The Promise of Stem Cell Research in Pigs and Other Ungulate Species

1、The Promise of Stem Cell Research in Pigs and Other Ungulate Species摘要：经过近二十年的努力仍未成功建立包括牛、猪在内的有蹄类动物的胚胎干细胞系，只在啮齿类和灵长类动物中成功获得真正意义上的胚胎干细胞（embryonic stem cells ,ESC）。虽然有很多关于其它物种的类胚胎干细胞的报道，但这些细胞系的获得都是依赖于小鼠和人的分离方法，细胞系不具备在体外自我更新的能力，并且其全能性也并未得到认证。由于有蹄类动物在胚胎植入前胚胎发育的特殊性以及缺乏内细胞团(inner cell mass ,ICM)和外胚层的特异性标记

2、物，这都为有蹄类动物胚胎干细胞系的建立增加了难度。对于包括生长因子等的培养体系的选择尤其重要。最近通过在原来的培养条件下添加特殊的蛋白酶抑制剂，成功分离获得了大鼠和之前非允许的小鼠品系的胚胎干细胞。新改良的培养系统使得细胞依赖于LIF信号通路，稳定了维持多能性的生物化学网络。此外，最近已经成功诱导出猪的诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cells ,iPS），将其方法用于其它物种有助于推进该领域的研究进展。猪作为检测多能性干细胞用于临床的安全性的生物医学的模式动物具有重要的价值，因此猪多能性细胞系的建立是非常必须的。前言：1981年Evans和Kaufman首

3、次从受精3.5d的小鼠胚胎成功分离获得胚胎干细胞1-2。之后发现从早期卵裂期胚胎的全能卵裂球同样可以建立ESC系3-4。约15年后研究人员成功获得猴5、人6-8的ESCs系。这些细胞系的相继建立归功于培养条件的改善，使其更适用于灵长类动物。有研究发现从绵羊和猪的外胚层分离获得的细胞可以分化形成包括心肌细胞在内的多种不同的细胞类型，但作者并没有验证这一发现的重要性9。有人尝试从猪囊胚的内细胞团分离胚胎干细胞，但并没验证获得的细胞是否具有多能性、是否能长期生长10。继二十世纪90年代灵长类ESCs系的建立以来，研究人员相继获得了具有部分多能性的绵羊11、仓鼠12、狗13、猫14、貂15、兔16、马

4、17、牛18-19、猪10,20,21ESCs。成功建立大鼠的ESCs22-23。所有其它物种的类ESC细胞不符合干细胞的标准。ESC的两大特征：一，在特定的条件下能够无限增殖；二，具有多能性，能够分化形成包括外胚层、中胚层、内胚层三胚层的任意细胞24-25。利用ESC在体外长期培养的特性，ESC可以作为研究驱动细胞分化及衰老的稳定的细胞模型26。ESC的多能性可用于再生医学的研究。此外，小鼠ESC能够在体外无限增殖，通过同源重组技术对mESC进行基因敲除或敲入，有利于突变细胞的筛选，将突变体与受体囊胚结合产生嵌合体小鼠，同时将突变基因在种系间进行传递，这对于转基因领域的研究具有革命性的意义2

5、7-28。家养有蹄类动物包括猪、绵羊、山羊、牛、马ESCs的建立对于农牧业发展以及生物医学的应用具有重要的意义。例如大动物特别是像猪这种单胃的适用于研究人类基因疾病的动物模型，而啮齿类则不合适29。能够持续增殖且保持正常核型，可用于基因敲入或敲除的模型，可以提高对商品化的物种进行基因修饰的效率，提高产量。在体细胞核移植技术（SCNT）中，利用未分化的细胞要比分化的细胞进行核移植的重编程的效率高，因此ESCs在SCNT的应用中同样占据一定的优势30。有蹄类动物ESCs最大的益处可能在于移植方面的研究。为探讨hESC的全能性或其替代物诱导多能干细胞（iPSC），在用于移植前，对于这些细胞的安全性和

