知母宁抗乙肝病毒作用的实验研究

1、    知母宁抗乙肝病毒作用的实验研究    丁蔚茅摘要:目的:观察知母宁的抗乙肝病毒作用。方法:观察不同浓度知母宁对体外培养的2.2.15细胞分泌hbsag、hbeag的抑制作用及对乙肝模型鸭dhbv-dna的影响。结果:知母宁浓度为4 mg/ml时对2.2.15细胞分泌hbeag有明显的抑制作用;以200 mg/kg治疗乙肝模型鸭10d后dhbv-dna水平明显降低。结论:知母宁有抗乙肝病毒的作用,其机制可能与抑制hbv-dna的复制有关。关键词:知母宁;乙肝病毒;2.2.15细胞;dhbv-dna乙型肝炎为常见病、多发病,据统计我国已约有一半以上人

2、口经受hbv感染1。目前对乙肝的治疗多采取综合疗法,其中抗病毒治疗是主攻方向,但是到目前为止已发现的抗hbv药物疗效难尽人意。知母宁(chinonin)是从多种植物中提取出的一种四羟基吡酮的碳糖苷,属双苯吡酮类化合物。前期的研究表明chinonin有抗脂质过氧化作用、抗疱疹病毒作用等23。有研究认为民间用来治疗肝炎的藏茵陈的有效成分为chinonin4。为了进一步深入研究chinonin的生物活性及药理特性,我们开展了chinonin抗乙肝病毒作用的体内外实验研究,以期筛选出新的高效低毒的抗hbv药物。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验细胞、动物2.2.15细胞由广州空军医院提供;

3、1日龄华南麻鸭,由广州中医药大学实验动物中心提供。1.1.2 药品与试剂chinonin(三九药业生化研究所提供);dmem(gibco);胎牛血清(gibco),g418(gibco),hepes;mtt(sigma);dmso(广州新港化工厂生产);hbeag,hbsag检测试剂盒(华美生物工程公司生产);dhbv质粒(中国医学科学院医药生物技术所生产);缺口翻译药盒(promega公司生产);-32p-dctp(北京亚辉公司生产);dhbv阳性血清。1.1.3 实验仪器细胞培养瓶、96w培养板、co2培养箱(napco 5410)、酶标仪(bio-rad:3550)、96孔杂交点样器(美

4、国bio-rad公司生产)。1.2 实验方法1.2.1 2.2.15细胞培养2.2.15细胞复苏后,以dmem培养基培养于细胞瓶中,长满后,用0.06%的胰蛋白酶消化2min3min,弃消化液,加少量dmem培养液轻轻吹打,制成3×105/ml单个细胞悬液,种于96孔细胞培养板中,每孔0.1ml,37,5%co2,48 h,细胞贴壁后用于实验。1.2.2 hbeag和hbsag测定将chinonin配成多个浓度(从16mg/ml浓度开始倍比稀释),加于已滴有2.2.15细胞的96孔细胞板中,0.1ml/孔,每浓度4孔;设无药细胞对照组4孔及空白对照组4孔,每孔加入0.1ml 2%dm

5、em。加药培养10d后,吸取培养液于另一96孔板中,即行hbeag和hbsag测定,用酶标仪以450nm波长测定od值(了解抗原的分泌情况)。原96孔板中用mtt染色,每孔加0.4g/l mtt 0.1 ml,37 ,5% co2孵育4 h,弃上清后加dmso 0.1 ml溶解,然后以490 nm波长比色测定od值(了解细胞存活情况)。1.2.3 鸭乙肝模型的建立及给药1d龄华南麻鸭,足静脉注射dhbv阳性血清,每只0.2ml,1w后足静脉取血,检测dhbv-dna阳性者进行实验。将鸭随机分3组,模型组、chinonin高剂量组(200mg/kg灌胃)、chinonin低剂量组(100mg/k

