实验二细菌的简单染色与革兰氏染色实用教案

1、一、目的一、目的(md)要求要求1、巩固显微镜的使用方法、巩固显微镜的使用方法(fngf)；2、掌握细菌的简单染色和革兰氏染色的原、掌握细菌的简单染色和革兰氏染色的原 理和方法理和方法(fngf)。第1页/共20页第一页，共20页。二、基本原理二、基本原理第2页/共20页第二页，共20页。 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。 碱性染料的离子(lz)带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美兰、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。 酸性染料的离子(lz)带负电荷，能与带正电荷的

2、物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。 中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美兰、伊红天青等。第3页/共20页第三页，共20页。简单染色简单染色(rns)法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色(rns)不能辨别细菌细胞的构造。不能辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色革兰氏染色(rns)法是法是1884年由丹麦病理学家年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色所创立的。革兰氏染色(rns)法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性

3、菌（G+）和革兰氏阴性菌（）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色(rns)法。该染色法。该染色(rns)法所以能法所以能将细菌分为将细菌分为G+菌和菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。第4页/共20页第四页，共20页。革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分(chng fn)比较比较成分成分 占细胞壁干重占细胞壁干重(n zhn)(n zhn)的的% % 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌肽聚糖肽聚糖 含量很高（含量很高（50-9050-

4、90） 含量很低（含量很低（1010）磷壁酸磷壁酸 含量较高（含量较高（5050） 无无类脂质类脂质 一般无（一般无（ 2 2） 含量较高（含量较高（2020）蛋白质蛋白质 无无 含量较高含量较高第5页/共20页第五页，共20页。v G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇菌的细胞壁中含有较多易被乙醇(y chn)溶解的类脂质，而且肽聚糖层溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇较薄、交联度低，故用乙醇(y chn)或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果

5、细菌就被脱色，再经沙黄复染后就成红色。再经沙黄复染后就成红色。v G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。第6页/共20页第六页，共20页。三、实验三、实验(shyn)器材器材1、材料、材料 培养培养12-16h的枯草杆菌（的枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养），培养24小时的大肠杆菌小时的大肠杆菌(d chn n jn)（Escherichia coli）2、染色

6、液和试剂、染色液和试剂 草酸铵结晶紫、碘液、草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、乙醇、沙黄、二甲苯、香柏油沙黄、二甲苯、香柏油3、器材、器材 废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。酒精灯、擦镜纸、显微镜等。第7页/共20页第七页，共20页。四、实验方法四、实验方法(fngf)及步骤及步骤1、简单染色、简单染色（1）涂片）涂片 取干净取干净(gnjng)载玻片一块，在载玻载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂枯草杆菌，右边涂大肠杆菌，菌涂片，左边涂枯草杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓

7、菌液。再取干净做成浓菌液。再取干净(gnjng)载玻片一块将载玻片一块将刚制成的枯草杆菌液挑刚制成的枯草杆菌液挑2-3环涂在左边制成薄的环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。注意取菌不要太多。第8页/共20页第八页，共20页。第9页/共20页第九页，共20页。（2）晾干）晾干 让涂片自然让涂片自然(zrn)晾干或者在酒精灯火焰上晾干或者在酒精灯火焰上方文方文 火烘干。火烘干。（3）固定）固定 手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰手执玻片一

8、端，让菌膜朝上，通过火焰2-3 次固定（以不烫手为宜）。次固定（以不烫手为宜）。（4）染色）染色 将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上， 加沙黄染色加沙黄染色1-2min。（5）水洗）水洗 用水洗去涂片上的染色液。用水洗去涂片上的染色液。（6）干燥）干燥 将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸 吸干。吸干。（7）镜检）镜检 先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的 视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏 油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观油一滴，将油镜头浸入油

9、滴中仔细调焦观 察细菌的形态。察细菌的形态。第10页/共20页第十页，共20页。涂片涂片(t pin)干燥干燥(gnzo)固定固定(gdng)染色染色水洗水洗镜检镜检简单染色方法简单染色方法干燥干燥第11页/共20页第十一页，共20页。2、革兰氏染色、革兰氏染色(rns)（1）涂片）涂片(t pin) 与简单染色涂片与简单染色涂片(t pin)相同；相同；（2）晾干）晾干 与简单染色法相同；与简单染色法相同；（3）固定）固定 与简单染色法相同；与简单染色法相同；（4）初染）初染 将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结

10、晶紫染色液染色染色液染色1min；（5）水洗）水洗 倾去染色液，用水小心地冲洗；倾去染色液，用水小心地冲洗；第12页/共20页第十二页，共20页。（6）媒染）媒染 滴加碘液，媒染滴加碘液，媒染1min；（7）水洗）水洗 用水洗去碘液；用水洗去碘液；（8）脱色）脱色 将玻片倾斜，连续滴加将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色乙醇脱色2 0-25s至流出液无色，立即水洗；至流出液无色，立即水洗；（9）复染）复染 滴加沙黄复染滴加沙黄复染5min；（10）水洗）水洗 用水洗去涂片上的沙黄染色用水洗去涂片上的沙黄染色(rns)液；液；（11）晾干）晾干 将染好的涂片放空气中晾干或者用吸将染好的涂片放空气中

11、晾干或者用吸 水纸吸干；水纸吸干；（12）镜检）镜检 镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油 镜 观 察 ， 并 判 断 菌 体 的 革 兰 氏 染 色镜 观 察 ， 并 判 断 菌 体 的 革 兰 氏 染 色(rns)反应反应 性。性。第13页/共20页第十三页，共20页。第14页/共20页第十四页，共20页。五五 注意事项注意事项1、革兰氏染色成败的关键、革兰氏染色成败的关键(gunjin)是酒精脱色。是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会阴性菌；如脱色时间过短，革兰

12、氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定，需要多加练习；格规定，需要多加练习；2、选用幼龄的细菌。、选用幼龄的细菌。G+菌培养菌培养12h-16h，E.coli培养培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。第15页/共20页第十五页，共20页。六六 思考题及作业题思考题及作业题1、当对未知菌进行革兰氏染色时，如何保证操作正确及结果、当对未知菌进行革兰氏染色时，如何保证操作正确及结果(ji gu)可靠？可靠？ 2、简述革兰氏染色的原理和