国家自然科学基金申请样板

1、申报国家自然科学基金项目申请书样板各位申请人： 院科教部从我院申报国家自然科学基金项目中挑选了一份严格按照报告正文撰写提纲要求撰写，并在撰写的整体布局、写作方法上比较适宜的申请书作为样板申请书，提供给其他申请人在撰写申请书时参考。注：考虑到本项目也将申请国家自然科学基金，从技术保密方面考虑，涉及核心技术和关键问题之处将以“XXXXXXX”代替。报告正文（一）立项依据与研究内容1立项依据肝纤维化是严重威胁人类健康的重要疾病之一，迄今没有满意的治疗方法。目前国内外绝大多数学者认为，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活是肝纤维化的关键，抑制HSC的激活对肝纤维化的防治

2、有重要价值1。粉防己碱（tetrandrine，又名汉防己甲素）是中药粉防己（Stephania tetrandra S Moore）的主要有效生物碱成分，具有广泛的药理作用。抗肝纤维化是Tet的重要应用领域之一。我们研究室在过去的十几年中，对Tet抗肝纤维化作用及机制进行了系统研究，证实Tet是抗肝纤维化有效药物。然而，由于Tet的剂量安全范围较小，以往研究发现的抗肝纤维化有效剂量与中毒剂量比较接近，故成为限制其临床应用的重要因素。近年国内Tet抗肝纤维化研究也由此逐渐走向低谷。为减少毒副反应，拓展该药物的临床应用，我们近四年从降低Tet的单药剂量、联合用药及改造药物毒性基团等方面进行实验性

3、探索。新近，我们在国内外首次发现，低浓度Tet能上调转化生长因子（transforming growth factor factor ，TGF-）抑制性信号分子Smad 7表达，调控TGF-Smad信号通路，抑制体外培养静止期HSC活化，阻断TGF-1促静止期HSC活化效应，Tet还诱导活化HSC活化逆转。部分最新研究成果已经整理成文发表在本领域有一定影响力的SCI索引源期刊上，并被SCI收录(收录号 IDS Number: 963XN )2（相关文章参详见申请人简历及附件二、三）。这些全新研究成果进一步增强了我们开发这一传统中药的信心。TGF-1是目前认识的最重要的促肝纤维化因子。抑制TGF

4、-1对HSC的作用一直以来均是抗肝纤维化重要着眼点3。Smad 7是HSC TGF-信号通路的最主要负反馈调节信号分子，上调Smad 7是抑制TGF-对HSC不良生物效应的有措施之一4。在肝纤维化过程中，TGF-信号通路还与整合素信号通路存在密切联系。这表现在三个方面：XXXXXX。XXXXXX。XXXXXXXXX。综上所述，XXXXXXX，如能XXXXXX，可进一步实现XXXXX治疗。基于以上研究结果，我们研究室在国家自然科学基金资助下，过去三年中应用化学方法合成了RGD和M6P，并将RGD与M6P结合成一新型复合分子RGD-M6P，研究比较了它们对HSC靶向性及在抑制其功能中的作用（项目名

5、称：RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究，编号：30170412）。我们的研究发现，RGD和RGD-M6P均可抑制HSC活化。RGD在抑制TGF-激活同时，还可阻止HSC与ECM结合，阻断整合素信号转导。研究还发现，M6P能提高RGD作用于HSC的靶向性，增加其局部浓度，使RGD-M6P显示出较RGD更强的抑制作用14。我们首次证实，新型复合分子RGD-M6P用于抗肝纤维化治疗，无论在对HSC靶向的特异性，还是多位点联合作用方面，都优于单一的含RGD序列的肽段或M6P（参见基金结题摘要，相关文章参见申请人简历及附件四）。RGD-M6P新型复合分子的研制成功及其对HSC靶向与抑制功

6、能的发现，有助于我们去研究更多的HSC靶向选择性高、局部作用强、系统毒性小的新型药物和(或)制剂，从而提高药物的疗效、减轻毒性反应。结合我们对Tet药理作用的分子机制的研究结果，不难发现，XXXXXXXX。基于以上系列研究基础与设想，紧跟国内外在制剂学方面的进展，我们拟设计XXXXXXXXXXX。当前，受体调节药物靶向（receptor-mediated drug targeting）作为一种新型的给药系统受到人们的重视16。XXXXXXXXXXXXXXXXX。迄今为止，尚未见到XXXXXXXXXXX。结合国内外同行的研究报道与我们的研究基础，不难推断，XXXXXXXXXXXXXXXXX。综上

7、所述，我们拟在XXXXXXXXXX。本研究将为XXXXXXXX等提供理论与实践基础。XXXXXXXXXX可以设想，如能取得预期效果，经过良好设计的基础研究后，这一XXXXXX应用于临床的时间不会太久，前景广阔。参考文献1 Friedman SL. Mechanisms of disease: Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2004;1(2):98-105.2 Chen YW, Li DG, Wu JX, et al. Tetran

