麦麸为基质的红曲霉抗氧化活性研究 石峰

1、 麦麸为基质的红曲霉抗氧化活性研究 浙江工业大学 石峰 药学院摘要：红曲是我国的传统发酵产品，是以大米为原料，经红曲菌繁殖后生成的一种紫红色米曲。培养红曲霉，接种到麦麸，大米上，麦麸分别取培养时间位7天，10天，12天，15天17天 ，20天冷冻保存，大米取培养时间20天保存，然后所有样品经烘干保存。用ABTS法，DPPH等法测定红曲麦麸和红曲大米的抗氧化性并作比较。关键词：红曲霉，麦麸，抗氧化活性，多酚1 前言氧自由基（ROS）是很多疾病的发病原因之一，如癌症，动脉粥样硬化，糖尿病，帕金森症等。正常情况下，体内ROS不断产生，也不断被抗氧化系统清除，从而达到一种动态平衡。但是，当人体内的自由

2、基产生过多或清除过慢，就会攻击各种细胞、器官使之受到损伤，加速集体的衰老过程并诱发各种疾病1。外源性抗氧化剂能够加强淬灭自由基，减缓氧化损伤的累计速率。一般的活性氧自由基主要是朝阳阴离子自由基（O2-）、羟自由基（·OH）、过氧自由基（ROO·）、一氧化氮分子自由基（NO·）等2。红曲是我国的传统发酵产品，古代又叫赤曲或丹曲3，作为传统中药，红曲具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗菌消炎等功能。红曲的代谢产物主要有红曲色素、莫纳可林（MonacolinK，MK）、-氨基丁酸（GABA）、抗氧化活性物质、降血压物质等。Yoko Aniya在1999年从Anka红曲米提取到

3、了Dimerumic acid， 并发现Dimerumic acid可以清楚DPPH，活性羟基和超氧化物阴离子，具有较强的抗氧化活性，以及在对老鼠的活体实验中表明了其保护肝脏的能力4。Junsei Taira用Anka红曲得到DImerumic acid，发现Dimerumic acid在低浓度就有很明显的抗氧化活性效果5。酚类化合物由于其羟基取代的高反应性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性。Feng等人将薏米为底物的紫色红曲发酵产物用甲醇来提取，得到具有出色抗氧化活性的酚类6。Yang等人将大米为底物的紫色红曲发酵产物用甲醇提取，同样得到酚类7。Lee等人以大豆为底物发酵红曲，得到的产物

4、用水提取，主要的抗氧化物质同样是酚类8。屈炯等对红曲色素的抗氧化活力进行研究，发现红曲色素在·OH、O2·和DPPH·体系这三种抗氧化模型中表现出了较高的抗氧化活性。其清除率比同浓度的VC分别高20%、41%和34%9。小麦麸皮是制粉过程中提取小麦粉和胚芽后的残留部分。小麦麦麸中含有多种生理活性物质，如亚油酸、维生素E、多糖、低聚糖、酚类化合物。其中麸皮丰富的多酚类物质，其含量大约为小麦的40倍，而多酚物质主要存在于小麦麸皮中10。江生在碱性条件下测定小麦麸皮醇提取物中的总酚含量和总黄酮含量，分别为31.39±0.03（mg/g）和14.96±

5、0.04（mg/g），同时，采用紫外分光光度法、邻二氮菲法和邻苯三酚自氧法研究了小麦麸皮三种提取物（醚提物、醇提物、水提物）对三种常见自由基（DPPH、OH、O2）的清除作用，发现小麦麸皮三种提取物对于三种自由基均有清除作用11。近年来，小麦的年产量已经超过1亿吨，每年加工出小麦麸皮可达2000万吨，但大多没有进行深加工和再利用。如果能充分利用麸皮进行深加工和综合利用，将具有很高的经济效益和社会效益12。2 背景在以往的研究中，大部分红曲霉都是以大米作为发酵基质，而本文使用麦麸作为发酵基质，一个在于其价格低廉，可以充分利用以往被忽视的麦麸的价值，另一个在于麦麸本身含有丰富的抗氧化活性物质，以其

6、为基质的红曲霉可能比传统的红曲米的抗氧化活性高。酚酸是酚类物质的一类植物源酚酸通常以游离和束缚的形式存在且绝大多数以束缚型的酚酸的形式存在。束缚的酚酸通常以酯键、醚键与许多化合物结合在一起13，红曲霉在其生长代谢的过程中也可能会将一部分束缚型酚酸变为游离型酚酸。到目前为止，已有很多方法，如各种溶剂：水，乙醇，甲醇，丙酮单独或组合使用来提高提取率，但是谷物的总抗氧化能力可能由于其中的酚类化合物被束缚因此被严重低估14。而且，目前用于体外测定物质抗氧化能力的方法有比色法，化学发光法，荧光法，点子自旋共振法（ESR）等，但大多数是针对物质清楚某一种自由基而言，并不能反映出其总的抗氧化能力，鉴于物质在

