绿僵菌属4个生防潜力菌株的多基因鉴定

1、绿僵菌属4个生防潜力菌株的多基因鉴nr;王峰 刘斌 农向群 鲁红学 王广君 曹广春 刘少 张泽华 中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学 国家重点实验室 长江大学农学院摘要：传统的绿僵菌分类鉴定以形态特征为主要依据，其局限性使种内仍包含着复杂 的类群。dna分子鉴定使绿僵菌属、种分类更为细化和准确，对其育种、杀虫机 理、生态学等的研究非常重要。本文对绿僵菌4个有生防潜力的菌株ippmo10202. 1ppm2029、1m1330189和m200614的5个持家基因即核糖体转录间隔区序列(its1-4)、b 微管蛋白(beta-tubulin)、rna 聚合酶 ii 大亚基(rpb1)、

2、rna 聚合酶ii第二大亚基(rpb2)和翻译延伸因子(ef-la)的同源序列进行了克 隆和测序，通过构建系统发育树进行了多基因进化分析。结果表明，4个生防菌 株分别位于进化树的3个分支上，鉴定菌株ippm010202和ippm2029同属于平沙 绿僵菌 metarhizium pingshaense, 1m1330189 为蝗绿僵菌 m. acridum, m200614 属于低温绿僵菌m. frigidum,它们之间亲缘关系很近，5个基因的遗传分化距离 只有0.0211036。its 1-4序列有较高变异频率和变异幅度，分类效率优于其他 基因;ef-la序列在鉴别菌株和分析亲缘性上有优势。

3、多基因的系统进化分析能 够弥补单基因分析的局限，取得更为准确的鉴定和更为细化的分类结果。关键词：分了鉴定;多基因标识;绿僵菌;系统发育;亲缘性;作者简介：王峰，硕士研究生1 : wangfeng0925yeah. net;作者简介：农向群，研究员，e-mail :xqnongsina. com0收稿日期：2017-06-22 基金：国家自然科学基金(61661136004, 31471824)multigene identification of four potential biocontrol strains in metarhizium genuswang feng liu bin no

4、ng xiangqun lu hongxue wang guangjun cao guangchun liu shaofang zhang zehuastate key laboratory for biology of plantdiseases and insect pests/institute of plantprotection, chinese academy of agriculturalsciences; college of agriculture, yangtzeuniversity;abstract：the classical identification of meta

5、rhizium spp. is based on the morphological characteristics, which usually resuits in complex groups within a species. dna molecular identification can offer a more refined and accurate classifiedtion of the species in metcirhizium genus, which is very important for studies on breeding, insecticide m

6、echanism and ecology of the fungus. here, four potential biocontrol strains of metarhiziumippm010202, ippm2029, imi330189 and m200614 were identified by phylogenetic analysis of five ident/ified genes, i. e. , ribosomal transcribed spacer sequences (its1-4) , beta-tubulin, rna polymerase ii first, s

7、econd sub unit (rpb1 and rpb2) , and t ransla tion extension factor (ef-1a) based on the phylogenetic tree constructed from the four candidate st rains and twenty-two reference strains, the four strains were located on three branches of the phylogenetic tree. the strain tppm010202 and ippm2029 belon

8、g to m. pingshaense, imi330189 is identified as m. acridum and m200614, as m. frigidum, a species adaptivc to low temperature- they have close genetic relationship between each other, with genetic distance of 0. 0210. 036. also, the results showed that the its1-4 sequence had higher mutation frequen

9、cy and mutation range, which makes it ci superior classifiedtion gene- the eft a sequence had the advanteige in identifying the strain and analyzing genetic relationship. themultigene phylogeny can compensate for the limitations of single gene analysis, so that it can obtain a more accurate identifi

10、cation and more detailed classification.keyword：molecular identification; polygcnc marker; mctarhizium onisopliac; phylogeny; cluster analysis;received： 2017-06-22自发现绿僵菌metarhizum及其对昆虫的致病性以来，其牛物学、系统发牛和防 控作用一直广受重视。早期由于不能确定其有性世代，绿僵菌被定位为“半知真 菌”类，按照传统的形态学进行分类和鉴定，主要依据是无性分生抱子和产孑包 结构形态。按tullochlq综述的分类方法，绿僵

