脂肪醇聚氧乙烯醚降解菌的筛选和鉴定.doc

1、 学号： 05439112 江 苏 工 业 学 院毕业设计（论文）（2009届)题 目 脂肪醇聚氧乙醚降解菌的 筛选和鉴定 学 生 成效江 学院（系) 化学化工学院 专 业 班 级 生物工程051 校内指导教师 王利群 专业技术职务 副教授 校外指导老师 专业技术职务 二九年六月摘要脂肪醇聚氧乙烯醚降解菌的筛选和鉴定摘 要：随着现代生物技术的发展，微生物在环境保护方面的应用前景越来越广阔。本研究通过用筛选脂肪醇聚氧乙烯醚（alkyl alcohol polyoxyethylene ether, AEO）降解菌的方法，对我国工业中用量最大的非离子表面活性剂AEO进行降解特性研究。从常州市清潭污水

2、处理厂采集活性污泥，通过富集和划线培养获得两株对AEO有较强降解能力的纯培养A1和A-2。根据其形态特征、培养特征和生理生化特征等,经初步鉴定为假单胞菌属。当温度为30、pH7。0、接种量为5、AEO浓度为0.5时，培养108小时后，用KI-I2分光光度法测定其降解能力，两株菌株的降解效率均达到90%.关键词：脂肪醇聚氧乙烯醚；筛选;鉴定;生物降解Screening and identification of bacterial strains for degrading Alkyl alcohol polyoxyethylene etherAbstract： With the develop

3、ment of modern biotechnology， and more microorganism have a more and more broad range of applications in environment disposal。 In this paper， characteristics of bacteria degrading alkyl alcohol polyoxyethylene ether (AEO)， which is the most popular used nonionic surfactant in our industry，were studi

4、ed by screening screening microorganisms which could degrade AEO through slective medium for AEO。Sludge sample were collected from wastewater treatment plant in Qingtan of Changzhou。 Two strains named A1 and A2 which have the strong competence of degrading were selected from above sludge by enrichme

5、nt and purification，culture characteristics，and physiological and biochemical reactions， A-1and A-2 was identified as Pseudomonas sp. The degradation ability to AEO of two strains which I had screened was determined by spectrophotometer with KI-I2 solution at the concentration of 1%. The degration r

6、ates for AEO both reach to 90% and concentration for AEO at 500mg/L within 108 hours at 30， pH7。0，with inoculating quantity at 5。Keywords： alkyl alcohol polyoxyethylene ether(AEO)； screening; identification; biodegradation 目 录摘 要I目 录III1 前言11。1 研究背景11。2 国内外研究现状21.2。1 泡沫分离方法21。2。2膜分离法21。2。3凝处理法21。2。4

7、吸附处理法21.2.5催化氧化处理法21.2.6生物方法的现状与问题31.2.7 发展趋势复极性固定床电解法31。2。8 AEO生物降解性和降解机理41.3 研究目的和意义41.4 研究内容41.5 研究路线52 材料与方法62。1 实验仪器、药品62.1。1 主要实验仪器62。1。2 主要试剂、药品和培养基62.1.3 培养基72.2降解脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO）的菌种的分离筛选82。2.1降解AEO菌种土样的采集82.2。2制备土壤悬液82。2.3菌种的富集82.2.4菌种筛选82。2.5菌种分离纯化82。4 AEO7浓度的测定KII2法分光光度法92.4.1 AEO浓度测定原理92.4.

8、2 特征吸收波长的测定92.4。3 AEO7浓度标准曲线的绘制92。4。3 筛选菌种降解性能的测定102。5 菌种鉴定102.5。1 菌落形态102.5。2 革兰氏染色102.5。3 氧化酶实验112.5。4 过氧化氢酶试验112。5。5 淀粉水解试验112。5。6 氧化发酵试验122.5.7 吲哚试验122.5。8 甲基红试验122。5.9 乙酰甲基甲醇试验（VP试验）132。5.10 利用柠檬酸盐试验132。5。11 产H2S试验132。6 菌种保藏133。 结果与讨论143。1 菌株对AEO7降解效率143。1。1 AEO7特征吸收波长的确定143.1。2 标准曲线的绘制143。1。3降

9、解效率的比较153.1。4 降解效率的计算153.2菌种鉴定173.2.1菌落形态的观察173.2。2兰氏染色173。2。3 细菌大小的测定183.2.4 细菌生理生化试验194 结论与展望214。1 结论214.2 展望21参 考 文 献22致 谢241 前言1。1 研究背景工业废水是指工业生产过程中产生的废水、污水和废液，其中含有随水流失的工业生产用料、中间产物和产品以及生产过程中产生的污染物.随着工业的迅速发展，废水的种类和数量迅猛增加,对水体的污染也日趋广泛和严重，威胁人类的健康和安全。对于保护环境来说，工业废水的处理比城市污水的处理更为重要。工业废水的处理虽然早在19世纪末已经开始，

