3酶的分离纯化2

1、是利用混合物中各组分的物理化学性质（分是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分和力和分配系数等）的不同，使各组分在两在两相中的分布程度不同而达到分离。相中的分布程度不同而达到分离。层析分离中一个相是固定的层析分离中一个相是固定的, ,称为固定相称为固定相; ;另一个相是流动的另一个相是流动的, ,称为流动相称为流动相; ;各组分移动速度步同各组分移动速度步同, ,使不同组分分纯化使不同组分分纯化; ;层析分离设备简单层析分离设备简单, ,操作容易操作容易; ;层析分离层析分离层析柱层析柱

2、层析方法分离依据层析方法分离依据吸附层析吸附力不同吸附层析吸附力不同分配层析各组分在两相中分配系数不同分配层析各组分在两相中分配系数不同离子交换层析离子交换剂上解离基团对离子亲和力不同离子交换层析离子交换剂上解离基团对离子亲和力不同凝胶层析各组分相对分子量不同凝胶层析各组分相对分子量不同亲和层析生物分子与配基间专一又可逆亲和力亲和层析生物分子与配基间专一又可逆亲和力层析聚焦等电特性与离子交换层析特性结合层析聚焦等电特性与离子交换层析特性结合一个相中的物质在两相界面上密集现象称为吸附；一个相中的物质在两相界面上密集现象称为吸附；利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及利用固定相的固体吸

3、附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。吸附产生原因：固体表面分子与固体内部分子受的作用力吸附产生原因：固体表面分子与固体内部分子受的作用力不同；主要是范德华力。不同；主要是范德华力。特点：特点：适合分离不同种类的化合物适合分离不同种类的化合物( (醇类和芳香烃）。醇类和芳香烃）。不同物质吸附力、解析力不同，移动距离不同，而分离。不同物质吸附力、解析力不同，移动距离不同，而分离。吸附层析法吸附层析法:利用吸附剂对不同物质的吸附利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中各组分分离。力不同，而使混合液中各组

4、分分离。（液（液-固色谱法，固色谱法，lsc）吸附层析原理吸附层析原理吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离物质的极性官能团作用。物质的极性官能团作用。常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等石等; ;常用于酶分离纯化的：硅藻土、氯化铝、磷酸常用于酶分离纯化的：硅藻土、氯化铝、磷酸钙、羟基磷灰石、活性碳。钙、羟基磷灰石、活性碳。羟基羟基磷灰石（羟基羟基磷灰石（haha）caca1010(po(po4 4) )6 6.(oh).(oh)2 2,可用于可用于分离蛋白质与核酸。分离蛋白质与核酸。其表

5、面有其表面有caca2+2+和和popo4 43-3-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与caca2+2+结合；碱性蛋白质可与结合；碱性蛋白质可与popo4 43-3-结合。结合。haha柱层析最重要的用柱层析最重要的用途之一是分离单链途之一是分离单链dnadna和双链和双链dnadna，因为它对双链因为它对双链dnadna的亲和的亲和力大于单链力大于单链dnadna。吸附剂吸附剂分配层析法（液分配层析法（液-液层析法，液层析法，llc）原理：原理：利用混合物在两种不相混溶的液相利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同（固定相和流动相

6、）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。覆盖于载体表面，流动相流过固定相。原理原理: :根据离子交换树脂对需要分离的各种离子根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。的亲和力不同而达到分离的目的。酶是两性物质，当溶液的酶是两性物质，当溶液的phph值大于酶的等电点值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离，反之，用阳离子交换剂。层析分离，反之，用阳离子交换剂。离子交换树脂：离子交换树脂：大孔径离子交换树脂大孔径离子交换

7、树脂。离子交换纤维素：离子交换纤维素：deae-deae-纤维素，纤维素，ae-ae-纤维素，纤维素，cmccmc（羧甲基纤维素）羧甲基纤维素）离子交换凝胶：离子交换凝胶：deaedeae葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、deaedeae聚丙烯酰胺凝胶等。聚丙烯酰胺凝胶等。离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团的基团. .含有酸性可解离基团的称为含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂阳离子交换树脂，可解离出，可解离出h h+ +，含有碱性可解离基团的称为含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂阴离子交换树脂，可解离出，可解离出

8、ohoh- -。离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理+若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与h+h+发生交换而结发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与oh-oh-发生交换而结合在树脂上。发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。纯化的目的。+1 1、离子交换

