组织化学技术4-酶组化ppt课件

1、 酶 组 织 化 学 E n z y m e Histochemistry是利用组织细胞内酶具有催化某种反响的特性来检测酶活性。普通是用冻结或固定的切片，再一定条件下具有酶的底物等全酶进展催化作用，产生一种可见产物，沉淀在酶所在的部位，最终经过显微镜对酶的活性进展定位或定量研讨。 第二章第二章 酶组织化学酶组织化学1 特点： 在原位检测 检测酶的活性而不是酶分子本身酶的分类：按生物化学分类六大类 氧化复原酶 转移酶 水解酶 裂解酶 异构酶 衔接酶常用检测方法1沉淀法 金属沉淀法：Ca+Co+法；Pb法 偶联法：重氮盐法 靛原法 四唑盐法22后偶联法Post-couplingACP3合成法4底物

2、膜法 设计半透膜 切片/ 孵育法 影响酶组化实验的关键要素 酶活性的保管a固定：酶组化的固定剂有教严厉的限制，不 同的酶适用不同的固定剂 抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金 属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。 慎用醛 3b取材：快捷，实验预备充分。冰结切片应先备液氮防止酶活性丧失。横冷箱切片稍固定丙酮 氯仿=1 14，510分钟，但脂溶性蛋白零落。 底物浓度 A量要足够1 20 V/ V B孵育法只能用一次，配制 时要适量节省 PH和浸透压 应以缓冲液调理 温度控制与时间：室温3740min 4510min4 捕获剂 亦要求一定浓度，要以反响原位瞬 时沉淀。 激活剂与抑制剂对照a两者的选择

3、都应具有特异性。b要有适当的浓度范围 时间：经过实验自行探求。任何配方都是一 个很大的范围指时间，受多种因 素的影响，因药品的质量、环境要素 的变化而变化。故不可轻信之。 分散：控制反响速度，防止分散冰冻 切片孵育尤应留意5 对照：必需设立对照，以防非特异反响。 这对结果的解释非常重要。 对结果的分析，应思索如下几个问题：经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶终究 能保管多少？酶能否在原位？反响中多少酶起了作用？酶的活性能否代表细胞生活时的活性？沉淀的产物能否代表酶蛋白分子，时间延 长，会不会改动？能否有分散移位6 一、钙钴法显示碱性磷酸酶 Alkaline Phosphatase ALP原理以天然

4、存在的原理以天然存在的甘油磷酸甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立刻被钙离子沉淀为立刻被钙离子沉淀为 磷酸钙，再依磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化钴沉淀。反响式产物为黑色的硫化钴沉淀。反响式如下：如下：7方法方法标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片载片标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片载片 厚厚6微米。微米。固定：丙酮固定：丙酮 氯仿氯仿1 1混合液。混合液。4 25切片标本入以下孵育液中，切片标本入以下孵育液中，37，5分钟分钟 孵育液：孵育液： 3甘油磷酸钠甘油磷酸钠 6ml 底物底物 保保 2巴比妥钠巴比

5、妥钠 6ml 调调PH 证证 2氯化钙无水氯化钙无水 9ml 沉淀剂沉淀剂 新新 2硫酸镁硫酸镁 6ml 激活剂激活剂 鲜鲜 蒸馏水蒸馏水 3ml 30ml 将孵育液混匀，假设浑浊可过滤，调将孵育液混匀，假设浑浊可过滤，调PH至至9.4。 流水流水洗2分钟后入蒸馏水 入2硝酸钴，5分钟小肠可3分钟 置换 流水洗5分钟，入蒸馏水。 入0.5硫化胺，2分钟。 置换 流水洗10分钟，入蒸馏水。 入Mayer氏苏木精染液(复染核)1分钟 流水洗5分钟蒸馏水。 甘油明胶或Apathy糖胶封固。 结果：肾小体近端小管刷状缘、小肠结果：肾小体近端小管刷状缘、小肠绒毛绒毛 纹状缘和纹状缘和 血管内皮出现黑色的

6、硫化血管内皮出现黑色的硫化钴沉钴沉 淀，显示淀，显示ALP活性强活性强 。 ALP为一种膜酶，广泛存在于肾小管、为一种膜酶，广泛存在于肾小管、小肠小肠 绒毛、膀胱、肾上腺、包曼氏囊、肝、绒毛、膀胱、肾上腺、包曼氏囊、肝、脾、脾、 乳腺及乳腺及 卵巢等细胞膜，与细胞的吸收卵巢等细胞膜，与细胞的吸收有关。有关。对照对照 无底物孵育，以蒸馏水替代孵育液中无底物孵育，以蒸馏水替代孵育液中的的3 甘油磷酸钠，其他各步进展同上。甘油磷酸钠，其他各步进展同上。 加热灭活酶活性。 加抑制剂，左旋咪唑0.11.0mmol/L本卷须知Ca2+要足量 硫化钠NH4S 配置成淡黄色，可提供 S2-滴23滴 用水将钴离