11、菌分为2种，即金龟子绿僵菌 m. anisopliae和黄绿绿僵菌m. flavoviride,前者含短抱变种(var. anisopliae)和长孑何变种(var. majus)。rombach等及扩展了黄绿绿僵 菌小砲变种(var. minus)。此系统被长期广泛采用，尽管匪绿僵菌m. album 有单独描述，还有作者描述新种和提出新增种类建议。由于抱子很小，形态特征 差别不易分辨和描述，使得菌株鉴别难以细致化，造成所分类的物种金龟子绿 僵菌和黄绿绿僵菌中实际包含着大量的复杂类型，可能隐含了多个物种，无法 区分亚类，菌株鉴定经常出现分歧。菌种记录一般只按照形态特征分类，标注菌 株编号和附注

12、寄主及地理来源。已记录的绿僵菌属寄主有8 b 30科200余种，不 同类群的菌株有培养特征差别和寄主毒力差别吐1。然而研究表明形态分类系 统与地理类别无关或仅有弱相关，与寄主类型基本无相关6, 7。由于难以区分 种下亚类，种内菌株变得非常庞杂无序。那些对农林害虫高毒力菌株也常常因为 不能被正确定位物种、变种或亚类，从而影响了它们进一步的特性比较和研发应 用。随着分子生物技术的发展，真菌分子分类系统正逐步建立并得到认可采纳。大多 数分子分类结果与传统形态分类系统在属、种水平上是相符的，而分子分类细化 的亲缘关系澄清了许多混淆的同物异名或异物同名菌株，确定了原来未能鉴定 的物种，显示出分了技术在真

13、菌系统分类上的细化和准确优势。rakotonirainy 等宜以核糖体28s部分序列和同工酶数据对绿僵菌进行了系统发育分析，3个 数据集都显示绿僵菌2个种金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌内部均存在分化o curran 等回分析了绿僵菌核糖体its和5.8s区的完整序列数据，得出绿僵菌金龟子绿 僵菌和黄绿绿僵菌2个独立的进化系。driver等10以核糖体its和28s r dna d3区的序列数据，对己确认为金龟了绿僵菌、黄绿绿僵菌或白色绿僵菌的123 个菌株进行了重新评估，很好地解决了绿僵菌属内种和变种水平的区分问题， 并结合随机扩增多态dna (rapd)类型和序列将变种内菌株进行区分，与产抱形 态

14、学比较，形成了 10个清晰的分支单元，即金龟子绿僵菌单列种、8个变种和1 个未确定组，其中金龟子绿僵菌单列种包含4个变种。此研究结果得到普遍认可, 但未包括几个由中国学者郭好礼等u11描述种类即平沙绿僵菌m. pingshaense q. t. chen&h. l. guo> 贵州绿僵菌 m. guizhousenseq. t. chcn&il. l. guo和戴氏绿僵菌m. taii (无性型)。由于its序列的分辨率有 限，并未能很好解决黄绿绿僵菌分化及金龟子绿僵菌短他变种和长他变种细化 问题。bischoff等12, 13采用多基因标识方法,以4个核基因ef-la、

15、rpb1、 rpb2和p-tubulin的近全编码区序列进行分析，部分菌株还结合了产孑包形态学 特征，得到了更为灵皱和鲜明的分化谱系，把复杂的金龟子绿僵菌分支到9个 终端并建议提升为种级，述描述定名了 2个新种，挽回了 1个被删除的种，确定 t 1个同物异名种。迄今，driver等10和bischoff等13的绿僵菌谱系被同 行学者普遍接受，成为菌株鉴定的重要参照。木研究前期经牛物测定，获得了 4个有牛防潜力的昆虫病原真菌菌株，并从形 态学初步鉴定属于绿僵菌。为了更好了解其系统进化地位、相互亲缘性等特征以 促进生物防治研发应用，进行了菌株的多基因鉴定亲缘关系分析，为研究生防 菌株遗传进化、提高

16、生防菌株筛选效率提供多基因分析数据，也为绿僵菌属内其 他菌株的分类鉴定提供相关标识基因序列参考。1材料与方法1. 1菌株和培养基菌株ippm010202从北京昌平摧病金龟子上分离得到，生物测定对暗黑鲍金龟 hololtrichia parallela motschulsky> 大黑鲍金龟 h. oblita （faldermann）有 高毒力。菌株ippippm2029从贵州林区土壤分离得到，牛物测定对稻水象甲li ssorhoptrus oryzqphi lus kuschel有高毒力。二者根据形态学初步鉴定为金 龟子绿僵菌。菌株m200614为2005年从美国标准生物品收藏屮心（at