7、肌体内起作用的正是其总的抗氧化能力，因此，用总的抗氧化能力（total antioxidant activity，TAA）来评价物质的抗氧化能力是很有必要的。ABTS法本质上是一种间接的方法，是用来检测物质清楚ABTS自由基的能力，与真实的氧化分解没有关系，并不是直接反应被检物质的活力，所以要想较全面的判断一种物质的抗氧化能力还要结合其他的方法，如DPPH法。15在本文中，将首先使用ABTS法对其总抗氧化活性进行评测。之后再对其抗氧化活性成分进行分析检测。目前，对于红曲霉的研究多数是基于大米为基质的红曲米，且大多是研究洛伐他汀、-氨基丁酸、红曲色素。对于麦麸为基质的红曲霉的抗氧化活性以及其活性

8、物质多酚、黄酮的文献比较少见。2 材料、仪器与方法2.1研究材料麦麸 红曲霉菌种 普通大米 2.2 实验仪器培养基 锥形瓶 试管 摇床 恒温箱 紫外分光光度计 超净台 离心机2.3 试验方法2.3.1 红曲霉的固态发酵1.接种PDA培养基，配方为：土豆40g 葡萄糖4g 琼脂4g 水200ml，在恒温箱中生长7d2 .接种液体培养基，配方为：葡萄糖3g NaNO2 0.2g 蛋白胨1g MgSO4 0.1g， 在摇床中培养2d3 .接种固态培养基，称取15g麦麸至50ml12个锥形瓶（料厚3-4cm），加15mlH2O 加0.2%（0.03ml）乙酸，混匀。称取20g大米（经过水泡）对照 加1

9、0mlH2O（注意：20g大米与15g麦麸等厚。大米中水于米为1比3 ，即 20g 大米中已含水5g 大米15g。）充分冷却后，接种液体培养基（10%）1.5ml将接种好的培养基锥形瓶放置与恒温培养箱中，麦麸培养时间分别为7d 10d 12d 15d 17d 20d，大米培养时间20d ，每个时间段的红曲霉培养三组。4.把各个时间段的发酵产物烘干，用打碎机打碎，冰箱保存。2.3.2 ABTS法测定抗氧化活性ABTS制备：将7.4mmol/L的ABTS和2.6mmol/L的K2S2O8（过硫酸钾）各0.2ml混合，于室温避光的条件下反应12h，用PH为7.4的磷酸盐缓冲液或乙醇稀释40-50倍，

10、要求在734nm下，吸光度为0.70±0.02，取合适重量如10mg的红曲麦麸与5ml的ABTS溶液混合，离心，反应6min，测定734nm下吸光度。Trolox标准液（0.3 mmol/L，9.6ml）：取Trolox 1mg， 加蒸馏水9.6ml。使标准曲线吸光值在0.2-0.8之间，得到清除率y与trolox含量（x）之间的回归方程 公式： 清除率=（A0-A）/A0*100% （A0 为未加样品的ABTS液吸光值，A为样品与ABTS液反应后的吸光值）ABTS法最先由Mille等人开创，用于测定生物样品的抗氧化能力。该方法是以ABTS（2, 2'-联氮一双一(3一乙基苯

11、并噻唑啉-6-磺酸)，结构式如图1所示。这种水溶性的自由基引发剂为显色剂。ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+，向其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS+发生反应而使反应体系褪色，然后在ABTS+这种自由基的最大吸光波长下(一般选择734nm)检测吸光度的变化，与含trolox即6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢毗喃-2-羧酸)，一种类似于VE的水溶性物质的对照标准体系比较，换算出被测物质总的抗氧化能力，结果多表示为达到一定浓度测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox的浓度，所以也把该方法称为TEAC法16。2.3.3 DPPH法测

12、定抗氧化活性取样品提取物用DMSO溶解，配置成2mg/mL的母液。DPPH用无水乙醇配制成0.1mmol/L，置于棕色瓶中备用。于试管中分别加入2.5ml的0.1mmol/L的DPPH，0.5ml不同质量浓度（10,20,40,60,80,100 g/ml）的样品溶液，2ml蒸馏水，混匀。反应30min，于517nm波长处检测样品吸光度（A0）；取0.5mlDMSO代替样品溶液测得空白吸光度（AJ）；每个检测做3个重复，取其平均值。清除率计算公式如下：清除率=（A0-Aj）/A0*100% 其原理为：二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它

13、，则表示受试物具有降低经自由基、烷自由基或过氧自由基等自由基的有效浓度，打断脂质过氧化链反应的作用。DPPH·有个单电子，光谱扫描显示在517nm处有强吸收，其乙醇水溶液呈深紫色，加入受试物后，通过在517nm测定其清除DPPH自由基而引起吸光度减少的情况可以反映受试物的抗氧化活性，计算其清除自由基的能力2.3.4 多酚含量的测定样品用同体积70%的甲醇、乙醇及丙酮溶液在40下过夜振荡提取(100r/min)。提取后抽虑得滤液，滤液浓缩除去有机溶剂后用蒸馏水定容，取定量的溶液测定其中的总酚含量。取300L提取液补水至1mL，加入1ml福林酚制剂（0.2mol/L），混合均匀，再加入3