10、并且在随后的半个世纪进行了大量的试验研究和生产实践，但是由于许多工业废水成分复杂,性质多变,至今仍有一些技术问题没有完全解决。脂肪醇聚氧乙烯醚(alkyl alcohol polyoxyethylene ether ,AEO）是一类非离子表面活性剂的总称。是长链脂肪醇与环氧乙烷通过加成反应制得的。通式：R-O(CH2CH2O）nHR一般为不饱和的或饱和的C8C20羟烃.n环氧乙烷的加成数,也就是表面活性剂分子中氧乙烯基的数目。n越大，分子亲水基上的氧越多,与水就能形成更多的氢键,水溶性就越好，n=15时，能溶于油而不溶于水。常用于制备硫酸酯类阴离子表面活性剂的原料。n=68时能溶于水，常用于纺

11、织品的洗涤和油脂乳化剂。n=620时工业上用作乳化剂、与染剂.当R为C7-9,n=5时生成的脂肪醇聚氧乙烯醚在工业上被称作渗透剂JFC。当R为C12-18,n=1520时,生成的脂肪醇聚氧乙烯醚在工业上被称作平平加。而当R为C12时，生成的脂肪醇聚氧乙烯醚俗称AEO1。脂肪醇聚氧乙烯醚是最重要的一类非离子表面活性剂，分子中醚键不易被酸碱破坏，所以稳定性较高，水溶性较好，耐电解质，泡沫小，能生物降解，除了在印染行业大量使用外还大量适用于低泡液洗涤剂。其生物降解性与乙氧基的加成数目成反比，由于它的水溶性较好并且泡沫小，给污水处理后的出水感官上有很大的迷惑性.脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO）类非离子表面活

12、性剂是非离子表面活性剂的主要产品,包括AEO系列、JFC系列、平平加系列,它们被广泛乳化剂、分散剂、洗涤剂等1,在日常生活、工业生产中起着重要的作用。表面活性剂的用量也从1950年全球表面活性剂生物用量3500t/a增加到1990年的4.3×106t/a,而到1996年全世界表面活性剂的用量已超过了9×106t,预计到2050年其用量将达到1。8×108t2。由于AEO系列表面活性剂的生物降解性比传统的阴离子和阳离子表面活性剂的降解性要高3，所以它正在工业上的作用与日俱增.但是表面活性剂大量工业化使用后，因其不易降解性使水体、土壤受到污染,进人下水道后还经常与其他

13、有机物质如蛋白质一起产生泡沫、气味等，给工业、生活废水净化带来了相当大的问题4，5，表面活性剂对微生物、水生植物和鱼类等有毒性,长期高浓度存在会使水生环境恶化,其环境安全性逐渐引起重视6。聚氧乙烯醚类表面活性剂对水生动植物、土壤微生物的损害比较大，因此对其治理显得非常重要.1。2 国内外研究现状1.2。1 泡沫分离方法泡沫分离方法是向AEO废水中曝气，从而产生大量的气泡，使AEO吸附于气泡表面并随气泡浮升至水面，除去形成的泡沫层，从而将AEO从废水中分离.该法对AEO去除率高，工艺操作简便，运行稳定,能耗低,适用于处理较低浓度的AEO废水，但对COD的去除率不高,泡沫浓缩液经絮凝脱水后的滤渣可

14、能造成二次污染。工程实践中常采用泡沫分离塔实现泡沫分离，并常与其他技术组成组合工艺.常用的有泡沫分离一混凝法泡沫分离一生物接触氧化法等.采用煤渣吸附絮凝沉淀-泡沫分离技术的组合工艺处理AEO废水去除率可达95以上。1.2.2膜分离法超滤和纳滤技术是处理AEO废水的有效方法当废水中AEO的浓度小于其临界胶束浓度，此时AEO的分子量较小，因而适用纳滤技术处理;当AEO的浓度大于其临 界胶束浓度，此时AEO的分子量较大，则适用超滤技术。新兴的膜生物反应器技术综合了膜分离和生物处理技术的优点，目前对AEO废水的处理正处于小试阶段，今后研究的重点是与其他技术的联用以及克服膜污染问题。现已有将粉末活性炭吸

15、附与微滤技术联合，该技术可以提高AEO的去除率,缓解膜的堵塞。1。2.3混凝处理法 混凝法处理AEO废水效果理想、成本低、易操作,但降解不彻底，产生大量废渣与污泥.目前的研究集中在与其他技术的联合使用和开发出针对阴离子表面活性剂的高效的混凝剂。已报道的有用聚合硫酸铁作混凝剂，处理低、高浓度的AEO废水,出水均可达到国家排放标准 (对于高浓度的AEO废水需后续的中和泡沫分离处理）。组合工艺有微电解一混凝沉淀法，混凝沉淀冰解酸化一接触氧化法等。1.2.4吸附处理法常用的吸附剂主要包括活性炭、吸附树脂、硅藻土、高岭土等。活性炭在常温下对AEO废水处理效果理效果较好。但再生能耗大，且再生后无法完全恢复