9、剂的处理与装柱；、离子交换剂的处理与装柱；2 2、上柱；、上柱；3 3、冼脱和收集；、冼脱和收集； 4 4、离子交换剂的再生。、离子交换剂的再生。、离子交换层析的主要操作过程、离子交换层析的主要操作过程、离子交换剂的选择与处理、离子交换剂的选择与处理是含有若干活性基团的不溶性高分子物质；是含有若干活性基团的不溶性高分子物质；引入不溶性母体的活性基团可以是酸性基团，作为阳引入不溶性母体的活性基团可以是酸性基团，作为阳离子交换剂；也可是碱性基团，作为阴离子交换剂；离子交换剂；也可是碱性基团，作为阴离子交换剂；平衡常数；平衡常数；（）离子交换剂的选择；（）离子交换剂的选择；（）离子交换剂的处理。（）

10、离子交换剂的处理。back概念概念（排阻层析，分子筛层析）：混合物随流动相流经装排阻层析，分子筛层析）：混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。不同而被分离的技术。凝胶层析是凝胶层析是6060年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药术。目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用。学等有关领域广泛应用。从广义上说凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的高分子从广义上说凝胶是一类具有

11、三维空间多孔网状结构的高分子聚合物，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合聚合物，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。制成成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。制成颗粒状，装进凝胶层析柱使用。颗粒状，装进凝胶层析柱使用。设备简单，操作方便（不需经过再生处理可反复使用）。不设备简单，操作方便（不需经过再生处理可反复使用）。不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，适于需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，适于不同分子量的各种物质。不同分子量的各种物质。凝胶颗粒凝胶颗粒凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加凝胶

12、颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱溶液洗柱; ;分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗凝胶颗 粒间的空隙最先流出柱外。分子量粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，最后流出柱外。流速缓慢，最后流出柱外。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称在分离过程中的阻滞减速现象，

13、有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。之为阻滞扩散层析、排阻层析等。原理：原理：凝胶颗粒内部具有凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。度较慢，最后被洗脱出来。k kd d：分配系数，分配系数，k kd

14、d小的物质先流出。小的物质先流出。veve：冼脱体积，表示某一组分从进入导析柱到流出冼脱体积，表示某一组分从进入导析柱到流出 液中出现该组分高峰时，所需的冼脱液的体积。液中出现该组分高峰时，所需的冼脱液的体积。vovo：外体积。层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积外体积。层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积vivi：内体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和。内体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和。表征式表征式讨论讨论kd=1kd=00kd0f=0h+h+oh-迁移原理图迁移原理图因素总结因素总结（1 1）电场强度）电场强度e: e: 指每厘米的电压降；指每厘米的电压降；（2 2）溶液）溶液php

15、h值值: :决定了颗粒分子所带的净电荷；决定了颗粒分子所带的净电荷；（3 3）电渗）电渗: :溶液对固体支持物的相对泳动；溶液对固体支持物的相对泳动；此外此外, ,缓冲液的黏度、温度对颗粒的泳动速度也有缓冲液的黏度、温度对颗粒的泳动速度也有影响。影响。用途（酶工程领域）用途（酶工程领域）酶的纯度鉴定酶的纯度鉴定; ;酶分子量测定酶分子量测定; ;酶等电点测定酶等电点测定; ;小批量酶的分离纯化小批量酶的分离纯化. .水平电泳仪水平电泳仪垂垂直直电电泳泳槽槽垂直管型盘状电泳；垂直管型盘状电泳；垂直板型电泳。垂直板型电泳。定义定义以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支撑物以各种具有网状结构的多孔凝胶作

16、为支撑物（通常是聚丙烯酰胺凝胶）的电泳技术。（通常是聚丙烯酰胺凝胶）的电泳技术。形状形状單面垂直電泳槽單面垂直電泳槽 水平板式电泳槽水平板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽 聚丙烯酰胺凝胶的制备（操作）聚丙烯酰胺凝胶的制备（操作）电泳电泳染色染色脱色脱色 定性、定量定性、定量（测量电泳迁移率）（测量电泳迁移率）制备凝胶制备凝胶go电泳图谱电泳图谱胶膜放入底座胶膜放入底座 胶膜固定在底座上胶膜固定在底座上 加胶加胶放电梳放电梳 制制胶胶完成取出完成取出 放入电泳槽中放入电泳槽中 安裝防护罩安裝防护罩 整套安裝完毕准备电泳整套安裝完毕准备电泳 制胶图示制胶图示 back 凝胶的物理性质如机械强度

17、、弹性、透明度和粘着度都取决凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（于凝胶总浓度（t t）和和acracr与与bisbis两者之比。两者之比。凝胶总浓度（凝胶总浓度（t t）和交和交联度（联度（c c）的计算公式分别为：的计算公式分别为：t= c= t= c= 凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔凝胶浓度越大，孔径越小径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为当凝胶浓度确定后，交联

