葛根素对东莨宕碱致小鼠恐惧记忆障碍的作用及脑内SOD和MDA的影响

1、葛根素对东罠宕碱致小鼠恐惧记忆障碍的作用及脑内sod和mda的影响万刚玉季微魏文龙徐朝娜戴翔翔张信波俞朝阳通讯作者绍兴文理学院医学院浙江绍兴312000【摘 要】fi的：探讨葛根素对东董若碱致小鼠恐惧记忆障碍的作用及机制。 方法：用电刺激建立恐惧记忆模型小鼠,用东萇若碱建立恐惧记忆障碍模型，随 机分成5组：空片对照组、模型组、葛根素低、屮、高剂量组。ig给予葛根素 300 mg?kg-l> 450 mg?kg-l 600 mg?kg-l,正常组及模型组则给予等量的生理盐 水，连续灌胃5次，以葛根素半衰期为给药间隔时间。于末次给药结束后30 min 除空白对照组腹腔注射生理盐水，其他各组注

2、射东萇若碱2mg?kg-l, 30 min后 用明暗箱检测记忆能力,各组取4只小鼠处死并测脑组织中sod和mda的含量。 各组剩下的小鼠再用上述方法连续给药5次再测潜伏期及取脑测sod和mda 含量。结果：与模型组比较，葛根素组小鼠进洞潜伏期明显延长;葛根素能提高 小鼠脑组织内sod含量以及降低mda的含量。结论：葛根素可以改善恐惧记忆 障碍小鼠的记忆能力，且以预防结合治疗性处理组效果更好。【关键词】葛根素；东萇若碱；恐惧记忆障碍；超氧化物歧化酶；丙二醛【中图分类号j r285 【文献标识码1b【文章编号】1674-8999 (2015 )8-0421-02effects of puerari

3、n on fear memory deficits and the role of sod and mda in brain of mice induced by scopolaminegangyu wan, wei ji, wenlong wei, zhaona xu, xiangxiang dai，xinbo zhang, chaoyang yu*(medical college of shaoxing, zhejiang shaoxing 312000)abstract objective: to investigate the effects of puerarin on fear m

4、emory impairment and the role of sod and mda in brain of mice induced by scopolamine and its mechanism.methods： electrical stimulation established mouse model of fear memory, and fear memory impairment model established by scopolaminel,the rats were randomly divided into five groups： the blank contr

5、ol group, the model control group, puerarin high-does group(300mg?kg-l), puerarin medium-dose group(450mg?kg-l)and puerarin lowdose group(600mg?kg-l) respectively.the high-does group,the mediun-does group and the low-does group was given with puerarin by intragastric administration for 5 times with

6、half-life of the dosing interval,the blank control group and the model control group was given with normal saline by the same way. all the groups except the normal control group were given with 2mg?kg-l scopolamine by intraperitoneal injection after 30 minutes at the end of the last administration a

7、nd use dark and light box to check the memory ability after 30 minutes.take four mice from each groups were sacrificed and measured the levels of sod and mda from brain tissue.use the above method of continuous administration of 5 times , then to measure incubation period and the levels of sod and m

8、da from brain tissue.results： compared with the model group, incubation period of puerarin group of mice was prolonged ; puerarin can improve the levels of sod and reduced the levels of mda from the brain tissue of mice.conclusion： puerarin can ameliorate the ability of memorizing of the fear memory

9、 impairment mice,a nd preve ntion combi nation with treatme nt group have better results.【key words puerarin;scopolamine;fear memory deficits;superoxide dismutase;malo ndialdehyde阿尔茨海默病(alzheimer's disease, ad)是一种发生在老年期的以认知和记忆 障碍为主的中枢神经系统退行性疾病，其认知和记忆障碍与海马结构萎缩和功能 障碍密切相关，而海马的部分功能由“恐惧中枢”杏仁核的调节来实现。此

