响应面法优化微波辅助葛根素的高效液相色谱

1、对粉葛中葛根素和大豆苷元的HPLC荧光法测定的微波辅助提取工艺的响应面优化摘要：微波辅助提取法是对粉葛中葛根素和丹参素的HPLC荧光检测响应面法优化。优化的提取过程通过浸泡样品用70%甲醇达到（115，vv）为30分钟，然后微波照射11分钟，在600 W耦合用HPLC荧光提出恢复良好，令人满意的精度的提取工艺，功率，和良好的线性关系。从中国药典方法相比，该方法使高提取效率和更准确的分析结果。它可以在粉葛药材质量评价的潜在价值。关键词：微波辅助萃取（MAE）；响应面法（RSM）；葛根素；丹参素；高效液相色谱-荧光检测；粉葛1引言 粉葛是粉葛的干燥根。（豆科），多年生豆科植物主要分布在亚洲东部。它

2、是一个重要的中药用于治疗肩、腕的刚度，感冒，流感，高血压，等 1 葛根素和大豆苷元（图1）是两种主要异黄酮粉葛。药理和临床研究表明，葛根素可用于治疗高血压，心绞痛，急性心肌梗塞 2 ；和大豆苷元对脑缺血缺氧的影响， 3 和 4 心血管疾病。从药物的需求增加行业已导致大规模提取葛根素和大豆苷元的粉葛。因此有必要建立一个高效、低成本的提取及含量测定 已作出了许多尝试来测定粉葛中葛根素及其制剂，如紫外线分光光度法（UV） 6 ，高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV） 7 和液相色谱/串联质谱（LC-MS） 10 。分离纯化葛根高速逆流色谱异黄酮也已发展 11 。葛根或其药用制剂葛根素等生物活性成分

3、的测定一直试图利用毛细管区带电泳紫外检测12,13，近红外光谱（NIRS） 14 和HPLC-UV15,16。用HPLC荧光检测葛根素提高了测定灵敏度17,18图葛根素和丹参素的程序结构葛根异黄酮必须extractedf ROM粉葛在高效液相色谱分析。传统lextraction技术如热回流，醇渗漉和浸渍19,20具有较低的提取效率高，有机溶剂比。一些新的技术，如超临界流体，超声和微波炉已被用于提取葛根异黄酮 21 。微波辅助提取法（MAE）在植物中的植物活性化合物的分析产生了广泛的兴趣 26 。响应面法（RSM）是一个收集的统计和数学技术的发展，提高，优化过程 27 。它可以识别和量化的各种不

4、同的参数之间的相互作用。Box-Behnken设计是一个RSM用于检查的关系一个或多个响应变量和一组实验参数之间的定量方法 28 。它有较少的设计要点和较少的实验进行的二次模型。此外，每个因素三水平而需要五为中心复合设计要求（除非等于一），这是实验中心复合设计和比相同数量的因素 29 更方便和便宜的任务本研究的目的是优化响应面法从粉葛的生物活性化合物的微波辅助提取法，并同时测定葛根素和大豆苷元提取物中的高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FD）。本研究开展的这样一个过程的第一次2个实验2.1材料和化学品粉葛的商业植物样品，在广西，中国生产的，是来自西安的毒品市场购买（中国）。它是由易博士任认证

5、（药用植物资源教育部重点实验室和天然药物化学教授，陕西师范大学，西安，中国）。葛根素和大豆苷元的标准化合物从国家为控制所得到的药品和生物制品（北京，中国）。甲醇和乙腈（色谱级）获得了霍尼韦尔国际公司（马斯基根，毫升，USA）。与微孔Milli-Q系统制备了超纯水（Bedford，MA，USA） 2.2高效液相色谱分析 高效液相色谱法分析了一个水域的微风的液相色谱系统（沃特世公司，米尔福德，MA，USA）。这包括水域1525二元高压泵和控制的恒温柱室授权工作组。Waters 2996二极管阵列探测器记录的分析物的吸收光谱。一个水域2475多波长荧光检测器进行定量检测。分离在Agilent hc-

6、c18柱（250 mmx4.6 mm）中进行。乙腈（A）和KH2PO4三乙胺缓冲溶液（ph7.5,0.01 m）（B）为流动相梯度洗脱程序，分别洗脱0 - 25min，2530 min，。流动相的流速为0.8mL/min。注入量为10 mm，柱的温度保持在30。吸收光谱记录从220 nm到400 nm。荧光激发和发射波长分别为350 nm和472 nm。 2.3标准溶液的制备五毫克的葛根素和大豆苷元一毫克被精确称量并安置在一个5毫升体积瓶中。用70%甲醇溶液制备溶液1000 mgL葛根素和200 mg/L大豆苷元。并对大豆绘制校准曲线。2.4制备的样品溶液与平均绝对误差； MAX以一个XH-1

7、00B微波制备系统运行（湘湖科技有限公司，有限公司，北京，中国）。由一个样品粉末电机通过50目筛。两各粉样克浸泡在30 mL 70 %水甲醇（甲醇/水7030，vv）30分钟，然后在微波功率为600 W下照射11 min。与水连续流动的冷凝器是用来避免萃取过程中溶剂损失。将得到的混合物过滤，接着减少压力0.09 MPa，用残留的萃取剂4 mL进行洗涤。将合并后的滤液蒸发，待水分很少时转至旋转蒸发器RE-52A（雅荣生化仪器厂，上海，中国）。将提取物溶解在725 mL 70 %甲醇水溶液,进而分析并得到最终的解决方案。最终的解决方案是通过一个0.45微米的过滤微孔滤膜（金腾，天津，中国）进行高效