16、吸附能力，因而限制了其应用。天然的粘土矿物类吸附剂货源充足、价廉，应用较多。为了提高吸附容量和吸附速率，对这类吸附剂研究的重点在于吸附性能、加工条件的改善和表面改性等方面.用硼泥处理表面活性剂废水,AEO的去除率达94左右，硼泥再生后对AEO去除率仍可达94%。吸附树脂处理表面活性剂废水，其吸附速率快、稳定性好、再生容易,但是预处理较繁琐,一次性投资大。未来应重点开发价廉的吸附材料，如对工业废物再利用。以CaO为改性剂的粉煤灰作为吸附剂,对表面活性剂的去除率可达95以上。1.2.5催化氧化处理法催化氧化法是对化学氧化法的改进与强化，主要有均相氧化法，光催化氧化法和多相氧化法Fenton法属均相

17、氧化法，目前研究的热点是将Fenton法与其他技术联合使用，例如混凝一Fenton工艺，超声Fenton试剂联合法。后者在最佳条件下对AEO的去除率可达80。光催化氧化法是用紫外光照射半导体催化剂，生成强氧化性的·OH自由基来氧化分解AEO，对AEO的去除率可达90%以上。该法在处理高浓度AEO模拟废水存在一个H2O2的最佳投量 （0。8mg/L），过多的H2O2投量会对AEO的降解有不利影响。目前对催化氧化法的研究热点是：（1） 发展该法与其他技术的联用，如将Fenton氧化与光催化氧化结合的TioZ一Fenton试剂光氧化法；(2) 开发价格低廉性能优越的催化剂。目前已开发出Cu

18、O/ Ni2O3、ZnO/Ni2O3、TiO2/活性炭等混合催化剂，对LAS的去除率可分别达到99.5、93.8%和80%。多相催化氧化法处理 AEO废水去除率最高可达88.3.其中光催化氧化法和多相催化氧化法都可以彻底地将AEO分解为CO2、H2O。1。2。6生物方法的现状与问题在我国,生物法是AEO废水处理的主要方法，其中活性污泥法应用最广，一般条件下AEO的去除率可达80一95。采用生物接触氧化法处理AEO废水，对 AEO的去除率可保持在93%以上。但其缺点是AEO对厌氧微生物有一定的抑制作用。另外该法需要采用不完全厌氧或其他方法进行预处理才能避免曝气时产生大量泡沫，防止降低氧的传递效率

19、。在生物法基础上发展起来的固定化细胞技术是处理AEO废水的新兴技术，其菌体稳定性、抗毒性强，适应性较高，处理效率高，可反复使用，且反应器运行时间长。目前,该技术未来研究的方向是增强固定化细胞的机械强度，并发展与其他技术的联用。对一般AEO废水效率高，处理能力大，但对高浓度的AEO废水去除率不高，且降解不彻底.未来研究的重点是发展与其他处理技术的联合使用，已报到的有混凝沉淀一水解酸化一接触氧化工艺，混凝一活性碳吸附微生物法，以絮凝床技术作为预处理的SBR工艺等,并都取得了一定的效果。1。2.7 发展趋势-复极性固定床电解法近年来人们不断研究开发AEO废水等难降解有机废水的处理技术，其中复极性固定

20、床电解法 （BPBC）这一新兴技术成为研究的热点.该法是以传统的电解法 （二维电极电解法）为基础，在二维电解槽电极间装填高阻抗粒子材料，通过主电极的电压使填料粒子感应带电，一端成为阴极，一端成为阳极，通过直接氧化作用和活性中间体的间接触氧化作用对污染物进行氧化降解。与传统的二电极相比，该法有如下特点：(1) 具有更大的电极比表面积，从而增加了催化反应的面体比,提高了污染物的解速率；（2) 增加了反应体系的紊动性，缩短了传质 （包括对流，扩散和电迁移)的距离；(3） 反应速率快，时空产率较二维可以提高两个数量级；(4） 具有吸附作用的填料能进一步显著提高污染物的去除率;（5) 以较低的电流密度获

21、得较大的电流强度，能耗显著降低。对于AEO废水的处理，复极性固定床电解法还具有如下优势:（1） 为均相催化反应提供巨大的活性中间体 (.·OH，O3，H2O2，HO2·等)的附着面积，增加了AEO与中间体接触机率，从而大大提高了AEO去除率； (2)可将LAS完全矿化;（3) 对于具有吸附作用的填料，AEO被吸附后再氧化分解，填料得以再生。这类活性剂的治理方法很多,但结合对环境的影响、经济因素、操作条件等诸多因素，生物降解法如活性污泥法、生物膜法、筛选菌种法等7,8是目前最有应用前景。生物法具有处理效率高、环境影响小、可以就地处理等优点而得到广泛的研究，并已经取得了一定的成

