酶升高在一定程度上反映 了肝细胞的损伤程度8。本实验中我们采用原代培养肝细胞的方 法,建立了 cc14诱导肝细胞坏死性损伤模型。cc14染毒2 h ,表明 cc14是通过早期溶膜作用而破坏膜结构，细胞膜受损，通透性增加，细 胞内gpt, k+顺浓度梯度而漏出。分离正常小鼠的hc，预培养后 加入不同浓度的药物共培养4 h，洗去药液后加入cc14共培养。结果 与hc的gpt自动释放值相比,cc14加入后引起原代肝