6、效力以及移植的方法都应测试充分。鉴于小鼠不适合作为受试模型，应寻找其它物种。像猪或牛其自身以及其器官大小在解剖学、生理学以及寿命上比小鼠的更接近人类，因此猪或牛更适于移植生物学的动物模型。本研究涉及到有蹄类动物ESCs研究的意义、存在的问题以及发展前景。近二十年有大批研究人员致力于牛和猪ESCs的研究。有蹄类动物ESCs研究（进展）现状Evans等利用猪体内7-9天扩展囊胚第一次建立了猪胚胎干细胞系（pESC）20。pESC在STO饲养层上能维持生长一年多并能形成类似于类胚体的细胞簇，但不论是pESCs还是细胞簇内分化形成的细胞都不能精确的定义。pESC具有碱性磷酸酶活性但无波形蛋白，而细胞簇

7、内形成的胚层也只是停留在形态特征的层面上31。Piedrahita等人几乎在同一时间从猪体内7-8天囊胚内细胞团利用免疫外科法分离获得pESC21。同样建立了一些类ESC细胞系或上皮样的ESCs。这些类ESC细胞最多传至第10代，上皮样的ESCs能传至42代。有趣的是这些上皮样的ESCs可以在体外形成由极化的上皮细胞组成的囊状聚集物，这表明此聚集物并不是真正意义上的类胚体，而类ESCs不具备体外分化能力。相继出现尝试利用不同时期胚胎分离ESCs，包括4-6细胞期，桑椹胚期32，第5-6天胚胎33以及第9-12天胚胎34-35和将要孵化的扩展囊胚，但都未成功。值得一提的是，猪第6-7天囊胚的IC

8、M能够形成嵌合体37，说明此时期的ICM具有多能性是获得ESCs的潜在来源。但事实上，这些细胞在体外培养一段时间后其多能性会丢失。与猪ESCs的研究一样，大多数研究人员都是从牛囊胚分离培养ESCs18,38-43。除此之外，X等人利用第12-14天已形成胚盘的胚胎试图获得，同样以失败告终44。一些尝试从受精卵或早期卵裂期胚胎分离bESC都失败19,45，X等从牛胚胎2细胞期获得的细胞系在体外培养近3年45，X等从牛胚胎16细胞阶段分离获得的细胞系在体外培养9个月之多18-19。所有这些细胞系虽然能够形成类似类胚体的结构，但不能形成畸胎瘤，说明细胞系的分化潜能具有局限性。尽管没有得到真正意义上的

9、ESCs，但研究获得的牛和猪的ESCs在体外能够维持一定阶段的增殖，有的能够分化形成类似类胚体和畸胎瘤的结构33,46。并且X等人利用pESC制备了嵌合体，虽然不是生殖系嵌合32。一些从猪原生殖细胞分离获得的ESC具有嵌合能力，但同样不能通过生殖系传递47-50。得出一致的结论是所有的这些细胞系都不具有多能性，不是真正意义上的ESC51-52。在分离获得的方法或培养体系上可能有些问题还没有考虑到34,51-52。农场动物多能性细胞系建立存在的困难根据现有的报道，虽然能够从猪和牛的胚胎获得类ESC的克隆，但受到外部和内部的多种因素的影响，这些细胞系都不能在体外进行长期培养。最近有很多研究中提到了

10、这些影响因素34,51-52。内部因素1. 发育能力Evans等人成功建立小鼠胚胎干细胞系后尝试分离猪ESCs以失败告终10,20。之后也只是在一些特定的近交系小鼠品系如129和C57BL/6小鼠中建立ESCs53。在其他近交系或远交系小鼠品系中分离ESC要更困难一些54-55。此外，只是在其他两个物种中成功分离获得真正意义上的ESCs，即猴子和人，这些细胞系的获得改变了传统的培养条件5-6。2. 胚胎着床前发育生物学的差异小鼠和有蹄类动物的早期胚胎发育不遵循相同的时间和路径。小鼠中，第3.5天胚胎期发生第一次分化事件，形成ICM和TE。第3.5-4.5天胚胎的内细胞团底部形成原始内胚层或胚外