8、drine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005;100(3):299-305.3 Breitkopf K, Haas S, Wiercinska E, et al. Anti-TGF-beta strategies for the treatment of chronic liver disease. Alcohol Cl

9、in Exp Res 2005;29(11 Suppl):121S-131S.4 Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K, et al. Smad7 prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats. Gastroenterology 2003;125(1):178-91.5 Ludbrook SB, Barry ST, Delves CJ, et al. The integrin alphavbeta3 is a receptor for the latency-asso

10、ciated peptides of transforming growth factors beta1 and beta3. Biochem J 2003;369(Pt 2):311-8.6 Annes JP, Chen Y, Munger JS, et al. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1. J Cell Biol 2004;165(5):723-34.7 XXXXXXXXXXXXXXXXX.2 项目的研究内

11、容、研究目标，以及拟解决的关键问题2.1研究内容：2.2.1 XXXXX化学合成与鉴定，二硬脂酸磷酯酰胺XXXXXXXXXX 合成与鉴定。 2.2.2 不同类型脂质体的制备、技术参数优化、物理性质鉴定和脂质体药物包封率、载药量、配体结合率鉴定与提高。2.2.3 大鼠HSC分离培养，XXXXXXX 修饰脂质体与肝星状细胞体外结合活性研究。2.2.4 XXXXX 修饰XXXXXXXXX 对肝星状细胞活化、增殖、XXXXXXX 信号通路影响。2.2.5 XXXXXXXXX 的药代动力学特征、组织分布特征和XXXXXXX 研究。2.2.6 XXXXXXXX 对胆总管结扎和CCl4大鼠肝纤维化防治作用。

12、2.2研究目标：2.2.1 研究构建XXXXXXXX，为抗肝纤维化药物新剂型开发提供新型靶向载体。2.2.2 研究XXXXXX 对HSC生物活性影响及机制，为中西药结合肝纤维化双靶向、多靶点、协同治疗提供理论基础。2.2.3 研究XXXXXXXX 体内HSC靶向性及防治实验性肝纤维化的有效性，为开发中药新剂型、提高药物在靶组织浓度、降低有效剂量、减轻副作用和提高疗效提供实践基础。2.3 拟解决的关键问题：2.3.1 高药物包封率、高配体修饰率的稳定XXXXXXXX 制备。2.3.2 放射性计数法测定XXXXXX 与HSC结合活性，有效抑制HSC活化的剂量、时间参数等。2.3.3 XXXXXX

13、体内HSC靶向性、抗肝纤维化效果比较与评价。3 拟采取的研究方案及可行性分析3.1 研究方案：第一部分XXXXX 及XXXXX 合成(1) XXXXXX 合成及鉴定采用我们研究室建立的方法，化学合成XXXXXX。应用XXXXXXXXXX。合成反应图示如下。高效液相（HPLC）、质谱等方法鉴定合成产物纯度及分子量。反应图（略）(2) XXXXXXXXXXX采用一步法合成。XXXXXXXXXXXX。合成反应图示如下。高效液相（HPLC）和质谱分析法进物产物纯化与鉴定。反应图（略）第二部分长循环脂质体制备、鉴定与技术条件优化 (1) 脂质体制备采用经我们改良的逆相蒸发法制备。具体方法如下：XXXXX

14、XXXXX。(2) 性质鉴定 XXXXXXXXXXXXXXXX。(3) 均匀设计优化处方 根据实验结果及文献，确定影响包封率的主要因素。以包封率为评价指标，采用二项逐步回归计算回归方程，并进行方差分析，优化条件。第三部分 XXXXX修饰长循环脂质体与HSC体外结合活性采用两步胶原酶灌注和密度梯度离心法分离大鼠HSC，选择静止态和激活态的HSC，接种于6孔板上(细胞密度为5.0×105/mL)。待贴壁后，1%胎牛血清DMEM培养过夜，细胞同步化。(1)配体结合的浓度-效应关系XXXXXXXXXXX。(2) 配体结合的时间-效应关系 XXXXXXXXXXXX。(3) 竞争抑制XXXXXX

15、XXXX。(4) 细胞荧光定位、配体表面结合率与内吞率测定XXXXXXXXXX。(5) 平衡解离常数(Kd )和细胞最大结合位点数(Bmax)XXXXXXXXXXX。第四部分 XXXXXXX对HSC生物学特性影响与机制采用酶法分离大鼠HSC。新鲜分离的HSC，体外培养48 h后，作为静止期HSC用于下游实验，或培养1 w后消化传代，继续培养24 h后，作为活化的HSC用于下游实验。(1) XXXXXXX对HSC活化状态影响XXXXXXXXX。(2)XXXXXX对TGF-1效应影响XXXXXXXXXXXX。(3)XXXXXXXX 大鼠HSC TGF-受体XXXXXXX 信号通路影响XXXXXXX

