脓汁和粪便标本中病原菌的检测-1

1、张三李四020-62-7891230757-299-85246南方医科大学公卫学院微生物学系医学微生物学实验医学微生物学实验 Medical Microbiology Practicum微生物学实验室规则微生物学实验室规则Lab Safety Regulation v进入实验室必须穿白大衣，戴帽子。进入实验室必须穿白大衣，戴帽子。v书本、文具放在抽屉里。书本、文具放在抽屉里。v实验室内不准吃东西、喝饮料，不准把任何东西放入嘴中，也不实验室内不准吃东西、喝饮料，不准把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头脸等部位。要用手抚摸头脸等部位。v凡是废弃的细菌培养物、带菌材料，应放在指定地点等待灭菌处凡是废

2、弃的细菌培养物、带菌材料，应放在指定地点等待灭菌处理，不得随便乱放或用水冲洗。理，不得随便乱放或用水冲洗。v一旦发生意外，造成污染，应立即报告老师进行处理。一旦发生意外，造成污染，应立即报告老师进行处理。v离开实验室前离开实验室前, ,必须洗手。怀疑污染应及时用必须洗手。怀疑污染应及时用11新洁而灭泡手。新洁而灭泡手。v每次实验后，实验台用消毒液擦拭，地板先用湿的拖布拖地以后每次实验后，实验台用消毒液擦拭，地板先用湿的拖布拖地以后再扫地，实验室用紫外线灯照射再扫地，实验室用紫外线灯照射1 1小时。小时。实验分组实验分组（4545人）人）v俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。v每组按从前

3、到后,从左到右的顺序，分别编号为甲乙丙丁。 甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁甲 乙 5丙 丁甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 讲 台左右11 甲 乙 丙 丁 戊实验分组实验分组（4040人）人）v俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。v每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。 甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁甲 乙 5丙 丁甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 讲 台左右实验分组实验分组（3636人）人）v俩俩相

4、对4人为一个小组,组号编在电源插座上。v每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。 甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁 5 甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 讲 台左右实验分组实验分组（3232人）人）v俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。v每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。 甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁 5 甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁 10 甲 乙 9丙 丁 讲 台左右实验室器材介绍实验室器材介绍常用器材摆放

5、顺序：电源插座常用器材摆放顺序：电源插座试管架试管架酒精灯酒精灯污物盘。污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第试管架上器材：靠近插座一侧第1 1列放置接种针列放置接种针, ,第第2 2列放置列放置接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。普通冰箱普通冰箱(3(3颗星颗星* * * *) )冷藏室冷藏室( (上柜）：上柜）：温度温度4 488，保存细菌培养物，保存细菌培养物，培养基，培养基，常用菌种常用菌种和抗菌素纸片和抗菌素纸片等等。冷冻室（下柜）：冷冻室（下柜）：温度温度181

6、8，保存诊断血清、血，保存诊断血清、血浆，长期保藏的抗菌素纸片。浆，长期保藏的抗菌素纸片。 卫生工具：卫生工具：扫帚扫帚,拖布拖布,撮箕撮箕,垃圾筐垃圾筐,放在冰箱放在冰箱和水池之间。和水池之间。隔水式电热恒温培养箱：隔水式电热恒温培养箱：35353737，一般细菌培养时间为一般细菌培养时间为18182424小时。小时。 奥林巴斯奥林巴斯 CX21CX21型型 生物显微镜生物显微镜（实验柜内，实验柜内，每人一台）每人一台）注意：只能横放，不得竖放。注意：只能横放，不得竖放。革兰染色瓶革兰染色瓶染色架染色架石蜡油石蜡油拭镜纸拭镜纸吸水纸吸水纸乙醇乙醚乙醇乙醚微生物学器材柜微生物学器材柜-1-1（

7、西侧边台中段）（西侧边台中段）电炉电炉右侧柜内右侧柜内微生物学器材柜微生物学器材柜-2-2（东侧边台中段）（东侧边台中段）酒精棉球酒精棉球碘酒棉球碘酒棉球镊子镊子电炉、石棉网电炉、石棉网手套手套 1500W 1500W电炉电炉安全警告安全警告1.1.电源插塞与电炉插孔接触良好电源插塞与电炉插孔接触良好插头插入插座。插头插入插座。2.2.如果培养基暴沸溢出，流入电炉；必须立即如果培养基暴沸溢出，流入电炉；必须立即切断切断电源、拔除插头；电源、拔除插头；以免以免触电，危及生命！触电，危及生命！东西两侧边台各一个电炉，每个电炉东西两侧边台各一个电炉，每个电炉可同时放置可同时放置4 4个个300ml3