8、液相色谱分析。 2.5实验设计（BBD） 独立的变量选择萃取剂的体积（V，ML），微波功率（P，W），和提取时间（T，分钟）。采用RSM方法来探究三变量和三级BBD的最佳提取工艺。对三个层次的每个变量进行编码- 1,0，和1的色谱峰面积。葛根素作为响应，Y.回归分析由实验数据拟合为经验二阶多项式模型。3结果与讨论 3.1优化微波辅助提取 3.1.1影响萃取剂和浸泡时间对提取 精密称取2 g样品 分别加入30 mL 70 %甲醇水溶液和30 mL 70 %乙醇水溶液作萃取剂，分别进行实验30 min，并计算其平均绝对误差。结果表明，有一些强大的杂质峰水溶液中乙醇的时候作为萃取剂。因此，甲醇水溶液

9、被选为萃取剂，在以下的实验中， 提取物在相同条件下分别溶解于40 %甲醇溶液，55 %甲醇溶液，70 %甲醇溶液，85 %甲醇溶液和100 %甲醇溶液，进行提取。结果表明，存在着强烈的杂质峰时，70 %乙醇水溶液作为萃取剂。因此，甲醇水溶液作为最佳微波萃取剂。 葛根素和大豆苷元的色谱峰面积随甲醇浓度高达70 %的增加而增加，并且在70 %甲醇处，峰面积最大。在充分浸泡样品之前，应使溶剂吸收的样品有足够的微波能量，因为吸收能力在萃取过程中不可缺少。在实验中，2.0 g样品的浸泡于30 mL70 %甲醇中，浸泡时间分别为 10 min,20 min,30 min,60 min,90 min和120

10、 min，在10 min-30 min峰面积随时间的延长而增大，继续延长浸泡时间，葛根素和大豆苷元的峰面积并没有显著增加的。因此，30分钟为最佳浸泡时间浸泡样品充分之前，算出其平均绝对误差。 3.1.2 BBD的提取工艺参数优化 在BBD每个变量的变量和水平根据实验结果确定。基于BBD的实验结果（表1），葛根素萃取二阶多项式模型： 其中，Y色谱峰面积葛根素； V萃取剂的体积（mL）； P微波功率（W）; T提取时间（min）实验结果列于表2。R2 =0.9513，表明回归模型具有低色散。一个变异系数（CV）6.62%显示我重复的模式具有较高的精度。P（P0.05），T，Pt和P2显著模型。这表

11、明，微波的线性条款功率和提取时间，微波功率的二次项，以及微波功率、提取时间之间的相互作用，有显着的影响对葛根素的提取效率。3.1.2 线性和LLOQ校正曲线的线性相关系数(r)超过0.99。 回归方程和LLOQs notoginsenoside R1,人参皂苷Rg1,再保险,Rb1和Rd inTable列出2。 3.1.3 精密度和准确度当天,inter-day notoginsenoside的精密度和准确度R1,人参皂苷Rg1、再保险、Rb1和Rd三种不同浓度inTable 3中做了总结。当天和验收标准inter-day QC浓度15%,方法的精密度和准确度。4 讨论4.1 开发方法蛋白质沉

12、淀和液液萃取进行了调查为了提取五个成分,从等离子体。然而,液液萃取乙酸乙酯或正丁醇显示有限提取恢复的效率分析物。所以蛋白质沉淀最终被选中。不同的沉淀有机溶剂(甲醇、乙腈、丙酮)进行了评估,以提高萃取复苏分析物和效率。乙腈wasfinally选择由于其高萃取回收效率和完美峰的形状。4.2 药代动力学参数n ultra-HPLC-ESI-MS / MS方法已经开发和验证测定notoginsenoside R1,人参皂苷Rg1,再保险,Rb1和R后管理单独的特惠产品在老鼠和特惠产品结合TFFG不同生理状态。与正常大鼠相比,血瘀大鼠有显著延长半衰期时间和MRT0tAUC(Po0.05)和增加(po0.

13、05)notoginsenoside R1和人参皂苷Rg1之后特惠产品。以下原因可以解释药代动力学参数变化的原因。血瘀大鼠的循环将缓慢,领先增加的全血粘度,血浆粘度,纤维蛋白原和血细胞比容，Notoginsenoside R1和人参皂苷Rg1(20(S)-protopanaxatriol)迅速被吸收等离子体和代谢迅速,所以穷人的血循环更有可能影响药代动力学这两个成分的行为。与此同时,在血瘀老鼠,消除人参皂苷Rb1(20(S)-protopanaxadiol)在大鼠血浆快速与正常相比老鼠。这是注意到血瘀大鼠需要的供应人参皂苷Rb1消除血瘀。它是一致的人参皂苷的抗血小板聚集效应Rb122。另一方面,主要的代谢途径皂苷在大鼠被发现氧化和deglycosylation,这主要是由酶催化的老鼠的肝脏。报道,血瘀症影响大鼠肝细胞色素P450-catalyzed药物代谢,由于这个原因,血瘀证对一些皂苷的药动学行为的影响从Sanqi。5 结论开发了一个简单的和验证ultra-HPLC-MS / M