14、mL 15%的碳酸钠溶液。避光反应2h，在760nm处测定吸光值。 采用FC试剂法测定总多酚，其原理是在碱溶液中，酚类化合物可以将钨钥酸还原(W6+变成W5+生成蓝色化合物，化合物的颜色和多酚的含量正相关，此蓝色化合物的最大吸收波长为760nm。3.结果与分析3.1 ABTS法测抗氧化活性用个各时间段红曲麦麸与20天的红曲米1mg与6mlABTS溶液（50%乙醇稀释）反应并在734nm下的测吸光度，做3组平行试验取平均值，ABTS溶液吸光度A0为0.637。各时间段平均吸光度表1和抑制率与培养时间的关系图1 培养天数组号7101215172020米10.041 0.094 0.369 0.13

15、6 0.173 0.113 0.018 20.422 0.172 0.148 0.131 0.160 0.076 0.025 30.138 0.168 0.142 0.167 0.173 0.067 0.026 平均0.200 0.145 0.220 0.145 0.169 0.085 0.023 表格 1用1.5ml80%丙酮提取各时间段的麦麸和大米30mg，进行离心，取上30ml清液与6mlABTS溶液（50%乙醇稀释）反应并在734nm下的测吸光度，做3组平行试验取平均值，测得ABTS溶液吸光度A0为0.342得到各时间段平均吸光度表2和培养时间的关系图2 表格 2培养天数 组别7101

16、215172020（米）10.015 0.086 0.082 0.136 0.132 0.095 -0.006 20.095 0.105 0.101 0.140 0.132 0.126 -0.006 30.117 0.077 0.084 0.136 0.147 0.120 -0.006 平均0.076 0.089 0.089 0.137 0.137 0.114 -0.006 直接用ABTS溶液与样品反应，从图1得知随着培养时间变长清除率线性关系成正相关，即随着培养时间增大，红曲麦麸的抗氧化性在变强，20天的红曲大米的抗氧化活性比20天的红曲麦麸抗氧化活性强。样品的提取液与ABTS溶液反应，从图

17、2得知随着培养时间增长，清除率在变弱，即红曲麦麸的抗氧化活性在变弱，但20天的红曲大米清除率与图一里的并没太大变化。图1与图2中红曲麦麸的抗氧化活性测量的结果差异这么大的猜想原因可能是：随着红曲霉的生长产生了某种抗氧化活性很高的物质，但是这种物质用丙酮却并不能提取出来(接来我们会去尝试验证这一猜想，并提取出这种物质）。3.2 DPPH法测抗氧化活性在黑暗条件下，各时间段样品与DPPH溶液反应30分钟，在517nm下测得吸光度，平行做三组实验，取平均值，测DPPH的吸光度A0为0.875。各个时间段的平均吸光度表3和DPPH自由基清除率与培养时间的关系图3 表格 3 培养天数组号71012151

18、72020（大米）10.643 0.5880.502 0.451 0.4210.3880.37420.649 0.576 0.4960.446 0.429 0.3860.37230.632 0.581 0.4970.4420.420 0.3940.369平均0.641 0.582 0.498 0.443 0.423 0.3890.372从图3得知随着培养时间的增长，红曲麦麸的清除率增大，即红曲麦麸的抗氧化活性增强。20天的红曲大米抗氧化活性比20天的红曲麦麸抗氧化活性大。3.3 多酚含量的测定300L提取液+700L蒸馏水+1ml福林酚试剂（反应3分钟后）+3mL2%Na2CO3避光反应2h，

19、在760nm下测吸光度，平行做3组，取平均值。数据如表4，吸光值和培养天数的关系如下图 表格 4 培养天数组号7101215172020（米）10.363 0.327 0.383 0.341 0.291 0.365 0.750 20.321 0.348 0.400 0.335 0.298 0.377 0.757 30.345 0.371 0.383 0.340 0.281 0.359 0.741 平均0.343 0.349 0.389 0.339 0.290 0.367 0.749 由图得知在培养7天至20天的时间里红曲麦麸中的多酚含量几乎处于稳定状态。20天的红曲米中多酚含量比红曲麦麸中含量

20、多。4. 讨论与不足本实验测量了生长各个阶段的红曲大米的抗氧化活性和20天的红曲大米的抗氧化活性，得出了随着红曲霉的生长使麦麸的里抗氧化物质增多，抗氧化活性增强。20天的红曲大米也比同时间的红曲麦麸抗氧化活性强。但是相对大米与麦麸的成本价，从经济角度我认为如果要大规模提取这些抗氧化活性物质，可以考虑从麦麸中提。因为时间不足和实验室一些仪器试剂不全等方面的现实原因，本实验有很多不足，原计划还打算测样品黄酮含量，样品的总生物量和一些标准曲线。因为前期实验室缺少过程中某些关键的试剂，实验起步很晚，导致实验进程很慢，未能完成预定目标。参考文献1伍键萍.红曲霉发酵多糖条件及抗氧化活性的初步研究D.天津科

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