8、00ml锥形瓶进行锥形瓶进行加热加热。蒸馏水：蒸馏水：配制培养基。11新洁而灭：新洁而灭：怀疑病原菌污染，泡手35分钟。消毒液：消毒液：擦拭实验台台面。玻片缸：玻片缸：浸泡用过的载玻片。医学微生物学实验综合性实验一Comprehensive Experiment 1 v脓汁和粪便标本中病原菌的检测（P2） Isolation and detection of pathogenic bacteria in pus and stool specimens 培养基的制备P2消毒与灭菌P5细菌的人工培养无菌技术（录像）摆斜面，倾注平板。脓汁、痰、咽部分泌物观察菌落特征、溶血性、色素肉汤增菌培养挑取可疑

9、菌落涂片染色镜检血平板培养直接涂片、革兰染色、镜检血液、穿刺液纯培养培养液涂片染色境检染色镜检生化反应血清学鉴定双糖铁培养基增菌培养血、骨髓挑取可疑菌落SS琼脂、伊红美蓝平板分离培养粪便常见肠道致病菌的检查程序常见肠道致病菌的检查程序P48P48：常见病原性球菌的检查程序常见病原性球菌的检查程序P47P47：生化反应动物实验药敏实验脓汁和粪便标本中病原菌的检测脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验流程实验流程(6(6次课次课1212学时）学时）培养基的制备细菌的分离培养细菌的纯培养细菌的形态学检查细菌的生化试验等细菌的血清学试验、结果分析实验论文撰写培养基的制备 Preparation ofPrep

10、aration of Culture MediaCulture Media组号组号培养基培养基称量称量水量水量煮沸煮沸分装分装备注（备注（4545人份）人份）1 1，1111营养琼脂营养琼脂11.4g11.4g300ml300ml- - -4 4瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂3.0g3.0g80ml80ml3 3次次5ml5ml1616支支3 3，中试管，斜面，中试管，斜面5 57 7营养肉汤营养肉汤1.1g1.1g50ml50ml1 1次次3ml3ml1616支支3 3，小试管，肉汤，小试管，肉汤8 81010半固体琼脂半固体琼脂1.9g1.9g65

11、ml65ml3 3次次4ml4ml1616支支3 3，小试管，高层，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！培养基的制备 Preparation ofPreparation of Culture MediaCulture Media组号组号培养基培养基称量称量水量水量煮沸煮沸分装分装备注（备注（4040人份）人份）1 1营养琼脂营养琼脂11.4g11.4g300ml300ml- - -4 4瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂2.9g2.9g75ml75ml3 3次次5ml5ml1515支支3 3，中试管，斜面，中试管，斜面5 57 7营养肉汤营

12、养肉汤1.1g1.1g50ml50ml1 1次次3ml3ml1515支支3 3，小试管，肉汤，小试管，肉汤8 81010半固体琼脂半固体琼脂1.7g1.7g60ml60ml3 3次次4ml4ml1515支支3 3，小试管，高层，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！培养基的制备 Preparation ofPreparation of Culture MediaCulture Media组号组号培养基培养基称量称量水量水量煮沸煮沸分装分装备注（备注（3636人份）人份）1 1营养琼脂营养琼脂11.4g11.4g300ml300ml- - -3 3瓶，瓶，500ml500ml瓶，平

13、板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂2.7g2.7g70ml70ml3 3次次5ml5ml1414支支3 3，中试管，斜面，中试管，斜面6 67 7营养肉汤营养肉汤1.3g1.3g60ml60ml1 1次次3ml3ml2020支支2 2，小试管，肉汤，小试管，肉汤8 81010半固体琼脂半固体琼脂1.7g1.7g60ml60ml3 3次次4ml4ml1414支支3 3，小试管，高层，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！培养基的制备 Preparation ofPreparation of Culture MediaCulture Media组号组号培养基培养基称量称量水量水量