16、XXXXXXX。第五部分 XXXXXXXXXXXX(1) XXXXXXXX 在肝纤维化大鼠体内的器官分布XXXXXXXXXX。(2) XXXXXXX 大鼠体内药代动力学采用XXXXXXXX。(3)XXXXXXX 在肝纤维化大鼠肝脏内分布采用XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。第六部分 XXXXXXX防治大鼠肝纤维化(1)造模采用胆总管结扎和CCl4肝纤维化两种动物模型。(2)分组及处理XXXXXXXXXXXXXX。(3)治疗效果检测主要比较以下指标：XXXXXXXXXXXXXXX。3.2技术路线技术路线图（略）。3.3可行性分析3.3.1 立项依据有坚实的理论与实践基础。本研究是参阅大

17、量文献并结合自身以往深厚的肝纤维化防治研究基础，特别是结合近四年国家自然科学基金资助研究成果，在XXXX 化学合成及功能研究、低剂量XXX抗肝纤维化作用和机制的前期工作基础上，提出的多途径、互补协同与靶向治疗肝纤维化的新探索。掌握了国内外在受体调节药物靶向、低毒性高效中药新剂型开发和以HSC的靶标的肝纤维化靶向治疗中的最新研究动态，借鉴“双靶向”干预的最新研究成果，并与自身实践相结合，在理论上、实践上均有可靠基础。3.3.2 相关实验技术成熟，实验结果可信。本研究使用的实验方法、动物模型和生物分子化学合成等多为国内外应用多年的经典方法，并有自身实践基础。本课题组由掌握以上技术的成员组成，相关技

18、术已应用于科研工作。3.3.3 人员配备合理，具有扎实的相关工作基础和完善的实验设备及技术支持。申请人长期从事肝纤维化防治研究，先后承担包括国家自然基金在内的各类科研项目15项，指导或协助指导博士后、博士生及硕士生70余名。近四年主持了国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究(编号30170412）”和“人卵泡抑素防治肝纤维化的实验研究(编号30170411)”的研究工作，项目组主要成员参与并完成以上研究工作。实验设计指导者、熟练技术人员及辅助人员等各司其职，可保障研究有条不紊的进行。新华医院消化内科系上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）国家级重点学科和“2

19、11”工程重点建设学科的组成单位之一，长期从事肝纤维化防治研究，先后承担包括国家自然科学基金在内的各级各类科研项目20余项。2005年7月，原上海第二医科大学与原上海交通大学合并，组建新的上海交通大学。作为上海交通大学的附属单位，将在科研究设备和技术上更方便的得到比以往更广泛的支持。4 本项目的特色与创新之处4.1 本课题首次尝试利用XXXXXXX构建HSC特异性受体调节药物靶向载体。将新型配体人工化学合成、受体调节药物靶向技术与新型脂质体载药技术三者结合应用于肝纤维化防治，有很强的原始创新性。4.2 本课题首次研究XXXXX生物小分子通过XXXXX与中药粉防己碱相联合，多途径、互补与协同防治

20、肝纤维化。本课题是利用分子机制指导中西药联合应用、构建中药靶向制剂提高疗效降低副作用和多途径协同作用抗肝纤维化的全新尝试，是在总结自身工作基础上进行的大胆设想与创新。5 年度研究计划及预期研究结果5.1 年度研究计划：略2007.01-2007.052007.06-2008.122008.01-2008.052008.06-2009.102008.11-2009.032009.04-2009.105.2 预期研究成果5.2.1 获得快速、有效和大量合成XXXXXXX和高药物包封率、高配体修饰率的稳定XXXXXXXX的技参数，并合成足量研究相关产物。5.2.2 体外研究证实XXXXXXXX。5.

21、2.3 在体内XXXXXXXXX，有效降低有效剂量、提高疗效和降低副作用。5.2.4 研究证实XXXXXXX可成为抗肝纤维化药物新剂型开发的有效载体。（二）研究基础与工作条件1 研究基础1.1既往肝纤维化防治理论和技术。自1981年以来，我们研究室长期从事肝纤维化防治研究，先后对钙拮抗剂、钙调蛋白拮抗剂、大黄素、激活素、肾素-血管紧张素系统及卵泡抑素等在肝纤维化发生发展中的作用进行了系列的研究，积累了较丰富的理论，掌握了相关研究技术。承担了包括国家自然科学基金在内的各类科研项目20多项，先后获省部级以上科技进步奖10项。1.2粉防己碱抗肝纤维化研究工作积累。项目负责人率先在我国开展钙拮抗剂尤其

22、是中药粉防己碱对肝纤维化防治研究，取得丰富的粉防己碱抗肝纤维化基础和临床研究成果，在国内外期刊发表相关论文50余篇，获省部级以上科技进步奖5项。近两年，我们在上海市教委基金项目“粉防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究（编号02BK14）”资助下完成了小剂量粉防己碱抗肝纤维化效果与机制的研究，在国内外首次报道小剂量粉防己碱可通过影响TGF-Smads信号通路抑制HSC活化，相关研究论文被SCI收录(收录号 IDS Number: 963XN)。该研究为指导粉防己碱在肝纤维化防治中应用有重要价值。（参见申请人简历及附件二、三）1.3生物小分子化学合成及脂质体构建相关工作基础。近四年来，申请人承担并