22、效811。1.2.8 AEO生物降解性和降解机理Balson和Felix12认为，表面活性剂的生物降解性是指在微生物的作用下，表面活性剂分子结构的破坏,转化为微生物的代谢产物或细胞浓度，并产生二氧化碳和水。完整的生物降解需要经历以下过程【1315】:第一步为初级降解（primary degradation）,表面活性剂分子结构的改变，表面活性丧失。第二步为达到环境可以接受程度的生物降解，降解产物不再导致污染。第三步为最终降解（ultimate degradation）,底物完全转化为二氧化碳和水和其他无机物,并被同化为微生物的一部分。在自然界中，AEO的生物降解如图1所示16。图1 AEO的生

23、物降解机理可以看出，AEO的生物降解先发生在烷基碳链与聚氧乙烯相连的C-O链上。在酶的作用下发生C-O链的氧化断裂生成烷基酸，进一步连续的-氧化代谢生成二氧化碳和水。以上各步变化都会使相当数量的AEO分解。因此，精确测定水样中被微生物降解前、后的浓度，其前后浓度差就是被微生物降解的AEO浓度,从而可以计算出降解率17。1.3 研究目的和意义本研究的目的是从污水处理厂的活性污泥中分离得到能够降解AEO系列的非离子表面活性剂的菌株，并把筛选到的菌株经过驯化改良重新投到污水处理厂的活性污泥中，以提高污水处理厂的处理污水的效率，提高出水质量,从而达到改善环境的目的.1。4 研究内容(1）脂肪醇聚氧乙烯

24、醚(AEO）降解菌的筛选、分离、纯化；（2）测定所筛选的菌株在正常工作环境下对AEO7的降解性能；（3）脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO）降解菌的鉴定.1.5 研究路线通过选择性培养基分离和筛选降解污水中AEO列的非离子表面活性剂的菌种,并进行鉴定。研究获得降解AEO的菌株。从菜园泥土和苗圃地中取样，先用LB液体培养基，30摇床中富集培养两次，每次富集时间16-24h，然后转接到以AEO7作为唯一碳源的无基机础培养基中，30摇床中培养35次,每次培养时间为4-5天，分离筛选出能降解AEO的菌株。然后通过在同样成分的平板上分离纯化。最后通过研究比较不同菌种AEO的效率，从而筛选出高效降解菌株.利用筛选出

25、的高效降解菌株对含有一定浓度的AEO废水进行生物处理，检验降解效果。样品采集富集培养菌种保藏菌种纯化菌株驯化降解效率测定菌株鉴定菌株筛选图2 研究路线2 材料与方法2。1 实验仪器、药品2.1。1 主要实验仪器表1 实验仪器编号名称型号产地1上皿电子天平FA1104上海精密科学仪器有限公司2手提式压力蒸气锅YXQ.SQ41.280上海华钱医用核子仪器有限公司3分光光度计722型上海精密科学仪器有限公司4隔水式恒温培养箱GNP-9160上海精宏实验设备有限公司5可调式电炉GB548885上海贺德实验设备有限公司6干燥箱101-1型上海市实验仪器厂7超净工作台SW-CJ1BU型苏净集团安泰公司8电

26、热恒温孤峰干燥箱DHG9240A型上海精宏实验设备有限公司9显微镜XSZG型上海精宏实验设备有限公司10空气浴振荡器HZQC型哈尔滨市东明医疗仪器厂2。1。2 主要试剂、药品和培养基表2 实验药品编号品名规格生产厂家1AEO7分析纯国药集团化学试剂有限公司2牛肉膏生化试剂国药集团化学试剂有限公司3蛋白胨生化试剂国药集团化学试剂有限公司4葡萄糖生化试剂国药集团化学试剂有限公司5琼脂粉生化试剂国药集团化学试剂有限公司6氯化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司7酵母膏生化试剂国药集团化学试剂有限公司8氢氧化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司9盐酸分析纯国药集团化学试剂有限公司10MgSO4·7H

27、2O分析纯上海金山区兴塔美兴化工厂11K2HPO4分析纯国药集团化学试剂有限公司12KCl分析纯国药集团化学试剂有限公司13FeSO4·7H2O分析纯国药集团化学试剂有限公司14NH4Cl分析纯国药集团化学试剂有限公司15溴麝香草酚蓝分析纯国药集团化学试剂有限公司表2 实验药品（续）编号品名规格生产厂家16NH4H2PO4分析纯国药集团化学试剂有限公司17柠檬酸三钠分析纯国药集团化学试剂有限公司18胱氨酸分析纯国药集团化学试剂有限公司19Na2SO4分析纯国药集团化学试剂有限公司20过氧化氢分析纯国药集团化学试剂有限公司21KI分析纯国药集团化学试剂有限公司22乙醇分析纯国药集团化学