14、煮沸煮沸分装分装备注（备注（3232人份）人份）1 1营养琼脂营养琼脂11.4g11.4g300ml300ml- - -3 3瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂2.3g2.3g60ml60ml3 35ml5ml1212支支3 3，中试管，斜面，中试管，斜面6 6、7 7营养肉汤营养肉汤1.2g1.2g55ml55ml1 13ml3ml1818支支2 2，小试管，肉汤，小试管，肉汤8 8、9 9半固体琼脂半固体琼脂2.2g2.2g75ml75ml3 34ml4ml1818支支2 2，小试管，高层，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！ 培养基隔

15、石棉网煮沸，使完全溶解。营养肉汤煮沸培养基隔石棉网煮沸，使完全溶解。营养肉汤煮沸1 1次，含琼脂的次，含琼脂的培养基煮沸培养基煮沸3 3次次( (煮至煮至刚刚冒泡刚刚冒泡, ,立即放置台面，半分钟后再煮立即放置台面，半分钟后再煮) )。加热时加热时,常摇动。常摇动。沸腾时，不能摇动！沸腾时，不能摇动！用洗耳球和刻度吸管分装培养基。用洗耳球和刻度吸管分装培养基。棉塞棉塞1/21/2塞入试管口内，松紧合适。塞入试管口内，松紧合适。培养基趁热分装培养基趁热分装培养基装筐待灭菌培养基装筐待灭菌放置试管筐内，罩上硫酸放置试管筐内，罩上硫酸纸牛皮纸，用橡皮筋扎好。纸牛皮纸，用橡皮筋扎好。各组边台柜子内器材

16、各组边台柜子内器材量筒量筒锥形瓶锥形瓶砝码砝码干粉培养基干粉培养基试管筐试管筐天平天平各组边台抽屉内器材各组边台抽屉内器材试管试管刻度吸管刻度吸管洗耳球洗耳球称量皿称量皿2个个药勺药勺厘米尺厘米尺硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋 称量皿置于左、右盘，称量皿置于左、右盘，游码游码移至标尺左端移至标尺左端“0”0”点位点位置上，指针应对准中线，取置上，指针应对准中线，取得平衡。否则将杠杆两端的得平衡。否则将杠杆两端的调整螺母旋动调节平衡。调整螺母旋动调节平衡。 秤物时秤物时“左物右码左物右码”，砝码置右盘，物品置左盘，砝码置右盘，物品置左盘，尽可能放在秤盘中心。天平尽可能放在秤盘中心。

17、天平保持干燥、清洁。用过的药保持干燥、清洁。用过的药勺、称量皿清洗干净。勺、称量皿清洗干净。 称量皿称量皿置于置于左盘左盘，游码游码移至标尺左端移至标尺左端“0”0”点位置点位置上，指针应对准中线，取得上，指针应对准中线，取得平衡。否则将杠杆两端的调平衡。否则将杠杆两端的调整螺母旋动调节平衡。整螺母旋动调节平衡。 秤物时秤物时“左物右码左物右码”，砝码置右盘，物品置左盘，砝码置右盘，物品置左盘，尽可能放在秤盘中心。天平尽可能放在秤盘中心。天平保持干燥、清洁。用过的药保持干燥、清洁。用过的药勺、称量皿清洗干净。勺、称量皿清洗干净。培养基配制器材内盖盖好内盖盖好外盖扭紧外盖扭紧培养基制备程序 干粉

18、培养基蒸馏水加热溶化分装集中放在试管筐里 罩上硫酸纸、牛皮纸 用橡皮筋扎好 放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）灭菌。 请在 30分钟内完成。培养基的制备 Preparation ofPreparation of Culture MediaCulture Media组号组号培养基培养基称量称量水量水量煮沸煮沸分装分装备注（备注（4040人份）人份）1 1营养琼脂营养琼脂11.4g11.4g300ml300ml- - -4 4瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂2.9g2.9g75ml75ml3 3次次5ml5ml1515支支3 3，中试管