23、完成了国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究（编号 30170412）”，化学合成了RGD-M6P，分子克隆构建pCI-RGD-Smad7并成功通过脂质体进行基因转染，通过体内外实验观察了RGD-M6P和pCI-RGD-Smad7的生物学效应。细胞及动物学实验均证实pCI-RGD-Smad7和RGD-M6P可减轻ECM沉积，并影响TGF-1和整合素表达强度和分布。主要研究工作由本项目组成员参与并完成。目前我们正在利用基金很少量结余款项进行合成RGD-M6P修饰SSL的工作。得益于此，他（她）们分别熟练掌握了生物小分子的化学合成相关技术（多肽合成、固相化反应、纳

24、米技术、高效分离技术等）、免疫组织与细胞化学技术、RT-PCR和定量PCR、蛋白印迹、高效液相分析、质谱分析、肝纤维化动物模型及生物信息学方法等与本课题相关的关键技术与方法（相关论文参见申请人简历）。由于以上的工作基础，我们拥有丰富的生物分子合成经验，成熟的生物分子构建技术和良好的人员与设备支持。已经构建成功的RGD-M6P及相关技术要领，可直接用于本课题。构思本课题的重要原因之一是探讨解决简单单一药物治疗中发现的诸多问题而开展的，密切相关的细胞学、动物学实验基础也是本实验成功的重要保证。2 工作条件2.1 新华医院消化内科设有校属的上海交通大学医学院消化系疾病第三研究室。实验室拥有本项目研究

25、相关的大部分生化、细胞生物学及分子生物学等方面的各种仪器设备，如倒置显微镜摄影设备、计数仪、CO2培养箱、酶联免疫测定仪、电转膜仪、低温冰箱、低温超速离心机及其它分子生物学设备等。2.2 上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）附属新华医院科研中心与设立在新华医院的“211”工程重点建设单位上海市儿科医学研究所为本项目开展提供了仪器、技术支持和信息服务平台。我们可免费使用相关设备如层流无菌室、质谱仪、高效液相色谱仪、定量PCR仪、NICOMP Particle Sizer Model 3700分析系统、流式细胞仪和Flous-S MultiImage图像分析仪等，新华医院和学院均有SPF级的动

26、物饲养条件。3 申请人简历李定国，男，1946年9月出生。主任医师、研究员、教授和博士生导师。1981年和1989年分别获原上海第二医科大学医学硕士和医学博士学位。现任上海交通大学医学院消化系疾病第三研究室主任、上海交通大学医学院附属新华医院消化内科主任。兼任上海市内科学会委员和上海市消化病学会委员等职。本项目负责人长期从事肝纤维化防治研究，在抗肝纤维化中药筛选与机制研究、生物小分子合成、脂质体药物传递和基因转染、基因重组及基因治疗等方面有丰富研究经验。率先在我国开展钙拮抗剂尤其是中药粉防己碱对肝纤维化防治研究，取得丰富的粉防己碱抗肝纤维化基础和临床研究成果，在国内外期刊发表相关论文50余篇。

27、先后承担包括国家自然基金在内的各类科研项目15项，指导或协助指导博士后、博士生及硕士生70余名，获省部级以上科技进步奖10项。近四年主持了国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究(编号30170412）”和“人卵泡抑素防治肝纤维化的实验研究(编号30170411)”的肝纤维化防治研究工作（以上2项目均已经顺利结题），指导完成上海市自然科学基金项目“Smad7和uPA双基因共表达对实验性肝纤维化的影响(编号03ZR14050)”和上海市教委基金项目“粉防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究（编号02BK14）”。近五年发表的与本课题相关论文（第一作者或通讯作者），其

28、中一篇与本课题设计密切相关的重要论著2005年发表于SCI索引源期刊“Journal of Ethnopharmacology”并被SCI收录（收录号 IDS Number: 963XN）（见附件二、三）： 1 李定国, 陈颖伟。肝纤维化研究现状及展望。上海第二医科大学学报 2005；25(2):101-6。（述评）2 Chen YW, Li DG, Wu JX, Chen YW, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth fact

29、or-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005；100(3):299-305.（论著SCI收录号 IDS Number: 963XN）3 Chen YW, Wu JX, Chen YW, Li DG, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factor-beta signaling. World J Gastroenterol 2005；11(