28、试剂有限公司23甲基红分析纯国药集团化学试剂有限公司24亚甲基蓝分析纯国药集团化学试剂有限公司25碘分析纯国药集团化学试剂有限公司26KOH分析纯国药集团化学试剂有限公司27精密pH试纸（5。59）28醋酸铅试纸2.1.3 培养基(1)LB富集培养基蛋白胨10 g，牛肉膏 5 g，氯化钠5 g，蒸馏水 1000mL。（2）无机盐基础筛选培养基NH4Cl 3。00g， MgS04 . 7H2O 0。25 g, FeSO4.7H2O 0.005 g，K2HPO4 1.00 g， KCl 0.25 g，酵母膏 0.3 g， AEO7 0。1-0.5 g（每次筛选增加0。1 g），蒸馏水 1000mL

29、。（3）固体培养基在液体培养基的基础上加入1.52。0%的琼脂。（4）休和利夫培养基葡萄糖10 g，蛋白胨 2 g，NaCl 5 g，K2HPO4 0。2 g，水洗琼脂 5 g左右,溴麝香草酚蓝 0。03 g，蒸馏水 1000mL。(5）胰蛋白胨培养基胰蛋白胨10 g；NaCl 5 g;蒸馏水 1000mL。（6）葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖 5g，蛋白胨 5g，K2HPO4（或NaCl) 5g,蒸馏水 1000mL。（7)西蒙斯氏柠檬酸盐培养基NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0。2 g，NH4H2PO4 1 g,K2HPO4 。3H2O 1 g，柠檬酸三钠 2 g,蒸馏水 1

30、000mL。(8)蛋白胨胱氨酸培养基18蛋白胨 10 g, 胱氨酸 0.1 g,Na2SO4 0。1 g， 蒸馏水 1000mL.2.2 降解脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO）的菌种的分离筛选2.2。1降解AEO菌种土样的采集从清潭污水处理厂取活性污泥标号。再分别从菜园和梨园土壤中采集地表层以下15cm深处的土样,分别标号为、。2。2.2 制备土壤悬液取每份样品1克分别加入3个摇瓶内，加入49mL生理盐水(0.85NaCl)，放入摇床震荡20分钟，使土样充分打散，即成为102的土壤悬液。2。2.3 菌种的富集原理：富集培养是微生物学家最强有力的手段之一主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同,制订特

31、定的环境条件，使在该条件下只有目标微生物生长旺盛，从而使其在群落中数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需的微生物的特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择,如温度、pH、光照、氧气、营养等。根据以上原理，并结合本实验特点,我采用含有AEO7的LB液体培养基作为富集培养的培养基.方法：将土壤悬液静止2030分钟，吸上清1mL加入到含1AEO7 的LB液体培养基中（不需灭菌)，放在空气震荡器中30恒温培养1624小时。再取培养液1mL加入到新鲜的LB液体培养基中，同样条件培养，重复三次。2。2.4 菌种筛选初筛：吸取富集培养液1ml,加入到已灭菌的含

32、有1 AEO7的含有0.3酵母膏无机盐基础培养基,30恒温摇床培养45天后。复筛：再取初筛培养液1mL，加入到新鲜的含有2 AEO7但不加酵母膏的无机盐基础培养基，同样条件培养。如此从AEO7浓度2重复到5 。进入到菌种分离纯化阶段.2.2.5 菌种分离纯化取AEO7浓度为5的细菌培养液1mL，进行梯度浓度稀释到108。分别取各梯度浓度的稀释液500L涂布在含5AEO7的无机盐固体培养基上，30培养3天，长出单菌落。划线分离：用接种环，挑取长出的单菌落,在含5AEO7的无机盐固体培养基上划线分离,30培养3天，长出单菌落.纯化：挑取划线分离单菌落,继续划线分离，30培养，长出单菌落后，用单染色

33、法检验细菌是否为纯种菌，如果不是，继续挑取单菌落划线分离,直到检验为单菌落为止.（5）纯种检验 ：光学显微镜观察（单染色) 涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种平皿中挑出少量菌体与水滴充分混匀,涂成薄膜，涂布面积约11。5cm2。 干燥 将图片放在室温下自然干燥。 固定 手扶载玻片一段,使涂菌的一面向上，将载玻片通过微火23次，在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载玻片在火上烤，否则菌体形态会毁坏。 染色 将涂片至于水平位置,滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2分钟。 水洗 倾去染色液，斜置载玻片，用自来水的细水流由载玻片上端流下,不得直接冲在涂菌处,直洗

34、至从载玻片上流下的水中无染色液的颜色为止。 干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻的吸干，注意不要擦掉菌体。 镜检 待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，滴一滴香柏油在涂有菌体的部位，再用油镜观察。由菌株分离实验结果可以看出,纯种分离得到的菌株量较大，如果对每一菌株都作全面或精确地性能测定,工作量是很大的，而且也没必要。因此用在筛选培养基上点种的方法，通过长出的菌苔的时间的长短以及大小，以及对筛得的纯种菌进行进一步的筛选，最后选出8个菌株进入到下面的降解性能测定阶段，这样就大大缩短了实验时间，提高了筛选效率19,20。2。4 AEO7浓度的测定-KII2法分光光度法2。4.1