17、cc）引进, 提供者定名菌株为金龟子绿僵菌无性型，分离自澳大利亚维多利亚草地红头金 龟adoryphorus coulonio菌株1m1330189系1997年从英联邦国际生物防治研 究所仃ibc）引进，当时定名为黄绿绿僵菌，后来正式更名为金龟子绿僵菌蝗 变种（var. acridum）,分离自非洲尼日尔沙漠蝗schistocerca gregaria,对 非洲沙漠蝗有高毒力。1. 2菌株抱子形态观察将菌株接种在psay培养基（每1000 m l中含200 g新鲜土豆的煮汁、20 g蔗 糖、5 g酵母提取物和18 g琼脂，自然p h）平板上，25°c培养15 do取新鲜 抱子制片，在

18、相差显微镜（日本olympus bii-2型）下观察。1.3菌株标识基因序列的检测1.3.1标识序列及引物5 个检测标识序列为 its1-4 （含 5. 8s-18s）、b -tubulin, rpb1、rpb2 和 ef-1 a 基因。检索ncbi数据库获得上述绿僵菌基因序列，参考curran等回的its1-4 引物，设计其余4基因序列引物，经优化的引物见表1。引物由上海生工生物工 程有限公司合成。表 1 菌株检测的标识序列引物 table 1 the primers of identified sequences for testing strains下载原表引物名称primer name

19、its15-tccgtaits45tcctccpbeta-f5ycctccpbeta-r5 y ac atcprpb1-f5 y aaggprpb1 -r5ccaag(prpb2-f5，_ttgtccprpb2-r5，-cgc ag(ef1f5-gcycc、efir5'-atgac71. 3. 2 dna 提取 将菌株他子悬浮液接种于液体培养基（每1000 m l中含20 g蔗糖、2 g硫酸镁、 5 g磷酸氢二钾和10 g酵母浸出粉，p h 6'7）,接种量为5x10砲子/100 m l 培养基，于25°c> 180r/min摇床上培养60 h,经抽滤、洗涤、挤

20、干水分后，用 dma提取试剂盒（gene mark生物科技有限公司）提取。1.3.3标识序列的克隆及核昔酸序列测定以供试菌株dna为模板，分别用上述5对引物进行pcr扩增，反应体系为5xbuffer 5pl, 2. 5wnol/l 的上、下游引物各 2pl, 2. 5 u/al 的 ex taq （takara 公司）酶0.25m, lmwl/l的模板1m,补足纯水至25m。its1/its4引物的反 应条件为：95°c预变性5min;95°c变性30 s, 58°c退火1 min, 72°c延伸90 s, 35 次循环;72°c延仲7 min

21、;4°c保存。其余4对引物的反应条件为:95°c预变性5 min;95°c变性 30 s,设定退火温度下（pbeta-f/pbeta-r、ef1f/ef1r、 prpb2f/prpb2r 和 ef1f/ef1r 引物的退火温度分别为 55、60、58 和 60°c） 1 min, 72°c延伸100 s, 35次循环；72°c延伸10 min;4°c保存。将pcr产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶回收试剂盒（axygcn公司） 对目的片段进行回收纯化。将纯化产物连接到t载体（p gem-t easy vector,

22、ta kara公司）上，然后热激转化到大肠杆菌，通过蓝白斑筛选转化子。经菌液pcr 检测正确后进行核昔酸序列测定（上海英骏牛物技术公司）。1. 4 pcr产物序列分析及菌株鉴定将检测的序列在gen bank数据库中进行blast同源性比对，选取与试验菌株序 列高度相似的模式菌株和已定名的代表性菌株，与所测得的各菌株its序列和4 个核基因序列分别进行比对，以球砲白僵菌beauveria bassiana gkvk01为外群, 利用mega 6. 0进行聚类分析，采用邻近法（neighbor-joining, nj）构建系统 进化树，自举值bootstrap为1000次重复，分析比较菌株间的亲缘

23、关系，并参 照bischoff等13的谱系,确定试验菌株所属种类。2结果与分析2.1绿僵菌4个生防菌株的抱子形态在pda培养基上，4个菌株菌落最初均为白色绒毛状，其中ippm010202绒毛较 长而疏松，tmt330189生长较快口在第4d时首先岀现绿色孑包子。4个菌株菌落 抱子均为绿色，但色调差别较大，肉眼可辩。m200614色调最浅呈鲜草绿， 1m1330189为橄榄绿，1ppm010202为深橄榄绿，1pp1ppm2029的绿色略偏黄褐。在相差显微镜下观察到4个菌株的分生他子梗均为单梗不具梗束，梗端略窄缩， 菌株间差异不明显。分牛抱子形态为椭圆至两端钝圆的短棒形。相比而言，菌株 imi3