30、19):2922-6. （论著）4 陈源文, 李定国, 吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱对大鼠肝星状细胞跨膜信号转导的影响。中华肝脏病杂志 2005；13(8):609-10。（论著）5 陈源文, 李定国, 吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱上调Smad7表达抑制大鼠肝星状细胞活化。中国药理学通报 2005；21(5):563-7。（论著）6 王志荣, 陈锡美, 李定国, 魏红山, 黄新, 展玉涛, 汪余勤, 陆汉明。粉防己碱抑制肝纤维化大鼠肝组织c-fos和c-jun mRNA表达。上海医学 2003；26(5):332-6。（论著）7 王志荣, 李定国, 陈锡美, 魏红山, 黄新,

31、展玉涛, 徐芹芳, 陆汉明。联合应用粉防己碱与甘草酸抗肝纤维化的实验研究。中华消化杂志 2003；23(7):435-6。（论著）8 王连升, 陈颖伟, 张建华, 李定国, 陆汉明。RGD-M6P对原代肝星状细胞的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):112-5。（论著）9 杜学亮, 陈颖伟, 王连升, 徐芹芳, 李定国, 吴真。人工合成RGD小肽对肝星状细胞付泌细胞外基质的影响。放射免疫学杂志 2004；17(6):433-5。（论著）10 程计林, 周欣, 高志刚, 霍玉青, 徐芹芳, 李定国。外源性转化生长因子1与小鼠肝细胞Smad7 mRNA及蛋白表达的关系。中华医学杂志

32、2002；82(2):111-3。（论著）11 陈源文, 吴建新, 李定国, 陆汉明。转化生长因子-与转基因治疗肝纤维化。中华消化杂志 2002；22(10):621-3。（综述）12 程计林, 周欣, 李定国, 魏红山, 黄新, 王志荣, 展玉涛, 张晶, 徐芹芳, 陆汉明。RGDS肽对TGF刺激肝星状细胞分泌细胞外基质的影响。临床肝胆病杂志 2001；17(3):173-5。（论著）13 Wei FS, Li DG, Lu HM, Zhan YT, Wang ZR, Hang X, Xu QF. The role of enalapril in pathogenesis of CCL4 i

33、nduced hepatic fibrosis. Journal of Shanghai Second Medical University 2001；13(1):19-23. （论著）14 程计林, 周欣, 李定国, 黄新, 魏红山, 徐芹芳。精-甘-天冬-丝氨酸肽对肝纤维化鼠血清型胶原水平的影响。上海第二医科大学学报 2001；21(3):210-2。（论著）15 陈颖伟, 李定国。 Smad7和组织器官纤维化。上海第二医科大学学报 2005；25(2):132-3。（论著）16 陈颖伟, 陈源文, 王连升, 李定国。 Smad7基因过表达对L02肝细胞株增殖的影响。上海第二医科大学学报

34、2005；25(2):103-6。（论著）17 陈颖伟, 陈源文, 尤汉宁, 李定国。 外源Smad7基因对原代肝星状细胞活性和基因表达调控的影响。中华消化杂志 2005；25(7):409-12。（论著）18 汪余勤, 李定国, 吴建新, 宗春华, 董国芳, 瞿春莹, 陆汉明。 血管紧张素对肝星状细胞表达转化生长因子、型受体及其功能的影响。中华消化杂志 2005；25(7):434-5。（论著）19 Zhou X, Li D, Li X, Lu H, Zhang W. A combination of Ang II and carbon tetrachloride accelerates p

35、rocess of hepatic fibrosis. Chin Med J 2003；116(1):62-5.（论著）20 陈颖伟, 卫新革, 展玉涛, 张文竹, 徐芹芳, 李定国。大黄与粉防己碱抗实验性肝纤维化的对照研究。中华消化杂志 2003；23(8):476-9。（论著）在本课题中负责课题设计、组织实施、质量控制、数据收集整理和统计分析等。陈源文，男，1976年8月出生，博士。2000年毕业于江西医学院临床医学系，获学士学位，同年考入原上海第二医科大学，2005年获内科学博士学位。主要从事肝损伤机制及肝纤维化防治研究。在中药（粉防己碱、氧化苦参碱）抗肝纤维化作用、细胞信号转导、基因转

36、染与基因重组和干细胞研究方面有较丰富的理论基础与研究经历。作为项目负责人完成校基金项目“氧化苦参碱对TGF-信号转导的影响及机制（编号BXJ0215）”研究工作，负责完成上海市教委基金项目“粉防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究（编号02BK14）”，并参与国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究(编号30170412）”的细胞学部分的研究工作。2005年申请国家自然科学基金项目“IL-10 或uPA 基因修饰骨髓源性肝干细胞移植防治肝纤维化的比较研究”获资助（编号30500236）。近期发表的与本课题相关论文如下：1 陈源文, 吴建新, 李定国, 陆汉明。转化

37、生长因子-与转基因治疗肝纤维化。中华消化杂志2002；22(10)：621-3。（综述）2 Chen YW, Li DG, Wu JX, Chen YW, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005；100(3):299-305. （论著）3 Chen YW, Wu JX, Chen YW,