11、内胚层细胞，最终将衬于整个囊胚腔排成一行。小鼠胚胎形成三胚层细胞经历的时间要比其它物种短很多。人56,猪和牛57-59囊胚的形成以及孵化都比小鼠要晚几天。小鼠胚胎第5.5-6.5天时内细胞团迅速增殖并形成上胚层60，将来产生胚胎的三胚层细胞。上胚层维持的时间很短，第6.5天形成原肠胚。对有蹄类动物而言，在胚胎孵化之前，ICM与TE相比较小，第6天时出现上胚层，与小鼠相比上胚层能维持较长时间。在猪约第10天胚胎和牛第12天牛胚胎时，覆盖于上胚层的极化的滋胚层细胞（Rauber layer）发生退化，使得上胚层充分暴露于子宫腔内，并直接侵入子宫上皮62-63。Rauber层的消失伴随着胎体开始迅速

12、的长大。例如猪，第10天时，直径8-10mm的球状囊泡的扩展囊胚开始延伸为长约1米的丝状胚胎64-65。这一胚胎延伸和重组的过程涉及到滋养层和胚外内胚层且不包括上胚层，并且可能也反映出孕体对胚胎着床前的准备工作，包括增加其表面积，获得来自子宫母源性分泌物的营养支持。然而，对于小鼠，在受精后4.5天滋胚层开始入侵子宫内膜，而有蹄类动物在第12-14天才开始着床，在第17-19天猪胚胎完全着床，而牛胚胎完全着床发生在第19-20天。总之，对于牛和猪而言，不像小鼠或人，其胚胎在着床前要经历一段与滋养层相关的胚胎延伸期并且胚胎的生长也发生滞后。因此，难以确定合适的胎龄用于猪或牛ESCs的建立。3. 缺

13、乏真正意义上的多能性细胞标记物与小鼠相比，对于有蹄类动物的早期胚胎发育及伴随谱系决定发生的分子事件知之甚少。用于鉴定啮齿类和灵长类物种的多能性的因子和细胞表面标记抗原对于有蹄类动物并不奏效。例如，OCT4蛋白在有蹄类动物的TE中较小鼠中表达的时间较长66-68。牛TE和上胚层中都有NANOG蛋白的表达39，对于SOX2转录本是否局限表达于牛和猪的多能性孕体中仍存在怀疑69-71。有研究发现SOX2和NANOG蛋白至少表达于一个猪滋养层细胞系中72。除了转录因子外，特定的细胞表面标记抗原在鉴定ESC的多能性上同样占据重要的地位。牛中，表面标记物SSEA1，-3和-4，TRA-1-60以及TRA-

14、1-80表达于ICM和TE39。但在猪和山羊中SSEA1和4的表达不是特异性的68。以上数据更加说明了啮齿类和灵长类在着床前生物学上与有蹄类动物相比其差异性存在的重要性。对于特定的物种建立的体系在一些情况下并不适用于所有的物种。毋庸置疑应该寻求一更广泛的用于区别有蹄类动物ESCs的标记物，不需要与那些小鼠或人的鉴定标准相一致42.73。外部因素1. 细胞类型发生污染完整胚胎培养在分离细胞时除了ICM外同样可能会混入TE以及原始内胚层细胞。即使为除掉TE细胞通过免疫外科技术将胚盘进行剥离，但还会有可能夹杂内胚层以及少量的TE细胞。分离得到的ICM或上胚层细胞在体外进行培养时，混入的其它细胞具有与

15、ICM相当的增殖速度，甚至比ICM或上胚层细胞的速率还要高以至于占据主导地位42,74-77。所以建立ESC细胞系时，在缺乏标记细胞多能性的专有标记物的情况下，这种普遍存在的细胞类型污染问题进一步增加了鉴定所得到的细胞群落的多能性的难度。2. 培养条件a） 同源或异源的饲养层细胞：经历屡次失败后，研究人员将目光转移到饲养层细胞上，大家开始怀疑异源饲养层细胞例如STO和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）是否适用于有蹄类动物ESC建系的培养51,78-79。小鼠和农场动物存在一定的进化距离，由细胞分泌的因子与有蹄类动物的受体的结合不如与小鼠的效果好，因此不能像mESC一样支持uESC的自我更新。然而不论

