核酸提取和注意事项-课件PPT

1、2021/8/261学 习 汇 报 核酸提取的原理及方法汇报人:富贵 青海大学2010级研究生2021/8/262前言 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中 最 重 要 、 最 基 本 的 操 作 。中 最 重 要 、 最 基 本 的 操 作 。2021/8/263v核酸简介核酸简介v基因组基因组DNA提取提取v质粒质粒DNA提取提取v真核细胞总真核细胞总RNA提取提取v琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2021/8

2、/264p 核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3，5- 磷酸磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸酸(RNA)和脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸(DNA)两类。两类。p DNA主要储存遗传信息。主要储存遗传信息。p RNA主要传递遗传信息。主要传递遗传信息。2021/8/265如何分离如何分离DNADNA？如何分离如何分离RNARNA？2021/8/266核酸简介 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 质粒主要发现于细菌、

3、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。2021/8/267v核酸简介v基因组DNA提取v质粒DNA提取v真核细胞总RNA提取2021/8/268基因组DNA提取的几种常用方法：u CTAB法u SDS法u 其他方法2021/8/269基因组DNA提取CTAB法pCTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂

4、抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。2021/8/2610基因组DNA提取CTAB法pCTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH 8.0）EDTA （pH 8.0） NaCl CTAB-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 0.4 M2% (W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液中；充分溶解

5、，存在于液中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。使酚容易去除。2021/8/2611基因组DNA提取CTAB法 CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH 8.0）EDTA （pH 8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM0.4 M3% (W/V) 5% (W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种（聚乙烯吡咯烷酮）是酚

6、的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖时它也能和多糖结合，有效去除多糖。2021/8/2612基因组DNA提取CTAB法p CTAB法实验流程植物材料植物材料 抽提抽提核酸沉淀核酸沉淀液氮研磨液氮研磨上层溶液上层溶液细胞裂解细胞裂解DNADNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤2021/8/2613基因组DNA提取SDS法pSDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度

7、并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS法适用于大部分实验材料基因组法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。组织、细胞、全血、细菌、酵母等。2021/8/2614基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳： 以琼脂糖凝胶作为支持以琼脂糖凝胶作为支持物，利用物，利用DNA分子在泳分子在泳动时的电荷效应和分子动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合筛效应，达到分离混合物的目的。物的目的。小鼠小鼠gDNA电泳图电泳图2021/8/2

8、615基因组DNA提取常见问题pDNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应p DNA降解p DNA量少2021/8/2616基因组DNA提取常见问题分析pDNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质中含有蛋白、多糖、多酚类物质 抽提纯化、高盐洗涤抽提纯化、高盐洗涤DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 重新沉淀重新沉淀DNA中残留有金属离子中残留有金属离子 重新重新70%乙醇漂洗乙醇漂洗2021/8/2617基因组DNA提取常见问题分析 DNA降解 材料不新鲜或反复冻融材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活

9、性未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，提取过程操作过于剧烈，DNA被机被机械打断械打断 外源核酸酶污染外源核酸酶污染2021/8/2618基因组DNA提取常见问题分析pDNA提取量少实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少 选取新鲜（幼嫩）材料选取新鲜（幼嫩）材料破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分 充分研磨、破壁酶、延长裂解时间充分研磨、破壁酶、延长裂解时间沉淀不完全沉淀不完全 低温、延长沉淀时间低温、延长沉淀时间洗涤使得丢失洗涤使得丢失DNA2021/8/2619v核酸简介v基因组DNA提取v质粒DNA提取v真核细胞总RNA提取v琼脂糖凝胶电泳2021/8/2620质粒DNA提取p质

10、粒DNA提取的方法：碱裂解法煮沸法2021/8/2621质粒DNA提取碱裂解法原理2021/8/2622离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理 离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的 SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。2021/8/2623质粒DNA提取及检测实验准备1.实验器材实验器材 台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、笔、电子天平、电泳设备、凝胶成像系

11、统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。2.实验耗材实验耗材 无菌无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格管、各规格Tip、一次性手套等。、一次性手套等。3.实验试剂实验试剂 质粒小提试剂盒（离心柱型，质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO) 、LB培养基、抗生素、培养基、抗生素、琼脂糖、琼脂糖、DNA Loading Buffer、 GoldView核酸染料、核酸染料、 TAE电泳缓冲液等。电泳缓冲液等。4.实验材料实验材料 对数期菌株（对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5）2021/8/2624质粒DNA提取碱裂解法组分1

12、组分2液25 mM Tris-HCl （pH 8.0）10 mM EDTA（pH 8.0 ） 液0.2 M NaOH1% SDS 液3 M KAc （pH 4.2）RNase A10 g/ml RNase A洗脱液 EB10 mM Tris-HCl （pH 8.0） 1 mM EDTA （pH 8.0 ）p碱裂解法试剂配方碱裂解法试剂配方2021/8/2625质粒DNA提取实验流程对数期菌体对数期菌体溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重悬充分重悬溶液溶液IIII裂解裂解 上清液上清液 过柱过柱干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤质粒质粒DNADNA溶液溶液2021/8/2626质粒DN