38、Li DG, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factor-beta signaling. World J Gastroenterol 2005；11(19):2922-6. （论著）4 陈源文, 李定国，吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱对大鼠肝星状细胞跨膜信号转导的影响。中华肝脏病杂志 2005；13(8):609-10。（论著）5 陈源文, 李定国, 吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱上调Smad7表达抑制大鼠肝星

39、状细胞活化。中国药理学通报 2005；21(5):563-7。（论著）6陈颖伟, 陈源文, 王连升, 李定国。Smad7基因过表达对L02肝细胞株增殖的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):103-6。（论著）7 陈颖伟, 陈源文, 尤汉宁, 李定国。外源Smad7基因对原代肝星状细胞活性和基因表达调控的影响。中华消化杂志 2005；25(7):409-412。（论著）在本课题中负责HSC分离培养及细胞学实验（主要是配体修饰脂质体对HSC生物学特性影响等）研究工作。刘清华，女，1971年2月出生。副主任医师，副教授。1996年和2003年分别获上海第二医科大学医学硕士学位、医学博士

40、学位。主要研究方向为肝损伤机制及肝纤维化防治。在肝纤维化性别差异细胞分子机制、生物小分子抗肝星状细胞功能研究等领域有较丰富的研究经历。作为课题负责人承担院级基金项目“雌激素防治肝纤维化的实验研究”，参与上海市教委基金项目“粉防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究（编号02BK14）”以及国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究（编号30170412）”细胞学研究工作。近期发表与本课题相关的论文有：1 刘清华, 李定国, 黄新, 尤汉宁, 潘勤, 徐雷鸣, 徐芹芳, 陆汉明。激活素A对肝星状细胞细胞外基质合成的影响。世界华人消化杂志 2003；11(6): 745-

41、8。（论著）2 刘清华, 李定国, 宗春华, 黄新, 徐芹芳, 陆汉明。17-雌二醇及代谢产物对大鼠HSC功能的影响。中华消化杂志 2004；24(5): 165-9。（论著）3 Qing-Hua Liu, Ding-Guo Li, Xin Huang, Chun-Hua Zong, Qin-Fang Xu, Han-Ming Lu. Suppressive effects of 17-estradiol on hepatic fibrosis in CCl4-induced rat model. World J Gastroenterol 2004; 10(9): 1315-20. （论著）

42、4 刘清华, 李定国, 宗春华, 黄新, 徐芹芳, 陆汉明。雌激素对雄性大鼠肝纤维化形成的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(1): 39-42。（论著）在本课题中参与细胞学实验（主要是配体修饰脂质体对HSC生物学特性影响等）研究工作。兰玲，女，1976年11月出生。硕士。2000年毕业于河南医科大学临床医学系，获医学学士学位，2003年毕业于郑州大学医学院，获医学硕士学位，硕士期间主要从事食管癌高发区人群食管癌变机制和防治研究。现在上海第二医科大学攻读博士学位，从事干细胞研究工作。近期发表论文4篇。在本课题中参与受体调节载药脂质体构建与细胞学功能分析。陈颖伟，女，1974年2月出生。

43、博士，主治医师。1999年和2004分别获原上海第二医科大学获医学硕士和医学博士学位。主要从事肝纤维化防治研究。在中药（大黄素、粉防己碱）抗肝纤维化机制、HSC细胞信号转导、生物小分子化学合成、纯化与鉴定和重组腺病毒构建与基因转染等方面有较丰富的理论与研究经验积累。在攻读硕士学位期间参与“大黄素抗肝纤维化作用研究”、“PDGF在肝纤维化发病机制中的作用研究”等课题研究。攻读博士学位及工作期间参与上海市科学技术发展基金课题“肝星状细胞信号传导网络新的调控分子”的研究工作，负责完成国家自然科学基金“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究(编号30170412)”的关键部分工作，作为项目

44、负责人承担上海市自然科学基金项目“Smad7和uPA双基因共表达对实验性肝纤维化的影响(编号03ZR14050)”（该项目已经顺利结题）。近期发表的与本课题相关论文：1陈颖伟, 卫新革, 展玉涛, 张文竹, 徐芹芳, 李定国。大黄与粉防已碱抗实验性肝纤维化的对照研究。中华消化杂志 2003；23(8)：476-9。（论著）2陈颖伟, 展玉涛, 李定国。单味生大黄对肝纤维化的影响。中国中西医结合杂志 2004；24(6)：110-3。（论著）3陈颖伟, 胡良凯, 陈源文, 李定国。新型Smad7重组腺病毒载体的构建。上海第二医科大学学报 2004；24(6)：417-20。（论著）4陈颖伟, 陈