16、是猪胚胎成纤维细胞33,80-81还是猪子宫细胞35,82能够促进pESC的增殖并不分化。也许其它的细胞作为饲养层其效果会好一些，但目前并没有相关方面的研究。但是有研究发现灭活的MEF能够充分维持猪诱导多能性干细胞的生长83-85，这说明不论是小鼠细胞分泌的生长因子的类型还是其与猪或其它有蹄类动物受体的亲和性对于细胞多能性维持方面都存在着局限性。同样需要强调的是，很多尝试建立uESCs的研究都没用描述所用的饲养层细胞的密度。对饲养层细胞密度的选择与选择饲养层细胞类型同样是至关重要的。所以确定最佳的饲养层细胞类型以及其最适密度对于将来uESCs的建立非常关键。最后，同样需要确定那些能够促进uES

17、Cs的增殖并能维持其多能性的生长因子以及小分子物质。b） 对于生长因子的需求（LIF与FGF2）：在ESC研究中很大的困扰来源于对于生长因子的选择。近来有研究发现mESC和hESC对生长因子的需求不同，而且小鼠ICM分离得到的ESC与上胚层分离得到的ESC在生长因子的需求上也不同86-87，这都促使人们不得不考虑该如何选择适于uESC的生长因子。在饲养层的基础上，从小鼠ICM分离获得的ESC依赖于LIF，而来源于囊胚的hESC依赖于FGF2（bFGF）来共同维持细胞的增殖及其多能性。LIF用于不同胎龄的胚胎分离uESC，包括紧缩前囊胚、孵化囊胚、延长的囊胚，但都没有效果，也许在其它。例如，人L

18、IF对于牛的ESC和着床前胚胎的生长是有害的88-89，但小鼠的LIF其效果较好，这种不同的结果引起人们的思考，关于小鼠LIF是否是通过结合牛中的受体而发挥作用的89。另一方面，当提高使用浓度时，人的LIF能够促进第10天猪胚胎的生长，但仍不能阻止pESC的体外分化81。不论LIF因子是否有效，都应该避免在孵化囊胚或延长囊胚时期分离ESC，因为此时胚胎正处于从多能性的ICM像多能性上胚层转化的初期，甚至已经完成了分化事件。重要的是，即使在小鼠中，上胚层干细胞干性的维持仍然需要FGF2细胞因子86-87，这表明目前所获得的大部分甚至所有的干细胞系都属于上胚层干细胞类型。在这方面，第11天猪胚胎的

19、上胚层中，编码FGFR1和FGFR2甚至是FGF2本身的基因具有相对较高的表达量，但几乎没有检测到LIF和LIFR的转录本61。虽然已经证实至少有两条信号转导通路同时发挥作用以维持不同类型的多能性细胞，但仍没有完全弄清楚小鼠和人中维持ESC的多能性的基因表达网络。这些信号通路在有蹄类动物体系中也有可能维持细胞的多能性，如果这些通路能够适当的被激活，将有利于uESC细胞系的成功分离和获得。未来发展方向1. 新技术及发展前景成功分离获得大鼠的胚胎干细胞系是干细胞生物学中的一大进步22。X等人在含LIF培养基的基础上另外添加了两种蛋白酶抑制剂，PD0325901(PD)和CHIR99021(CH)。

20、其中PD能够抑制细胞分裂素活化蛋白激酶(ERK)信号通路，CH能够激活糖原合成激酶3(GSK3)。得到的ESCs的多能性在体内和体外都经过了验证，并且能够产生生殖系嵌合体。Hanna90等人利用类似的方法获得了非肥胖型糖尿病鼠系NOD的LIF依赖的ESCs，而在这之前NOD鼠系被认为是不被允许的鼠系。一般有两种方法成功分离获得ESCs：异位上调c-MYC和KLF4的表达；通过在mESC培养基的基础上添加小分子化合物来激活调控c-MYC和KLF4表达的信号通路90(图1)。X等人利用小分子化合物CH抑制GSK3的活性，进而上调Wnt信号通路，以此来模拟异位表达c-MYC蛋白的作用；另外一种化合物

21、KP，是GSK3和细胞周期蛋白CDK1/B的选择抑制剂，能够代替KLF4蛋白的功能92。Hanna90等人通过添加两种不同的小分子化合物组合，分别是PD/CH和KP/CH(图1和2)，成功分离获得依赖LIF/Stat的NOD品系小鼠ESC。NOD-ESC与129小鼠品系的ESC形态相似，并能够产生嵌合体。一些其它的小分子化合物能够促进或稳定ESC的多能性或自我更新。读者可在Feng等的报告中得到更详细的信息93。这些改良的方法可能会对有蹄类动物或其它物种ESC的建立提供一种新的思路。与允许型的129品系小鼠相比，有蹄类动物和其它物种的ICM中内源性c-MYC和KLF4的表达水平要低(图2)。除

