橡胶树抗逆相关WRKY转录因子的克隆与功能鉴定

1、橡胶树抗逆相关WRKY专录因子的克隆与功能鉴定我国属于非传统植胶区 , 低温和干旱是影响我国橡胶树地理分布和天然橡胶 产量的主要因素 , 因此, 培育高产抗低温干旱的优良品种对我国橡胶事业发展意 义重大。由于橡胶树是多年生木本植物 , 常规育种周期长 ,分子生物学和组织培养 技术及基因工程技术的发展为橡胶品种改良创造了条件。WRK转录因子是近二十年来在植物中发现的一类转录因子 ,它主要参与调 控植物的生长发育 , 以及各种生物和非生物胁迫的响应。病原菌侵染、创伤、各 种非生物胁迫 （如干旱、低温、高盐、高渗透压等 ）和植物信号类物质 （如水杨酸、 茉莉酸、乙烯、脱落酸等）都能诱导WRK基因的表

2、达。本研究以低温处理的热研 7-33-97 为材料,基于本实验构建的橡胶树 cDNA 文库中WRK基因的EST片段，通过RACE技术，获得了 4个HbWRK基因，分别命名 为HbWRKY1HbWRKY2HbWRKY3HbWRKY4寸其生物学功能进行了研究；并构建 植物表达载体 , 应用农杆菌介导法转化橡胶树愈伤组织。其主要结果如下： 1、 HbWRK基因的克隆本研究通过 RACE技术,共获得了 4个HbWRK转录因子基因， 其中HbWRKY基因DNA序列全长3780bp,由四个外显子和三个内含子组成,包含 一个2211bp的开放阅读框,编码737个氨基酸组成的多肽,含有两个WRKYGQK 构域

3、和两个C2H2锌指结构,属于WRK基因家族第I类。研究发现,HbWRK丫在不同的组织中都存在两种编码框,分别命名为 HbWRKYI和 HbWRKYIb虽然它们编码的肽段长度相同，但结构上有75个氨基酸 存在差异。HbWRKY理论等电点为6.05,蛋白质的分子量为79.70389KD,HbWRKY理论等电点为5.83,蛋白质的分子量为79.6026KD。HbWRKY基因DNA序列全长2273bp, 由六个外显子和五个内含子组成,包含一个1773bp的开放阅读框,所编码的肽段 由 590个氨基酸组成的多肽 , 理论等电点为 6.36, 蛋白质的分子量为 63.9419KD, 含有一个保守的 WRK

4、YGQ结构域和一个C2H2锌指结构,属于WRK基因家族第U 类中的第U b亚类。HbWRKY基因DNA序列全长1255bp,由三个外显子和两个内含子组成,包含个 963bp的开放阅读框。所编码的肽段由 320个氨基酸组成,理论等电点为4.80, 蛋白质的分子量为36.152KD,含有一个保守的WRKYG结K勾域和一个C2H2锌指 结构,属于WRK基因家族第U类中第U e亚类。HbWRKY基因DNA序列全长1009bp,由三个外显子和两个内含子组成，包含一 个789bp的开放阅读框架，编码262个氨基酸组成的多肽，理论等电点为8.51,蛋 白质的分子量为28.8086KD,含有一个保守的 WRK

5、YG结K勾域和一个C2H2锌指结 构，属于WRK基因家族第U大类中的第U a亚类。2、HbWRK基因启动子区域的 克隆与分析对克隆得到的4个HbWRKS因进行启动子克隆并分析，其主要结果如 下：其中HbWRKY基因扩增获得2319bp的启动子序列，该调控区含有 W-BOX响 应高温胁迫和茉莉酸甲酯(MeJA)等多种顺式作用元件；HbWRKY基因扩增获得 1276bp的启动子调控区，该调控区含有 W-BOX向应高温(HSE)和水杨酸 (TCA-element)等多种顺式元件；HbWRKY基因扩增获得1068bp的启动子调控区， 该调控区含有 W-BOX伤害响应元件(WUN motif)、低温响应