19、，斜面，中试管，斜面5 57 7营养肉汤营养肉汤1.1g1.1g50ml50ml1 1次次3ml3ml1515支支3 3，小试管，肉汤，小试管，肉汤8 81010半固体琼脂半固体琼脂1.7g1.7g60ml60ml3 3次次4ml4ml1515支支3 3，小试管，高层，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！Preparation of Culture media vGroup formation: Four students each form one group Total of 10 groups (10 4= 40) Each group will prepare the

20、media according to the instruction given in next slide.Preparation of Culture MediaGroupnumberName of Medium to prepareQuantity weightingDistilled waterBoilDispensing quantity in containerContainer to dispense1Nutrient agar11.4g300ml4 bottles ，Petri dishes24Nutrient agar2.9g75ml35ml153 tubes ，agar s

21、lants57Nutrient broth1.1g50ml13ml153 tubes ，broth tubes810Semi-solid agar1.7g60ml34ml153 tubes ，agar deepsMelt agar into solution in the microwave or electric stove 玻璃器材的洗刷玻璃器材的洗刷v无污染器皿:洗涤剂洗刷流水冲洗10次晾干。v病原菌污染的器材高压蒸汽灭菌趁热倒出污物洗涤剂浸泡瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布，洗刷干净流水冲洗10次晾干。瓶刷瓶刷试管刷试管刷吸管刷吸管刷去污粉去污粉纱布纱布收拾器材，放回边台柜内，依次摆

22、整齐收拾器材，放回边台柜内，依次摆整齐! !量筒量筒锥形瓶锥形瓶砝码砝码干粉培养基干粉培养基试管筐试管筐天平天平量筒量筒罩纸套，扎皮筋罩纸套，扎皮筋 。锥形瓶锥形瓶洗干净，塞棉塞，罩纸套，扎皮筋洗干净，塞棉塞，罩纸套，扎皮筋 。干粉培养基干粉培养基内外盖子，必须盖好扭紧！内外盖子，必须盖好扭紧！收拾器材，放回抽屉内，依次摆整齐收拾器材，放回抽屉内，依次摆整齐! !试管试管刻度吸管刻度吸管洗耳球洗耳球称量皿称量皿药勺药勺厘米尺厘米尺硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋药勺、称量皿、刻度吸管洗刷干净，药勺、称量皿、刻度吸管洗刷干净，甩去水滴，放回边台抽屉内。甩去水滴，放回边台抽屉内。细菌培

23、养基细菌培养基 Culture MediaCulture Media 用人工的方法，将多种营养物质，根据各种微生物生长繁殖的需要而合成的一种营养制品。它的主要成分是蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和水，pH7.47.6。v培养基制备的一般程序：培养基制备的一般程序： 调配溶化 矫正pH 分装灭菌检定保存。 干粉培养基蒸馏水加热溶化分装灭菌检定 保存。v培养基的制备原则：培养基的制备原则： (1)适当的营养成分,(2)合适的酸碱度,(3)配制后必须灭菌。v培养基的种类（按物理性状分类）培养基的种类（按物理性状分类）液体培养基:不含凝固剂(琼脂),用于增菌，纯培养,保种。固体培养基:含12琼脂，用于分离培养

24、,纯培养,保种。半固体培基（琼脂高层）:含0.30.5琼脂，用于动力检测,保种。营养肉汤营养肉汤 brothbroth琼脂斜面琼脂斜面 agar slant agar slant 琼脂高层琼脂高层 agar agar deepdeepDifferent forms of culture media.v培养基的种类（按用途分类）培养基的种类（按用途分类）P P3 3基础培养基基础培养基: :含一般细菌生长繁殖所需的基本营养成分，可作为一些特殊培养基的基础成分，如普通平板。营养培养基营养培养基：在基础培养基中加入血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长，如血平板。

25、增菌培养基：增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。选择培养基：选择培养基：在培养基中加入抑制剂抑制杂菌生长，有助于目的菌的生长，如EMB、SS平板。鉴别培养基：鉴别培养基：利用细菌分解能力及代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，用来试验细菌的生化反应、代谢产物，如糖发酵管。厌氧培养基：厌氧培养基：氧化还原电势低，表面用凡士林和石蜡封住，与空气隔绝，成为无氧环境，如庖肉培养基。培养基的灭菌培养基的灭菌 在冷空气完全排尽的情况下，蒸汽压103.43 kPa ,温度可达到121.3 ,维持1530分钟，可以杀灭包括细菌芽胞在内的所有微生物。v基础培养基：