45、源文, 尤汉宁, 李定国。外源Smad7基因对原代肝星状细胞活性和基因表达调控的影响。中华消化杂志 2005；25(7):409-12。（论著）5陈颖伟, 陈源文, 王连升, 李定国。Smad7基因过表达对L02肝细胞株增殖的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2)：103-6。（论著）6王连升, 陈颖伟, 张建华, 李定国, 陆汉明。RGD-M6P对原代肝星状细胞的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):112-5。（论著）7 杜学亮, 陈颖伟, 王连升, 徐芹芳, 李定国, 吴真。人工合成RGD小肽对肝星状细胞付泌细胞外基质的影响。放射免疫学杂志 2004；17(6):4

46、33-5。（论著）在本课题中主要负责RGD-M6P及相关分子合成、受体调节载药脂质体的体外结合实验。王连升，男，1976年8月出生。硕士。2001年毕业山东医科大学，获学士学位，同年考入原上海第二医科大学，2004年获硕士学位。主要从事抗肝纤维化生物小分子化学合成、纯化鉴定和功能研究。在小肽合成分离与质谱分析、糖肽合成、纯化、质谱与高效液相分析和载药配体调节脂质体等方面有较丰富的理论基础与研究经历。主要参与了国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究(编号30170412）”的RGD相关缀合分子化学合成与体内、体外功能研究部分工作。近期发表的与本课题相关论文： 1

47、 王连升, 李定国。TGF及Smad与肝纤维化。国外医学·消化系疾病分册，2003；23（4）：222-5。（综述）2王连升, 陈颖伟, 张建华, 李定国, 陆汉明。RGD-M6P对原代肝星状细胞的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):112-5。（论著）待发表论著：1 Wang LS, Chen YW, Li DG, Lu HM. RGD-M6P Inhibits the activation and proliferation of hepatic stellate cells in vitro. World J Gastroenterol 2006 (in pres

48、s, Ms. NoWjg/2005/002566) 在本课题中主要负责RGD-M6P及相关缀合分子合成、纯化、质谱与高效液相分析，以及受体调节载药脂质体构建和物理性质检测。孙巧玲，女，1976年9月出生。硕士。2000年毕业于大连医科大学临床医学系，获学士学位，2003年毕业于大连医科大学，获医学硕士学位，硕士期间主要从事基质金属蛋白酶在食管癌中表达的研究。现在上海第二医科大学攻读博士学位。近期发表论文1篇。在本课题中负责动物实验与分子生物学检测实验。丁小东，男，1977年7月出生，2000年毕业于白求恩医科大学（现吉林大学白求恩医学部）临床医疗系，获医学学士学位。2003年毕业于复旦大学上海

49、医学院内科学专业，获临床医学硕士学位。一直从事慢性肝病，尤其是脂肪性肝病的研究工作，在肝损伤动物模型制作及药物防治研究方面的较丰富的研究经历。20002003年参加上海市科技启明星计划课题“微血栓在非酒精性脂肪性肝炎发病中作用”的研究，发表学术论文和专著17篇。近期发表的与本课题相关的论文有： 1丁晓东, 范建高, 王国良, 徐正婕, 郑晓英, 田丽艳。二甲双胍干预大鼠非酒精性脂肪性肝炎的疗效观察；肝脏2005；10;(3):79-81。2 丁晓东, 范建高, 徐正婕, 郑晓英, 田丽艳, 王国良。高脂饮食性脂肪性肝炎大鼠肝脏线粒体损伤和ATP储备改变。世界华人消化杂志2005；13(13):

50、1524-8。3范建高、丁晓东、王国良、徐正婕、郑晓英、田丽艳。非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏UCP2表达及其与能量贮备的关系；中华肝脏病杂志2005；13(5):374-7。4范建高、丁晓东、王国良、徐正婕、郑晓英、田丽艳。高脂饮食性非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏PPAR-表达增强。肝脏2004；9(4):225-8。在本课题中负责动物学实验（药代动力学、造模）与分子生物学检测。张毅，男，1978年11月出生。硕士。2004年毕业于上海第二医科大学，获医学硕士学位。现为上海第二医科大学附属新华医院消化内科医师，从事临床与肝纤维化防治科研工作。发表论文1篇。在本课题中负责动物实验及病理检测。徐琴芳，女

51、，1954年2月出生。主管技师，为消化实验室专职技术员，从事细胞、分子生物学实验相关工作十余年。在本课题中负责生化、病理检测。4 承担科研项目情况目前在研项目名称：IL-10 或uPA 基因修饰骨髓源性肝干细胞移植防治肝纤维化的比较研究，编号30500236，由国家自然科学基金委员会资助。计划2006年1月起至2008年12月止，经费25.0万元。项目组主要成员陈源文为项目负责人，陈颖伟、张毅等参与部分工作，包括uPA腺病毒感染骨髓源性肝干细胞效率、转基因干细胞生物学特性变化的细胞学实验和转uPA基因干细胞移植的肝纤维化防治作用的部分动物学实验等。本项目得益于一定的前期工作基础和自申请初即开始