35、 AEO浓度测定原理碘作为一种电子受体能与聚氧乙烯型非离子表面活性剂反应形成络合物.Ross和Becher、等利用碘的这一性质测定聚氧乙烯型非离子表面活性剂的临界胶束浓度，认为碘与表面活性剂的相互反应是基于碘与表面活性剂中氧原子的诱导作用导致了电荷转移形成络合物。基于以上原理，本实验以KII2溶液为显色剂扫描显色溶液体系的可见光光谱，确定其特征吸收波长，于特征吸收波长下测定聚氧乙烯型非离子表面活性剂浓度。2。4。2 特征吸收波长的测定准确称取1g I2和2g KI，加蒸馏水溶解，定容至100mL作为KI-I2显色剂。因形成I3不太稳定,显色剂应避光保存。于10ml试管中加入10ml一定浓度的A

36、EO7溶液,再向溶液中加加入0。25ml的KII2显色剂,摇匀静置120min。然后以蒸馏水为参比用全光分光光度计进行全光扫描，检测出最大吸收波长17.2.4。3 AEO7浓度标准曲线的绘制操作步骤： 称取0。2112g AEO7加入100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL。 取10支干净的试管，分别编号为110号，用移液器向编号为19分别移取200L、400L、600L、800取两毫升上清液加入到10mL试管中，再分别向试管中加入8mL蒸馏水，L、1200L、1400L、1600L 、1800L。10号试管不加标准液。 向试管里补蒸馏水至10mL。再向每支试管里加入0。2mL浓度为1的

37、KI-I2.显色120min. 分光光度计480nm波长，以蒸馏水作参比，测定吸光值.2.4.3 筛选菌种降解性能的测定（1)前期培养在编号为19的100ml的摇瓶里装入30ml含5AEO7的无机盐基础液体培养基。灭菌后接入此前筛到得8株菌,9号瓶不接菌。包扎好,30，130rp，摇床培养108h后测定降解效率。（2）降解率的测定 经过108小时的培养，分别用移液器取培养液5mL到5mL的离心管中，在8000rpm离心10分钟。 取两毫升上清液加入到10mL试管中，再分别向试管中加入8mL蒸馏水。 分别向每支试管中加入1的KII2显色剂，显色时间为120min. 分光光度计480nm波长，以蒸

38、馏水作参比，测定吸光值。（3）降解菌的选择选择降解效率较高的两株菌，做后面的细菌生理生化试验和鉴定，以及最后的菌种保藏.2。5 菌种鉴定2.5.1 菌落形态把筛选得到的A1,和A2菌株重新接种到新鲜的LB固体培养基上,每隔一小时观察菌落生长情况，并作相关的记录。2。5。2 革兰氏染色（1）基本原理：由于不同的细菌细胞壁化学成分的不同而引起物理化学性质的差别,导致革兰氏染色反应不同。通过结晶紫初染和碘液媒染，任何细菌的细胞膜内部都可形成不溶于水的结晶紫复合物。G+细胞因壁厚肽聚糖网的层次多和结构致密，以及不含脂类等原因，故脱色，就可把类脂等原因,故脱色后，可把结晶紫复合物阻拦在细胞内，故呈紫色，

39、反之，G细菌因细胞壁薄，外膜类脂含量高，以及肽聚糖层薄且交联松散，故用脱色剂处理后，就可把类脂和结晶紫复合物溶出细胞，这种无色细胞再经番红复染，就呈红色。（2)操作步骤制片 涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种平皿中挑出少量菌体与水滴充分混匀,涂成薄膜,涂布面积约为11。5cm2。 干燥 将图片放在室温下自然干燥。 固定 手扶载玻片一段，使涂菌的一面向上，将载玻片通过微火23次，在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载玻片在火上烤，否则菌体形态会毁坏.染色 初染 与制片上滴加结晶紫染液,染1min后，用水洗去剩余染液。 媒染 滴加鲁古氏碘液,1min后水

40、洗。 脱色 滴加95的乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止，水洗。 复染 滴加石碳酸复红液复染1min，水洗。 滤纸吸干，油镜镜检。并记录细菌的大小。2。5。3 氧化酶实验（1）基本原理氧化酶在有疯子氧及细胞色素C存在时可氧化盐酸对氨基二甲基苯胺,使之呈玫瑰红到暗紫色.由此反应可知受检菌是否具有细胞色素氧化酶。（2）操作步骤 以无菌操作技术分别取两种受检菌的斜面培养物少许,点种在营养琼脂平板上，35培养1824h。 在以干净的平皿里放一张滤纸，滴上1%盐酸对氨基二甲基苯胺水溶液，仅使滤纸湿润即可，不要过湿。 用细玻璃棒刮取平板上受检菌的培养物，涂抹在湿润的滤纸上。 观察在10s内菌苔或其