13、A提取电泳检测p琼脂糖凝胶电泳检测质粒质粒DNA的三种带型：的三种带型：1.共价闭合环状共价闭合环状DNA分子：分子：质粒双链没有断裂；超螺质粒双链没有断裂；超螺旋结构；泳动速度旋结构；泳动速度最快最快；2.半开环半开环质粒质粒DNA分子：分子：质粒的一条链断裂；松弛质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；泳动速度的环状分子；泳动速度最最慢慢；3.线性线性DNA分子：质粒的分子：质粒的两条链均断裂；泳动速度两条链均断裂；泳动速度居中居中。2021/8/2627质粒DNA提取常见问题p RNA残留p 质粒断裂p 量少2021/8/2628质粒DNA提取常见问题分析RNA残留残留忘记加忘记加RNase

14、A？I液中液中RNase A失效？失效？酶量不够？酶量不够？2021/8/2629p质粒断裂 II 液裂解时间过长？ 裂解时动作过于剧烈2021/8/2630质粒DNA提取常见问题分析p量少凝胶是否有问题？菌体量少菌体重悬不彻底裂解不完全菌株老化严谨型质粒2021/8/2631质粒类型 严谨型：严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；中只有一份或几份拷贝； 松驰型：松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进这些质粒

15、的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进行的，每个细胞中含有行的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。处理才能达到更高拷贝数。2021/8/2632v核酸简介v基因组DNA提取v质粒DNA提取v真核细胞总RNA提取v琼脂糖凝胶电泳2021/8/2633总RNA提取通用方法p异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）p 原理： 核酸在中性条件下，因磷

16、酸基解离而带负电荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA向疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有亲水性，因此向水层移动。2021/8/2634TRIzol试剂 TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为DNA和蛋白质。2021/8/2635总RNA

17、提取样本准备p植物/动物组织样本：新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或-80。为避免反复冻融，需小份分装（50100 mg/份）。p细胞样本：新鲜收集待用或加入TRIzol后 -80冻存细胞沉淀。p血液样本：新鲜血液分离出淋巴细胞，待用或加入TRIzol后 -80冻存细胞沉淀。2021/8/2636真核细胞总RNA提取实验步骤收集细胞收集细胞离心洗涤离心洗涤裂解变性裂解变性异丙醇沉淀异丙醇沉淀抽抽 提提RNARNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解p 293细胞样品为例上层溶液上层溶液2021/8/2637RNA提取常见问题p RNA降解p DNA残留p OD260 /OD280 比值偏低p 电泳带

18、型异常2021/8/2638pRNA降解外源RNase的污染裂解液质量裂解液用量不足样品本身富含RNase环境温度过高28S18S5S2021/8/2639RNA提取常见问题分析pDNA残留样本量过多吸取到中间层及下层试剂解决办法： DNA酶（RNase free）消化，再抽提纯化处理。2021/8/2640pOD260 /OD280 比值偏低蛋白污染蛋白污染/苯酚残留苯酚残留 加入氯仿后彻底混匀，并且离心分层的离心力加入氯仿后彻底混匀，并且离心分层的离心力 和和时间要足够。时间要足够。 不要吸入中间层及有机相，宁愿多损失些上清。不要吸入中间层及有机相，宁愿多损失些上清。 减少起始样品量，确保

19、裂解完全、彻底。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。 解决办法解决办法:重新抽提一次，再沉淀、溶解。重新抽提一次，再沉淀、溶解。2021/8/2641RNA提取常见问题分析p电泳带型异常上样量超过 3g 电压超过 8V/cm 电泳缓冲液陈旧 均可能导致 28S 和 18S 条带分不开2021/8/2642v核酸简介v基因组DNA提取v质粒DNA提取v真核细胞总RNA提取v琼脂糖凝胶电泳2021/8/2643DNA的琼脂糖凝胶电泳1 原理：原理： DNA分子在高于其等电点的分子在高于其等电点的pH溶液中带溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖凝胶具有分子

20、筛作用，不同分子量或分子凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子形状的核酸，其移动速度有差异。因此，形状的核酸，其移动速度有差异。因此，利用这种利用这种“电荷电荷”和和“分子筛分子筛”的双重效的双重效应，达到分离核酸的目的。应，达到分离核酸的目的。2021/8/2644DNA的琼脂糖凝胶电泳2. 琼脂糖凝胶分离DNA的范围2021/8/2645DNA的琼脂糖凝胶电泳3.DNA染料 A:EB 溴化乙锭溴化乙锭(Ethidium Bromide, EB(Ethidium Bromide, EB）可以嵌）可以嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。出红色荧光。 EBEB染料优点：染色操作简便，快速，室温下染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng10ng或或更少的更少的DNADNA即可检出；可以直接加到样品中或胶即可检出；可以直接加到样品中或胶中；价格低廉。中；价格低廉。 EBEB是诱变剂，使用时一定要戴手套。是诱变剂，使用时一定要