52、相关研究，目前项目进展顺利，已经完成病毒构建、uPA腺病毒感染骨髓源性肝干细胞效率、实现外源基因在干细胞中表达，正在准备进行转基因干细胞移植的动物学研究。5 完成自然科学基金项目情况国家自然科学基金项目：RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究（编号30170412，起止年月：2002年1月-2004年12月）。项目已于2004年12月顺利完成和结题。通过该项目研究工作，采用化学法合成了新型生物分子RGD-M6P，并研究了其抗肝纤维化功能。结果发现肝硬化时存在TGF-、整合素、Smad7信号分子分布和功能异常，RGD-M6P可影响TGF-和整合素表达强度和分布，减轻ECM沉积。动物实

53、验证实还RGD-M6P抗肝纤维化作用优于RGD、M6P或RGD与M6P简单混合，提示RGD-M6P存在良好的靶向性。在此工作基础上，进一步进行了干预TGF-Smad7信号通路抗肝纤维化的研究：成功构建携外源Smad7基因腺病毒、Smad7与uPA共表达腺病毒，并进行了肝纤维化转基因治疗研究；研究了小剂量粉防己碱抗HSC活化与TGF-Smad7信号通路关系；目前尝试开展利用RGD-M6P小分子实现HSC靶向和与其它药物协同多途径抗HSC活化和功能的研究。基与以上国家自然科学基金项目研究基础和系列相关后续研究，在提高药物靶向性、多靶点协同作用思想指导下，设计了RGD-M6P小分子介导粉防己碱脂质体

54、抗肝纤维化的研究工作。本研究是建立在以往研究基础上的又一大胆探索与尝试。由于以上的工作基础，我们拥有丰富的生物分子化学经验，成熟的分子生物学技术、较好的长循环脂质体构建技术基础和良好的人员与设备支持。已经构建成功的RGD-M6P已经经过功能检测，可直接用于本课题。密切相关的细胞学、动物学实验基础也是本实验成功的重要保证。（相关内容参见申请人简历和该项目研究工作总结摘要）附：该项目研究工作总结摘要和相关成果的目录搞要：目的：研究RGD经M6P修饰或缀合Smad7基因对HSC生物功能和实验性肝纤维化的影响。方法：化学合成RGD-M6P；分子克隆构建pCI-RGD-Smad7；通过体内外实验观察RG

55、D-M6P和pCI-RGD-Smad7的生物学效应。结果：与TGF1组相比，RGD-M6P组HSC上清中PC含量显著降低，-SMA表达明显减低；与CCl4模型组相比，RGD-M6P组胶原面积比例显著减小，肝功能指标明显改善，血清PC含量显著降低，且优于RGD和M6P组；pCI-RGD-Smad7组HSC上清III型胶原水平明显低于对照质粒pCI组；免疫组化显示，肝纤维化时大鼠肝组织中TGF1和整合素表达增强，Smad7表达则降低；pCI-RGD-Smad7基因治疗组大鼠肝组织Smad7表达增强，TGF1和整合素表达均显著降低；HE和VG染色显示，pCI-RGD-Smad7基因治疗组肝组织纤维化

56、程度较模型组明显减轻。结论：肝硬化时存在TGF、整合素、Smad7信号分子分布和功能异常。pCI-RGD-Smad7和RGD-M6P可减轻ECM沉积，并影响TGF1和整合素表达强度和分布。成果目录：1 程计林, 周欣, 高志刚, 霍玉青, 徐芹芳, 李定国。外源性转化生长因子1与小鼠肝细胞Smad7 mRNA及蛋白表达的关系。中华医学杂志 2002；82(2):111-3。2 杜学亮, 陈颖伟, 王连升, 徐芹芳, 李定国, 吴真。入工合成RGD小肽对肝星状细胞付泌细胞外基质的影响。放射免疫学杂志 2004；17(6):433-5。3 陈颖伟, 陈源文, 尤汉宁, 李定国。外源Smad7基因对

57、原代肝星状细胞活性和基因表达调控的影响。中华消化杂志 2005；25(7):409-12。4 王连升, 陈颖伟, 张建华, 李定国, 陆汉明。RGD-M6P对原代肝星状细胞的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):112-5。5 陈颖伟, 李定国。Smad7和组织器官纤维化。上海第二医科大学学报 2005；25(2):132-3。6陈颖伟，胡良凯，陈源文，李定国。新型Smad7重组腺病毒载体的构建。上海第二医科大学学报 2004；24(6)：417-20。7陈颖伟，陈源文，王连升，李定国。Smad7基因过表达对L02肝细胞株增殖的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2)：103-6。8 程计林, 周欣, 李定国, 魏红山, 黄新, 王志荣, 展玉涛, 张晶, 徐芹芳, 陆汉明。RGDS肽对TGF刺激肝星状细胞分泌细胞外基质的影响。临床肝胆病杂志 2001；17(3):173-5。（三）经费申请说明详见经费申请表。（四）其他附件清单附件一 查新报告（扫描件略）附件二 论著“Tetrandrine inhibi