18、度为5%5%时，时，凝胶具有最小孔径，凝胶具有最小孔径，超过超过5%5%或低于或低于5%5%时凝胶孔径都要增大。时凝胶孔径都要增大。 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系acr（g）+bis（g）v（ml）x100%acr（g）+bis（g）bis（g）x100% 在浓度为在浓度为7.5%7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把满意的分离效果。因此，把浓度为浓度为7.5%7.5% 凝胶称为标准胶凝胶称为标准胶。对于。对于一个未知样品，常用一个未知样品，常用7.5%7.5%的标准胶或的标准胶或4%-

19、10%4%-10% 的凝胶梯度来测试，的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。而后选出适宜的凝胶浓度。 用于研究大分子核酸的凝胶多为用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%2.4%的大孔凝胶，此时凝的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入胶太软，不易操作，可加入0.5%0.5%琼脂糖，或在琼脂糖，或在3%3%凝胶中加入凝胶中加入20%20%蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。back系统的不连续性表现在以下几个方面：系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径

20、的浓缩胶，下的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的缓冲液离子组成及各层凝胶的phph不同。不同。电极缓冲液为电极缓冲液为ph8.3ph8.3的的tris-tris-甘氨酸缓冲液，甘氨酸缓冲液，浓缩胶为浓缩胶为ph6.7ph6.7的的tris-hcltris-hcl缓冲液，而分离缓冲液，而分离胶为胶为ph8.9ph8.9的的tris-hcltris-hcl缓冲液。缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。在电场中形成不连续的电位梯度。 在这样一个不连续的系统里，存在三种在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，物理效应，即

21、样品的浓缩效应，凝胶的分即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高应，使样品分离效果好，分辨率高.8.38.38.96.7凝胶层由上至下分别为：样品胶、浓缩胶、分离胶凝胶层由上至下分别为：样品胶、浓缩胶、分离胶样品胶样品胶包含样品的大孔径凝胶包含样品的大孔径凝胶浓缩胶浓缩胶用于样品浓缩成导线的大孔径凝胶，用于样品浓缩成导线的大孔径凝胶，不含样品，其它与样品胶一样不含样品，其它与样品胶一样分离胶分离胶使样品中各组分电泳分离的使样品中各组分电泳分离的孔径较小的凝胶孔径较小的凝胶backsds-sds-凝胶电泳凝胶

22、电泳在聚丙烯酰胺凝胶制备时，加入在聚丙烯酰胺凝胶制备时，加入1 12%2%的的sdssds（十二烷基硫酸钠）而成。十二烷基硫酸钠）而成。19671967，shapiroshapiro等发现。等发现。前述的凝胶电泳中，迁移率主要取决前述的凝胶电泳中，迁移率主要取决于蛋白电荷及分子大小及形状；于蛋白电荷及分子大小及形状；sds-sds-凝胶电泳中，电泳迁移率取决于凝胶电泳中，电泳迁移率取决于蛋白分子量大小，而与其分子形状及蛋白分子量大小，而与其分子形状及其所带电荷无关，故该方法主要用于其所带电荷无关，故该方法主要用于测定蛋白质或酶的分子量。测定蛋白质或酶的分子量。两种两种不同不同形式形式的电的电泳

23、泳为什么为什么sds-sds-凝胶电泳会不受蛋白分子所带电荷及分子形状影响呢？凝胶电泳会不受蛋白分子所带电荷及分子形状影响呢？sdssds阴离子带负电荷，阴离子带负电荷，sds-sds-蛋白质复合物上结合大量阴离子掩蛋白质复合物上结合大量阴离子掩盖了蛋白质间原来的电荷差别；盖了蛋白质间原来的电荷差别；sdssds与蛋白结合后引起蛋白质构象变化，在水溶液中变成长椭与蛋白结合后引起蛋白质构象变化，在水溶液中变成长椭圆形，短轴均为圆形，短轴均为18a18a，长轴与蛋白分子量成正比。，长轴与蛋白分子量成正比。ief在电泳系统中加入两性电解质载在电泳系统中加入两性电解质载体（在电场中能够形成一个由阳体（在电场中能够形成一个由阳极到阴极连续增高的极到阴极连续增高的phph梯度），梯度），当不同蛋白质等进入该体系中即当不同蛋白质等进入该体系中即移动（聚焦）到与其等电点相当移动（聚焦）到与其等电点相当的的phph位置上，从而使不同等电点位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。的蛋白质得以分离。ief原理原理ph连续连续增高增高pi点点（1 1）分辩率高（等电点仅差）分辩率高（等电点仅差0.010.02ph0.