24、30189孑包子的纵轴最短，为（4.05.5） umx （3. 04. 0） um椭圆状;菌株 ippippm2029 的纵轴最长，为（8095） umx （3. 04 0） um;菌株 ippm010202和m200614纵轴平均长度相近，但前者较为整齐，后者长短变化较大，且有的 略微侧弯（图1）。其他特征差异不明显。ippmo10202ippm2029图1绿僵菌4个菌株的分生孑包子形态(400x,标尺10 u m) fig. 1 morphological observation of the conidia from 4 isolates (400x, scale bar 10 u m)

25、 下载原图2.2绿僵菌5个标识基因片段的克隆以5对优化引物分别对4个待测菌株进行pcr扩增，得到预期的its1-4、b-tubulin、rpb1、rpb2和ef-la标识序列片段（图2）。经核昔酸序列检测, 确定扩增片段属于预期的标识基因。序列已经提交gen bank,登录号为 ky437670ky437689,共 20 条。itsh4cm43211cmp o o o o oo o o b o o o 0 5000 o o o 0 7 5 2 1 5 3 2 1图2绿僵菌4菌株its1-4、b-tubulin、rpbk rpb2和ef-1 a标识序列克隆 fig. 2 cloning of t

26、ts1-4, 0 - tubulin, rpb1, rpb2 and ef-1 a identif icating scqucnccs from 4 isolates of mctarhizium genus 下载原图注训为marker dl2000 plus;c为无模板空白；广4分别为菌株ippm010202、 ippm2029、200614和 imi330189°note:m is marker dl2000 plus;c is no template blank;1, 2, 3 and 4 are strains of ippmo10202, ippm2029, 200614

27、and imi330189, respectively2. 3标识序列分析及菌株分类鉴定 2. 3.1 4个待测菌株的分类鉴定从gen bank中查到绿僵菌不同菌株的its1-4、b -tubul in> rpb1 > rpb2和eft a 的基因序列，将4个待测菌株的对应序列分别进行blast比对，选取与试验菌株 序列高度相似的菌株和已定名的模式菌株或代表性菌株共22株，进行聚类分析, 得到5个标识基因序列的系统进化树（图3） o从5个基因的系统进化可以看到，外围的球砲口僵菌都是独立于系统树的基部， 与各绿僵菌菌株的遗传距离很远。试验菌株1ppm010202和1ppm2029总是

28、聚类在 同一组或最近的支系中，而imi330189和m200614分别在其他组群。在its1-4序列的系统树中，绿僵菌菌株聚类为4个主要组群，其中3个为单一 种的组群，即平沙绿僵菌、蝗绿僵菌m. acridum和柱砲绿僵菌m. cylindrosporae, 另1个为混合种组群，含低温绿僵菌m. frigidum和黄绿绿僵菌黄绿变种 （var. flavoviridc）,分别在2个更小的支系上。试验菌株ippm010202和 1ppm2029划分在平沙绿僵菌组群中，与最相近的平沙绿僵菌arsef1009菌株支 持率分别为99. 28%和98.74%。试验菌株imi330189划分在蝗绿僵菌组群

29、中，与 蝗绿僵菌模式菌株arsef7486和菌株arsef324聚在一起，支持率分别为100%和 99. 64%。试验菌株m200614划分在混合组群中低温绿僵菌支系上，与该种模式菌 株arsef4124聚在一起，支持率高达99. 66% （图3"。从beta-tubulin序列的系统树得到3个主要组群，除1个单一种蝗绿僵菌组群， 另2个为混合种组群，即平沙绿僵菌和罗伯茨绿僵菌m. robertsii为一组、低温 绿僵菌和黄绿绿僵菌为一组，每个种分别在更小的支系上。4个试验菌株归属组 群或支系与tts1-4序列的聚类相同。tppm010202与平沙绿僵菌模式菌株 arsef3210聚