26、121高压蒸汽灭菌1530分钟。v含糖培养基：115灭菌15分钟。v鸡蛋、牛奶培养基:7510030分钟，3次(1天1次)。v不耐高温的液体成分：滤菌器滤过除菌EK型蔡氏滤器、 G5或G6玻璃滤器、0.45um或0.22um微孔滤膜。琼脂平板琼脂平板 agar plateagar plate 含琼脂的培养基灭菌以后，冷却含琼脂的培养基灭菌以后，冷却50506060（温度越（温度越高，冷凝水越多，越易污染高，冷凝水越多，越易污染 ），以无菌操作，倾注平），以无菌操作，倾注平皿皿10ml10ml（直径（直径7 7厘米平皿），琼脂凝固后形成琼脂平板。厘米平皿），琼脂凝固后形成琼脂平板。 平板主要用于

27、细菌的分离培养和药敏试验。平板主要用于细菌的分离培养和药敏试验。平板储存待用或做细菌培养时，为什么要倒置？平板储存待用或做细菌培养时，为什么要倒置？防止平板水分蒸发丢失。防止平板水分蒸发丢失。防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成。防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成。琼脂斜面琼脂斜面 agar slantagar slant 含琼脂的培养基灭菌以后，趁热斜放，培基不超过试含琼脂的培养基灭菌以后，趁热斜放，培基不超过试管长度的管长度的2/32/3，琼脂凝固以后形成一个倾斜的表面。，琼脂凝固以后形成一个倾斜的表面。 斜面主要用于纯菌移种和菌种保存。斜面主要用于纯菌移种和菌种保存。 斜面底部的冷

28、凝水有利于纯菌移种、菌苔形成和菌斜面底部的冷凝水有利于纯菌移种、菌苔形成和菌种保藏。种保藏。怎样检查培养基是否合格?无菌试验：将待检培养基置于3537培养箱培养24小时，无任何细菌生长为合格。效果试验：将已知的标准参考菌株，接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。细菌生长繁殖的方式和速度细菌生长繁殖的方式和速度v细菌繁殖方式：以二分裂方式进行无性繁殖。v繁殖速度：多数2030分钟繁殖1代，结核杆菌1820小时繁殖一代。v细菌生长繁殖曲线细菌的生长曲线细菌的生长曲线细菌数量的对数细菌数量的对数培养时间培养时间（小时）（小时）5 10 15 20 25 30 6

29、.06.57.07.58.08.59.0活菌数活菌数总菌数总菌数迟缓期迟缓期对数生长期对数生长期稳定期稳定期衰退期衰退期细菌生长曲线意义细菌生长曲线意义v迟缓期：一般14h，细菌代谢活跃，但不繁殖。v对数期：维持48h，细菌快速繁殖，数目呈几何级数增加，细菌形态、染色性、生理活性最典型、对抗菌素最敏感。细菌鉴定选用此期为佳。v稳定期： 通常维持10h，活菌数和死菌数几乎相等，代谢产物形成较多。v衰亡期：培养18 24 h以后，代谢逐渐停滞,死菌数超过活菌数。玻璃器材的洗刷玻璃器材的洗刷v无污染器皿:洗涤剂洗刷流水冲洗10次晾干。v病原菌污染的器材高压蒸汽灭菌趁热倒出污物洗涤剂浸泡瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布，洗刷干净流水冲洗10次晾干。瓶刷瓶刷试管刷试管刷吸管刷吸管刷去污粉去污粉纱布纱布试管用毛刷，试管用毛刷，上下、旋转刷洗上下、旋转刷洗内壁和管底。内壁和管底。字迹用湿纱布，字迹用湿纱布，粘去污粉擦拭。粘去污粉擦拭。管口朝向相同，管口朝向相同，流水冲洗流水冲洗1010次。次。洗干净的试管，洗干净的试管，倒扣在筐内，晾干。倒扣在筐内，晾干。平皿用纱布，旋转擦平皿用纱布，旋转擦拭内外侧，字迹用纱拭内外侧，字迹用纱布粘去污粉擦拭。布粘去污粉擦拭。流