6、g灌胃)。1.2.4 dhbv-dna检测分别在给药前及给药后5d、10d,停药后3d,用斑点杂交法检测dhbv-dna。(1)探针的标记:dhbv-dna探针标记采用缺口平移法,按promego药盒说明书稍加改动进行。(2)斑点杂交:点样:将硝酸纤维素膜用去离子水和10×ssc溶液各浸泡30min,室温晾干后点膜,40l/样,真空抽滤;变性:将膜分别置于变性液i10min,变性液ii 10 min,变性液iii 10 min,将变性后的膜室温晾干,置80烤箱中2h,烤干;预杂交:将膜置3×ssc-0.1%sds10ml中,65,30min,换10×dendhar

7、t-0.1%sds10ml中,65,4h或过夜;杂交:弃预杂交液,于杂交袋中加入杂交液,封口后42,36h48h;洗膜,用医用x线胶片,-70感光5d后显影、定影。1.2.5 计算公式及统计方法数据结果以(x±s)表示,组间均数比较采用t检验,以spss9.0统计软件处理,显著性水平=0.05。2 结果2.1 chinonin对细胞的毒性作用chinonin浓度在16mg/ml、8mg/ml时对细胞的毒性较大,破坏率均>50%,而4mg/ml时毒性明显减弱,破坏率为24.03%,且破坏率随浓度的下降而下降。经计算,chinonin的半数毒性浓度(tc50)为6.318。为排除药

8、物对hbeag、hbsag的抑制作用是由于对细胞的毒性所致,故选择tc50以下的浓度来评价药效。当chinonin浓度为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml时与细胞对照组比较均无显著差异,提示这4个浓度对细胞没有明显的毒性作用。2.2 chinonin对抗原的抑制作用chinonin在浓度为16mg/ml、8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml时对hbeag均有较好的抑制作用,与细胞对照组比较,p2.3 chinonin的治疗指数(ti)chinonin对细胞的半数毒性浓度(tc50)=6.318,抑制抗原分泌hbeag的半数有效浓度(ic50)=3.322,其治疗指数

9、(ti)=1.902。2.4 chinonin对鸭乙肝模型dhbv-dna的抑制作用鸭乙肝模型经chinonin治疗后,dhbv-dna水平均有不同程度的降低。其中chinonin高剂量组在治疗10 d后,dhbv-dna od值较模型组显著降低,p<0.05,停药3d后,即使dhbv-dnaod值有上升,但与模型组比较仍有显著差异。chinonin低剂量组dhbv-dnaod值也有降低的趋势。3 讨论本实验采用的2.2.15细胞模型及鸭乙肝模型均是研究抗肝炎病毒药物常用的方法。2.2.15细胞是乙型肝炎病毒基因组转染的人肝癌细胞hepg2系,其染色体内整合有hbv全基因,可表达乙肝病毒

10、的表面抗原(hbsag)及e抗原(hbeag),并可分泌有感染性的乙肝病毒颗粒,故2.2.15细胞常用作抗hbv药物最初的体外筛选模型。鸭乙型肝炎病毒与乙型肝炎病毒同属嗜肝病毒科,两者在毒粒形态、结构、基因组成、复制及传播方式等方面均很相似。dhbv是研究hbv复制机制及筛选抗肝炎病毒药物的常用模型。本实验结合体内外实验来观察chinonin的抗乙肝药效及作用机理,实验结果显示,chinonin对2.2.15细胞分泌的hbeag有较好的抑制作用,对dhbv-dna也有清除作用。这提示chinonin抑制抗原的分泌可能是通过抑制hbv-dna的复制和病毒的表达来起作用的。实验中ti可用来评价药物临床应用前景,其中ti>2为有效低毒,1<ti<2为低效,ti< p>此外,实验中chinonin对hbeag有较好的抑制作用,而对hbsag没有明显的抑制作用,这在一定程度上可解释临床为何hbeag的阴转较hbsag的阴转容易,这是由于两抗原的表达存在不同的调控机制,至于其具体的机制尚需进一步的研究。参考文献1骆抗先. 乙型肝炎基础和临床m. 北京:人民卫生出版社,1997:2-3.2黄华艺,钟鸣,孟刚,等. 芒果甙对大鼠血液过氧