30、在一起，它们z间没有碱基差异;ippm2029也只有1个碱基差异， 可以确认为同一个种。与imi330189归为同一组的是蝗绿僵菌arsef7486和 arsef324,之间有4个碱基差界，支持率高达99. 67%。m200614则与低温绿僵菌 arsef7445菌株聚在一个分支上，它们有14个碱基差异，支持率98. 92% （图 3b） oa. rdna-its0.02b. beta-tubulin图3绿僵菌不同菌株5个基因序列的系统进化树fig. 3 phylogenetic trees of five gene sequences from different isolates of m

31、etarhizium genus 下 载原图d. rpb2605798 u900.02e. ef-la图3绿僵菌不同菌株5个基因序列的系统进化树fig. 3 phylogenetic trees of five gene sequences from different isolates of metarhizium genus 下 载原图rpb1序列的系统树首先将所有比对的绿僵菌菌株分为2个主要组群，再分为2 个支系。平沙绿僵菌和蝗绿僵菌为同一组群分化的支系，低温绿僵菌和黄绿绿僵 菌为另一组群分化的支系。4个试骑菌株所在支系也与its1-4序列的聚类相同。 ippm010202和ippm20

32、29同聚一组，只有4个碱基差异，并分别与模式菌株 arsef3210的支持率为99.81%和99. 90%,认定同属-种绿僵菌。与前2个序列 聚类相似，imi330189再次与蝗绿僵菌模式菌株arsef324和arsef7486聚为一 组，支持率高达99. 75%o m200614与低温绿僵菌最相似菌株arsef4124和 arsef4561 支持率为 99.81%和 99. 52% （图 3c）。rpb2序列的系统树的聚类与rpb1序列的相似，2个主要组群中分別含2个支系。 所不同的是该基因碱基序列在平沙绿僵菌、低温绿僵菌和黄绿绿僵菌支系上出现 较多变化。试验菌株ippm010202和ipp

33、m2029与平沙绿僵菌模式菌株arsef3210 的支持率都为94. 67%。m200614在低温绿僵菌支系上与最近菌株f1777和 arsef4561的支持率分别为94. 09%和94. 24%。该基因还将黄绿绿僵菌的4个菌 株分配到2个更小的支系上（图3d） orf-la序列的系统树聚类与上述几个基因略有不同。虽然所有菌株聚类形成的 组群或支系是基本相同的，试验菌株的种级归属也不变，但支系z间的亲缘关 系发生变化。上述4个基因序列的系统树中，蝗绿僵菌支系与平沙绿僵菌支系遗 传距离较近而和对与低温绿僵菌和黄绿绿僵菌支系距离较远，但在本序列系统 树中相对地与低温绿僵菌和黄绿绿僵菌支系遗传距离较

34、近，而与平沙绿僵菌支 系距离较远。相比前4个基因，菌株tmt330189与蝗绿僵菌支系的arsef324和 arsef7486菌株的支持率有所降低，为94. 27%和94. 47%。另外，一个平沙绿僵 菌菌株被聚类到罗伯茨绿僵菌的小支系上。说明ef-1 a碱基序列有较高多态性, 并较早出现分化（图3e） o上述5个基因序列的系统进化分析均支持试验菌株ippm010202和ippm2029同属 于平沙绿僵菌，tmt330189和m200614分别为蝗绿僵菌和低温绿僵菌。2. 3.2 4个生防菌株的亲缘性将4个生防菌株的5个标识基因序列依次串联后构建系统发育树，结果可直观地 看到，4个菌株分化为3

35、支系,其中1ppm010202和ippm2029在同一支系，与 imi330189遗传距离相对较近、与m200614较远。和似性分析表明，总体上4个 菌株高度相似，在7796个碱基中总体相似率为92. 37%o菌株之间，ippm010202 与tppm2029的亲缘性最近,相似率高达99. 78%,它们与m200614亲缘性最远, 相似率为90. 41%和90. 68%,与imi330189的相似率为92. 26%和92. 00%;imi330189 与 m200614 之间相似率为 91.22% （图 4）。0.0140.0：(koi1图4 4个绿僵菌菌株的系统进化亲缘性分析fig. 4 g

36、enetic similarity of four metarhizium strains下载原图3讨论绿僵菌属内不同种和变种的形态差异微小，而菌落特征可受培养条件的影响， 分生孑包子大小和形状存在一定变化范围，对产孑包瓶梗的观察描述有一定主观性， 因此依据形态学特征作分类时有较大局限性。以形态学特征，只能将绿僵菌属分 为金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌2个种旦1。实际上它们各自都包含庞杂的复合类 群。报道的生防菌株多属于m. anisopliaeo近年来，r dna-its区序列比对逐渐 成为真菌菌株鉴别鉴定的重要方法14t6。木试验的4个牛防菌株，尽管检测 到对寄主致病力差异和观察到瓶梗和孑包子形