7、子洗净，以防止出现假阳性。 有些组织中有色素含铁血黄素、黑色 素出现，可影响结果。 本法可用显示：5核苷酸酶、肌蛋白 ATPase、ALP 二、铅法显示酸性磷酸酶 Gomori，1950 Lojda，1979原理原理 以以甘油磷酸钠为底物，在酸性甘油磷酸钠为底物，在酸性PH下，被下，被ACP水解，释放出磷酸盐，水解，释放出磷酸盐，遇铅离子那么生成磷酸铅沉淀。在被遇铅离子那么生成磷酸铅沉淀。在被S2-置换，最终生成硫酸铅棕色沉淀。置换，最终生成硫酸铅棕色沉淀。反响式如下：反响式如下： 酸性磷酸酶酸性磷酸酶Acid PhosphatasACP ACP的特性 PH 4.55.5适宜 激活剂：Mn2+

8、 抑制剂：NaF，有些ACP为Cu2+、酒石 酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。ACP定位 溶酶体颗粒状内； 溶酶体外ACP存在于ER和胞液。 该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、 肾上腺。方法方法标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片载片，厚标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片载片，厚6 微米。微米。固定：冰冻片或横冷箱切片。冻融，有时也可固定：冰冻片或横冷箱切片。冻融，有时也可 用甲醛，但影响活性。用甲醛，但影响活性。 本实验不固定或固定于丙酮本实验不固定或固定于丙酮 氯仿氯仿1 1 混合液，混合液，4，25min步骤：步骤： 将标本放于以下孵育液中将标本放于以下孵育液中 37， 1015 孵育液：孵育液：0.1M

9、醋酸缓冲液，醋酸缓冲液，PH5.2 15ml 0.24硝酸铅硝酸铅 15ml 3甘油磷酸钠 3ml 33ml 混匀，置37水浴中1530分钟后，过滤。 于37蒸馏水中洗2次，每次1分钟。温 蒸馏水洗 入5硫化胺，12分钟。 流水冲洗35分钟后，换蒸馏水。 可用Mayer苏木素复染核 用甘油明胶或Apathy氏糖胶封固。结果酶活性部位结果酶活性部位棕黑色硫化铅沉淀。棕黑色硫化铅沉淀。 分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细 胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒。胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒。对照孵育液内加对照孵育液内加0.01M NaF13.9mg / 33ml 本卷须知本卷须

10、知 铅离子的浓度铅离子的浓度 关键问题，没有底物，有关键问题，没有底物，有 些组织吸附铅离子些组织吸附铅离子+，因此必需用，因此必需用NaF 抑制酶活性抑制酶活性排除假阳性反响。排除假阳性反响。 孵育时间不可过长，否那么染色分散或核染孵育时间不可过长，否那么染色分散或核染色。色。运用范围运用范围 “铅法适用于：铅法适用于：ACP，5-核苷核苷酸酶酸酶G6P酶酶; 膜膜ATPase MitoATPase TTPase硫胺素焦磷酸酶硫胺素焦磷酸酶 三、偶氮偶联法显示三、偶氮偶联法显示ACP原理原理 以奈酚的衍生物磷酸脂以奈酚的衍生物磷酸脂Naphthol ASBL Phosphate为底物，在为底

11、物，在酸性酸性PH5.2下，经酸性磷酸酶水解下，经酸性磷酸酶水解释放出释放出Naphol ASBI，立刻与六氮化，立刻与六氮化对品红偶联，生成红色偶氮染料，用以对品红偶联，生成红色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。代表酸性磷酸酶活性。方法方法标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片载片，标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片载片，厚厚 6 微米。微米。 不固定或固定于丙酮不固定或固定于丙酮 氯仿氯仿1 1混混 合液内，合液内，4 ，25min 标本入以下孵育液，标本入以下孵育液，37，3060分分钟。钟。 孵育液：磷酸奈酚孵育液：磷酸奈酚ASBI 15 mg 溶于二甲基亚砜溶于二甲基亚砜 0.6 ml 六氮化对品红

12、六氮化对品红 缓冲液缓冲液 30 ml 30.6 ml 充分混匀并过滤 蒸馏水洗 入Mayer苏木精内染1分钟。 流水冲5分钟后入蒸馏水。 用Apathy糖胶或甘油明胶封固。结果 酶的活性部位呈红色，核兰色。 分布于肾近端小管核周，肝毛细 胆管周围。 ACP是溶酶体的标志酶。 六氮化对品红液的配制30ml 4对品红盐酸溶液 碱性品红 400mg 浓盐酸 2 ml 蒸馏水 8ml 4NaNO3配好后于冰箱保管用时取1ml。+ 等量混匀各取1ml，盖严并置室 温静止一分钟，待混合液变为淡黄色 倒入28ml 2.72醋酸钠溶液，用1N NaOH调PH至5 5.5即成。 四、四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶对