41、边缘呈现红色者为阳性，1030s出现红色者为迟缓阳性，不呈现红色或30s以后呈红色均属阴性。2.5.4 过氧化氢酶试验（1)基本原理某些细菌还有过氧化氢酶，能催化过氧化氢分解产生氧气.(2）操作步骤取受检菌菌苔涂于干净的载玻片上，向菌苔上滴一滴30双氧水,有气泡产生的为过氧化氢酶阳性，否则为阴性。2。5.5 淀粉水解试验（1）基本原理淀粉是一种多糖，不能渗透到细胞内。有的细胞能产生淀粉酶，分泌到细胞外，将淀粉水解成麦芽糖后进入细胞，淀粉遇碘呈紫色；细菌水解淀粉，则菌苔周围出现无色透明圈,即可知该菌株是否分泌淀粉酶.(2）操作步骤在淀粉肉冻琼脂平板上点种所检细菌，试问培养.待菌苔明显生长后，在平

42、板面滴加碘液.菌苔周围有透明圈者为水解淀粉阳性。2。5.6 氧化发酵试验（1）基本原理细菌能以烟花或发酵方式利用葡萄糖,糖代谢的结果有酸产生（有的还产生气体）.前者产酸慢且少，后者产算量多而快.利用含含低有机氮的培养基，通过指示剂颜色变化的情况，可鉴别细菌从糖类是氧化性产酸还是发酵性产酸.由软琼脂柱中有无气体,可判断是否产气（2)操作步骤 取休和利夫森氏软琼脂培养基5支，用记号笔作好标记. 用接种针以无菌操作分别取两种受检菌的菌苔少许，在软琼脂中作穿刺接种，注意接种不要碰到试管底。各接种两只，一支作对照。 在3037温箱培养1218h后观察结果。若培养基变色从表面开始向下扩散，属于氧化产酸；培

43、养基变色自下往上发生，则属于发酵产酸.若24h已全部变黄，即使从上往下开始变色，也可能是发酵,这是应用封油管检查.2。5.7 吲哚试验（1)基本原理有些细菌能能分解胰蛋白胨中色氨酸产生吲哚。吲哚与Kovac氏试剂中对二甲基氨基苯甲醛作用，形成红色的玫瑰吲哚.（2)操作步骤 取胰蛋白胨水培养基试管5支,将两种菌各接种两支，剩下的做对照，作好标记。 3037温箱培养24h。 取出培养物，沿管壁缓缓加入Kovac氏试剂，使在培养液表面厚35mm.在两液体界面或界面以上呈现红色,为阳性反应。若呈色不明显，可加45滴乙醚并摇动，使乙醚分散于培养液中，然后径直片刻，待乙醚浮至页面后,再沿管壁缓缓加入试剂，

44、观察结果。2。5。8 甲基红试验(1）基本原理某些细菌在降解葡萄糖的过程中产生丙酮酸，后者进而分解产生甲酸、乙酸和乳酸等多种有机酸，使pH显著下降，可降至4.2以下，滴加甲基红指示剂后培养液由黄色转变为红色。(2）操纵步骤 受检菌各接种2支葡萄糖蛋白胨水培养基，另取1支培养基试管，不接种作对照。 37温箱培养27d。 取培养液0.5ml左右,至于白色磁盘小窝内，加一滴甲基红指示剂,呈红色为甲基红阳性。2.5.9 乙酰甲基甲醇试验(V-P试验)（1)基本原理有些细菌能将糖嗲写过程中产生的丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇。后者在碱性条件下与空气中氧气起作用生成二乙酰，二乙酰与肌酸或胍基化合物作用生成红色

45、化合物，即V-P反应阳性。试剂加入少量萘酚可使反应加速，呈色明显.（2）操作步骤 接种、培养同甲基红试验。 取1ml培养液，注入一支试管内，加0。6ml-萘酚液，再加入0。2mlKOH溶液，用力振荡. 室温或温箱内静置30min后观察,培养液呈红色或粉红色为阳性反应。2。5.10 利用柠檬酸盐试验（1）基本原理有些细菌能利用柠檬酸钠作为碳源，柠檬酸钠分解后产生碱性化合物，使培养基呈碱性，培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变成蓝色。（2）操作步骤用接种环挑取受检菌，划线接种于西蒙氏柠檬酸盐斜面上并穿刺，置于3037温箱培养27d。接种菌在斜面上或沿穿刺生长,培养基变为深蓝色者为阳性，不能利用者培

46、养基仍为绿色。2.5.11 产H2S试验（1)基本原理许多细菌能分解有机硫化物产生H2S,H2S遇铅盐形成黑色的硫化铅沉淀物。（2）操作步骤将受检细菌接种于蛋白胨胱氨酸培养基内，用无菌镊子夹取一条醋酸铅滤纸,借助棉塞悬于培养基液面上,不接触液面.每个菌株两个重复，同时作不解中对照，适温培养.与接种后2d、7d、14d观察，纸条变黑者为阳性,不变色者为阴性。2。6 菌种保藏本实验采用悬液菌种保藏法。取新鲜的菌悬液0.7mL加入到1mL的螺口管，然后再加入0。3mL的无菌甘油。在管身注明菌种名、保存日期以及菌种的作用。放在冰箱冷冻层保藏18.3。 结果与讨论3。1 菌株对AEO7降解效率3.1.1