22、非提高这些转录因子的浓度，否则无法分离获得大鼠或有蹄类动物的ESC，或不能促进其生长。即使形成了ESC，其表现为上胚层类型，例如人的ESC就是依赖于FGF2/Activin/Nodal而不是LIF信号通路(图2)。希望能够通过添加适当的小分子化合物例如KP/CH来提高内源性c-MYC和KLF4的表达量上调并稳定LIF/Stat信号通路进而维持ESC的生长(图2)。小鼠中KLF4是LIF/Stat信号通路下游的信号肽中间产物,这进一步支持了这一说法94。我们推测利用这些方法或将其进行改良，在不久的将来能够成功建立有蹄类动物的ESCs。2.干细胞的替代物-诱导多功能干细胞(iPSC)虽然通过改良培

23、养条件仍不能成功获得uESC，iPSC提供了一种非常有用的替代ESC的方法。Takahashi和Yamanaka95通过逆转录病毒将四个转录因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC共同转入体细胞，在四个因子的共同作用下诱导体细胞进行重编程，成功获得小鼠诱导多能性干细胞(miPSC)，在此之后此领域的进展非常迅速。人们在此基础上不断的改良创新，尝试利用不同的转录因子的组合，提高重编程的效率，使其在移植生物学领域中的应用更高效更安全。已经应用于成体细胞、胎儿体细胞以及已分化的非成纤维细胞中95-106。近年来，已经在猴子107、大鼠108和猪83-85中成功分离获得iPSC。最近有报道称，mi

24、PSC能够形成ICM并能产生后代，证实iPSC接近于ESC的多能性性质109-110。诱导多功能干细胞与胚胎干细胞一样，在生物医学和农业研究中具有很大的应用前景。iPSC能够提高基因组基因敲入和基因敲除的效率，具有生殖系嵌合能力，而且可高效的用于SCNT30。此外，iPSC在人类移植应用中可能比ESC更具优势，特别是iPSC能够产生病人特异的干细胞。对于一些体细胞，例如皮肤角质化细胞，可以通过皮肤活检进行快速培养，约几个星期内诱导成iPSC。iPSC可以向特异的组织谱系方向诱导，例如从供体中分离获得祖细胞，将其诱导生成心肌细胞或特殊的神经元前体细胞，并将其移回供体中最大限度的降低免疫排斥的风险

25、。然而，利用ESC或iPSC进行移植治疗，到目前为止还不能做到零风险，必须要保证的是移植的细胞在体内不会形成包括畸胎瘤在内的肿瘤，并且保证不会引起强烈的免疫反应。同时必须要求高效并特异的植入方式，保证植入的细胞能够正常发挥作用。在干细胞技术应用于临床之前需对其进行全面的动物实验以保证其安全性。由于小鼠的体型大小以及在解剖学、免疫学、生理学以及寿命上的特征与人类相差较大，因此不能作为常规细胞安全性检测的动物模型。鉴于成本的考虑也不大可能用非人类的灵长类动物作为检测模型，因此猪是最好的模式动物的选择。几乎同时发布的三份报告都报道了成功分离获得猪的诱导多能性干细胞83-85，这有可能成为猪作为模式动物用于移植生物学研究领域的重要的里程碑30。三个实验室都是利用同样的方法，利用逆转录病毒将OSKM四个因子同时转入猪成纤维细胞从而驱动细胞的重编程诱导产生多功能干细胞。这些piPSC在表型上并不相同，至少其表面标记物是不同的(表1),与小鼠ESC相比更接近于人的ESC，并且依赖于FGF2细胞因子和灭活的MEF饲养层来维持细胞的干细胞特性。由饲养层MEF分泌的细胞因子包括激动蛋白和nodal蛋白，与FGF2因子共同作用维持人ESC和iPSC的多能性并阻止其分化。本实验室目前正在验证是否能通过LIF因子并选择性添加蛋白酶抑制剂来分离获