37、态差异，但按照形态学系统的初步 鉴定都归于金龟子绿僵菌m. anisopliaeo菌株ippm010202和ippm2029的抱子 颜色和显微形态存在视觉可辨差别，但通过5个标识基因的单序列或多序列对 比，都显示它们的遗传距离十分相近，并与平沙绿僵菌聚在一起。平沙绿僵菌最 早由郭好礼等11报道定名,其区别金龟了绿僵菌的鉴定特征是绿色或灰绿菌 落始终不变黑，在扫描电镜下分生孑包子呈长椭圆形口较对称、两端稍细，抱子链 连接点基本在同一屮心轴上。这些特征需要在电子显微镜下仔细观察才能清晰鉴 别，使该新种少受重视，直到bischoff13基因鉴定才肯定了其种级水平的分 类地位。引进的菌株imi3301

38、89在早期根据形态分类曾被描述为黄绿绿僵菌或该 种的小孑包变种，后来通过r dna-its区序列结合产抱形态学比较后，确定该菌株 为金龟子绿僵菌的蝗变种im，并采用多基因系统发育分析鉴定后，升级到蝗 绿僵菌种一级地位13。菌株m200614在atcc的记录为金龟子绿僵菌，经本试 验多基因分析，认为原来的分类尚未细化，应当根据基因进化，从金龟子绿僵 菌分离岀来，并升级为低温绿僵菌种一级。由此可见，多基因系统发育分析对菌 株的鉴别和鉴定有更高的准确性。本研究中5个标识基因的碱基序列有不同变异频率，显示在菌株间相似率的差 异，其屮its1-4的相似率最低，为86. 42%,其他4个基因的相似率为94

39、. 02%、9622%,因此its1-4对绿僵菌种间分类效率优于其他基因。从碱基变异 位点的分布比较，1ts1-4的变异碱基主要聚集在转录间区，而且有11处出现 35个连续碱基变异、5处出现6个以上连续碱基变异，较高的变异幅度使其在 菌株间有较高的分类效率;相对地，其他4个基因的碱基变异位点比较分散，而 且大多数为单碱基变异，最为保守的是rpb1,在189个变异位点屮只有1处为 连续3个连续碱基变异。由于每个标识基因所处区段不同，用它们比较菌株间亲 缘关系时会得出不同的结果，例如，本研究在用ef-la序列比较时，蝗绿僵菌 支系与低温绿僵菌和黄绿绿僵菌支系遗传距离较近，而与平沙绿僵菌支系距离 较

40、远，但在用其他标识基因比较吋正好相反。而kef-la这段序列还能将一个 平沙绿僵菌菌株鉴别到亲缘关系很近的罗伯茨绿僵菌的支系上，说明它有较高 的分辨率。可见，its1-4是菌种分类鉴定的优良标识序列，但单基因的系统进 化分析仍存在局限性，可以通过多基因的系统分析来弥补。r dna-its序列在真菌种级分类和部分种下鉴別显示比形态学方法更为有效，但 由于其所含遗传信息的有限，对复合种内形态学相近物种或变种仍然难以区别。 如driver等10研究屮,形态学差异很大的金龟子绿僵菌和大抱绿僵菌在its 序列系统树中处于同一支系未能分开。在nishi等uz1的绿僵菌系统发育分析中 也出现类似问题，需要增

41、加更多遗传信息来解决。单基因的系统发育树只能代表 基因在物种间的进化关系，只有多个基因系统发育分析才能可靠的反映物种间 关系，多基因序列系统分析正逐渐成为真菌种内细化分类和疑似物种鉴定的重 要方法16, 18。然而，当前能够用于真菌分类和鉴定的标识基因还很少，因为标识基因不仅需 要有稳定的“持家”性，述要确定其序列多态性在一定适宜范围，以使基因在 菌种间、种内的分化程度能够通过系统发育树体现出来，否则可能得到不准确的 分类结果。随着基因测序技术的快速发展，包括绿僵菌在内的许多真菌都完成了 基因组测序，为筛选真菌分类和鉴定的标识基因提供了重要基础。参考文献1 tulloch m. the gen

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