6、元件(LTRE)、脱落 酸响应元件(ABRE)等多种顺式作用元件；HbWRKY基因扩增获得708bp的启动子 调控区，该调控区含有 W-BOX脱落酸响应元件(ABRE)、低温响应元件(LTRE)等 多种顺式元件。3、HbWRK基因的功能分析4个HbWRK转录因子在橡胶树花中的表达量最 高。HbWRKY基因在各种非生物胁迫下表达水平变化不大,但受低温和ABA的诱 导。HbWRKY基因在叶片中响应干旱、PEG低温胁迫以及受SA的早期诱导表达； 在树皮中响应高盐、低温胁迫以及受 ET的诱导表达。HbWRKY基因在叶片中响 应PEG高盐、低温胁迫,以及受MeJA SA ABA H2O2和ET的诱导表达

7、,在树 皮中响应干旱、PEG低温胁迫以及受 MeJA SA(?) 口 ET的诱导表达；HbWRKY4 基因在叶片中响应干旱、 PEG低温胁迫以及受 MeJA SA ABA H2O2口 ET 的早期应答反应，在树皮中响应NaCI、低温胁迫以及受ET诱导表达,且低温胁迫 强烈诱导其表达。HbWRKY超表达增强了拟南芥植株的耐旱性；在高盐胁迫下,HbWRKY超表达 拟南芥植株提高了拟南芥下游基因 AtRD22和AtRD29A的表达水平，增强了植株的 耐盐能力；在SA的诱导下,HbWRKY超表达强烈提高了 AtNPR1和 AtPR1的表达 水平,在MeJAB导下,HbWRKY超表达强烈诱导了 AtLO

8、X2基因的表达以响应 MeJA 信号途径,说明HbWRKY可能参与SA和 JA信号途径，与植物病原菌的防卫有关； 在乙烯诱导下,HbWRKY超表达抑制了拟南芥乙烯相关基因 AtETR1 和 AtERSl的 表达；在低温胁迫下,HbWRKY超表达拟南芥植株的脯氨酸和可溶性糖含量高于 野生型植株,同时提高了下游基因AtRD29A AtCOR15A和AtCOR47勺表达水平。 HbWRKY超表达增强了植株的耐旱能力；在乙烯诱导下,HbWRKY超表达拟南芥植 株AtERS1和AtETR1基因的表达水平急剧增高。HbWRKY超表达增强了拟南芥植株的耐旱性；在高盐胁迫下，HbWRKY超表达 拟南芥植株提高

9、了拟南芥下游基因 AtRD22和AtRD29A的表达水平,增强了植株的耐盐能力：在乙烯诱导下,HbWRK丫超表达抑制了拟南芥乙烯相关基因 AtETR1和AtERSI的表达；低温胁迫下，HbWRKY超表达拟南芥植株提高了 AtC0R15A和AtC0R4；基因的表达水平。4、橡胶树遗传转化以EHA105工程菌株，pCAMBIA2301 为植物表达载体,将橡胶树HbWRKY通过农杆菌介导转化橡胶树热研 7-33-97和 热研 8-79 胚性愈伤组织 , 以 uidA 基因的稳定表达频率为指标研究共培养时间对 遗传转化效率的影响,结果表明热研7-33-97愈伤组织共培养5d的uidA的稳定 表达频率最高 , 热研 8-79 愈伤组织共培养 6d 的 uidA 的稳定表达频率最高。通过Kan筛选,各获得4个热研7-33-97和热研8-79抗性愈伤组织系,经GUS 组织化学染色和PCR检测,都为转化愈伤组织系。以GV3101为工程菌株,以bar 基因为筛选基因,双丙氨磷为筛选剂，通过根癌农杆菌介导将橡胶树 HbWRKY基 因转化橡胶树热研 8-79 愈伤组织。结果表明双丙氨磷筛选橡胶树愈伤组织的适宜浓度为3mg/L。研究