47、 AEO7特征吸收波长的确定配制一定浓度的AEO7溶液,取10mL加入10mL的试管内，向其加入0.25mL显色剂，放置120min后，用全光分光光度计扫描最大吸收波长，其结果如图3所示。图3 AEO7特征吸收波长图谱由图4可知AEO7的特征吸收波长为478nm、480nm、482nm。所以本实验采取中间值480nm做为AEO7的特征吸收波长.3.1。2 标准曲线的绘制经过稀释处理，在480nm处，19试管的标准浓度的AEO7的吸光值（表3）.表3 标准浓度的AEO7的吸光值试管编号AEO7标准液浓度（mg/L）吸光值(经过换算处理）142.240.498284.480.5103126。720

48、.5214168.960.5315211.200.5436253。440。5527295。680。5678337.920.5799380.160。5891000.4863。1。3降解效率的比较经过108小时的培养,对培养液中残余的AEO7用KII2分光光度法进行检测。其测定结果见表4。表4 经108h的培养液的吸光值培养液编号吸光值（经过换算）10.50920。47830.49140.52150.49760。50270.49880。48490.615注：菌液经过离心分离处理。经过对表4培养液吸光值的分析，得出编号为2和8的菌株对AEO7降解效率相对比较高.分别对它们重新编号为A-1、A-2。3

49、。1.4 降解效率的计算3.1.4.1 数量关系的建立由表3的数据，和图4标准曲线可知，AEO7的浓度与溶液的吸光值基本呈线性关系，所以利用这个关系，可以很容易得出经降解后培养液残余的AEO7的浓度。 （1）式中：i，j是表3中试管的编号; Ai，Aj是表3对应的试管编号的吸光值; T是表3对应试管编号AEO7浓度差。当AmA0时，Nm= （21）当Am<A0时,Nm=42。24+ （2-2）式中：n是表4中试管编号； D是公式（1）中算出的常数,mg/L； Am是表4中与m对应的溶液的吸光值； A0是表3中作对比的10号试管溶液的吸光值； Nm是表4中与m对应的溶液AEO7的浓度，mg

50、/L.Wm=×100% （3）式中:Wm是与m对应的编号的菌株的降解效率； Nm是表4中与m对应的溶液AEO7的浓度，mg/L； N9是表4中作对照的溶液AEO7的浓度，mg/L。3。1。4.2 降解效率的计算由公式（1）算出D：=0.011 mg/L由公式（2）算出Nm：N9=(0.615-0。486)×=495。4mg/LA-1菌株的经108h培养的降解效率：N2=42。24+（=42。24+（0.484-0。486)× =11。52 mg/LW2=×100=97。67A-2菌株的经108h培养的降解效率:N8=42。24+（=42.24+(0。47

51、80.486）× =34。56 mg/LWm=×100%=93.02%3。2菌种鉴定3。2。1菌落形态的观察用划线法，在30，pH为7.0培养12h获得单菌菌落的形态特征，如图5所示表5 菌落的形态鉴定项目鉴定结果形状圆形、略凸起边缘边缘整齐、光滑透明度半透明菌落颜色淡黄色表面光滑、油腻生长速度较快湿润程度湿润3。2。2 革兰氏染色对筛选得到的A-1,A2菌株进行革兰氏染色，其结果均为G杆菌(图4，图5）。图4 A1菌株革兰氏染色图5 A2菌株革兰氏染色3。2。3 细菌大小的测定在显微镜的目镜里加入镜台测微尺，在油镜下观并记录细菌的大小（表6、7）表6 A1菌体大小的测定编

52、号长（m）宽（m）11。20。621。40。631。10。541。10.651。30。661。40.671.40。681。20。591。50。6101。30。6均值1。30.6表7 A2菌体大小的测定编号长(m）宽（m)11。70。621.90。631.70。541。80。651.60.761。90.671。90。681。70.591.90。5101。60。6均值1.80。63.2.4 细菌生理生化试验3.2。4。1 实验现象（1)氧化酶实验：AI菌株不能让1%盐酸对氨基二甲苯苄胺溶液变色，但是A2菌株可以.（2）过氧化氢酶试验:两株菌都能使过氧化氢产生气泡。(3)淀粉水解实验：经过三天的培养，加入碘液，两株菌菌苔周围显示紫色,没有明显的透明圈。（4)葡萄糖氧化发酵实验：经过一周的培养,两株菌的培养基都是从上往下变色，并且没有完全变色。（5)甲基红试验：经过三天的培养,菌液不能使甲基红变为红色。(6)V-P试验：经过三天培养，向菌液中加入萘酚和KOH,颜色只是稍微变黄,并没有变为红色或粉红色。（7)产H2S试验：在培养到第三天,所有醋酸