13、照用抑制剂对照用抑制剂NaF浓度为浓度为10mmol/L Ca2+ 浓度为浓度为10mmol/L本卷须知本卷须知 六氮盐浓度不能太高六氮盐浓度不能太高 背景会略带黄色背景会略带黄色运用范围运用范围 本法用于本法用于ALP、ACP、非特非特 异性脂酶。异性脂酶。原理利用原理利用 利用利用H受体的受体的H2，使四，使四唑还唑还 原成甲原成甲 月替月替 ：反响式：反响式如下：如下：本实验：以琥珀酸钠盐为底物，在酶的本实验：以琥珀酸钠盐为底物，在酶的作作 用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑nitro BT为受为受H体，其接受体，其接受H后被复原成甲月后被复原成甲月替替 呈紫色

14、以代表琥珀酸脱氢酶的活性。呈紫色以代表琥珀酸脱氢酶的活性。 琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。 抑制物：丙二酸盐竞争抑制，磷酸抑制物：丙二酸盐竞争抑制，磷酸 盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸 竞争抑制凡与竞争抑制凡与-SH基化合的基化合的 作用剂皆抑制其活性。作用剂皆抑制其活性。方法方法 标本：大白鼠肝、肾或心肌。横冷箱切片，后标本：大白鼠肝、肾或心肌。横冷箱切片，后 6微米不固定。微米不固定。 步骤：步骤： 将标本放入以下孵育液中，将标本放入以下孵育液中，37，约，约5分钟。分钟。 孵育液：孵育液：nitro BT 10mg 0.1MPB

15、S，PH7.8 10ml PMS吩嗪硫酸甲酯吩嗪硫酸甲酯 1mg 徐徐加温，使其溶解，冷却过滤。徐徐加温，使其溶解，冷却过滤。 再参与琥珀酸钠再参与琥珀酸钠 80mg 蒸馏水洗净蒸馏水洗净 Apathy氏液糖胶封固结果 酶活性部位成蓝紫色沉淀。此标本内 所见蓝紫色颗粒即线粒体。对照 孵育液去底物，参与等量蒸馏水，同 时孵育留意 甲月替易溶于脂，反响分散时组织内脂滴被染。 参与PMS中间递氢体定位更加准确。 假设聚乙烯醇PVA，可以维护线粒体膜，使 反响局限在线粒体内。运用范围 适用于：甲胺氧化酶、乳酸脱氢 酶、琥珀酸脱氢酶。 五五 、DAB法法 显示过氧化物酶显示过氧化物酶原理原理 过氧化物酶

16、分解过氧化物酶分解H2O2的过程的过程中，下面反响不直接发生：中，下面反响不直接发生：AH2供供氢体氢体+H2O2A供氢体的氧化物供氢体的氧化物+2H2O2实验可知，有称为复合物实验可知，有称为复合物 、的酶、的酶底物受氢体复底物受氢体复合体生成，在复合体最后分解为酶和合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所运用的供氢体显色。酶组织化学中所运用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。奈酚和联苯胺。光镜显示方法光镜显示方法1孵育液的配置：孵育液的配置： 预孵育液：预孵育液：

17、DAB 4HCL 10mg 溶于蒸馏水溶于蒸馏水 5ml 0.2M磷酸缓冲液磷酸缓冲液PH6.5 5ml Fahimi孵育液孵育液: DAB 4HCL 10ml 溶于蒸馏水溶于蒸馏水 5ml 0.2M磷酸缓冲液磷酸缓冲液PH6.57.0 5ml 0.3H2O2 0.1ml GrahamK孵育液： DAB 4HCL 5mg 0.05M TH缓冲液PH7.6 10ml 1H2O2 10ml Lojda 孵育液： 0.1N苯基对次甲苯二胺 25ml 0.1-萘酚 25ml0.3H2O2新配 1ml方法方法 固定：温度固定：温度4，30分钟分钟3戊二戊二醛固醛固 定液：定液：20戊二醛戊二醛15ml，或，或25 戊二戊二 醛醛12ml 0.2 M磷酸缓冲磷酸缓冲 液液50 ml，蒸，蒸 馏水加至馏水加至100ml止；止； 洗涤：洗涤三次以上，每次洗涤：洗涤三次以上，每次15分钟，分钟，或或 过滤。过滤。 切片：切片：Cryostat制成切片制成切片510m 染色步骤染色步骤 切片入以下孵育液中切片入以下孵育液中 a预孵液：室温下1030分钟 b后孵液： Fahim