10、外犬 量实验证明抗氧化剂对ad的发病有延缓和保护作用k但是大多数合成的抗氧 化剂并没有严格的毒理实验验证，所以人们更青睐天然的抗氧化剂。葛根素是从中药葛根中提取的一种单体。属于黄酮类化合物，此外有研究2 发现黄酮类化合物具有较强的清除自由基的能力，提高机体抗氧化应激能力。本 实验对葛根素能否通过氧化应激途径来改善恐惧记忆障碍进行研究，从而为ad 的治疗提供实验依据。1材料1.1动物icr清洁级雄性小鼠（3月龄,24±2g） 75只由浙江杭州医 科大学实验动物中心提供合格证号:scxk（浙）20080033。室温（20±2）°c, 颗粒饲料喂

11、养，自由饮水。1.2药物与试剂纯度为98%的注射用葛根素（西安天丰生物科技有限公司, 批号nf-20130924）；葛根素混悬液（称适量注射用葛根素，加蒸惚水制成浓度 为20mg/ml的葛根素混悬液供灌胃用，灌胃前须摇匀）；氢澳酸东萇着碱（上海禾 丰制药有限公司生产'批号h31021519）；超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛（mda）试 剂盒、考马斯亮蓝试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供；0.9%的生理盐水、 无水洒精、蒸徭水、双蒸水、冰醋酸均为市售分析纯。1.3仪器722型分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；sc-2542 低速台式离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）;z

12、d-420电热恒温水槽（嘉兴市 中新医疗仪器有限公司）;ja1003型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限 公司）；小鼠zh-dsx2型明暗箱（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司）；研钵。2方法2.1恐惧记忆模型的建立 动物适应环境2d,于第3 d进行足底板敏感性测 试，筛选出敏感性好的小鼠，于第4 d让小鼠在穿梭箱中适应5 min,然后将小 鼠放入明箱，测试小鼠进入暗箱的吋间（主动冋避反应潜伏期，其值<5min, 如果5 min内没有进入暗箱潜伏期记为300 s）,等进入暗箱后给予0.5 ma的电刺 激，小鼠则发生被动冋避反应跑向明箱。每只小鼠一天训练2次，持续一周， 从而建立

13、起恐惧记忆模型。再次剔除反应性过于迟钝的小鼠。2.2动物分组、给药与造模 小鼠按体重均衡及随机原则分组,分别为空白对 照组、东萇著碱模型组、葛根素300、450、600 mg?kg-l组，每组15只。东萇著 碱前给药的各组以葛根素半衰期38min3为给药间隔时间连续灌胃5次。于末次 给药结束后30min除空白对照组腹腔注射生理盐水，其他各组注射东萇著碱2 mg?kg-l, 30 min后用明暗箱检测记忆能力。检测结束后各组取4只小鼠处死并 测定脑组织中sod和mda的含量。各组剩下的小鼠即东萇著碱前后给药组，再 以葛根素半衰期38 min为给药间隔时间，连续灌胃5次。于末次给药结束后30 mi

14、n后用明暗箱检测记忆能力。检测结束后各组取4只小鼠处死并测定脑组织中 sod和mda的含量。2.3小鼠明暗箱法 应用明暗箱装置，以小鼠主动冋避反应为指标测定记忆 能力。明箱用白炽灯光照亮，暗箱底部置铜栅可电击动物，两箱之间有一小洞(7 cm*5cm)相通供小鼠通过。测定吋将小鼠置于明箱，利用小鼠趋暗性，记录小鼠 四肢全部进入暗箱的时间，即为进洞潜伏期(主动冋避反应潜伏期，其值<5 min, 如果5 min内没有进入暗箱潜伏期记为300 s)o当小鼠进入暗箱后即刻通电 (0.5ma4交流电)屯击动物，小鼠逃至明箱后取出。2.4采集样品及相关物质的测定 行为学测试结束后，立即脫颈处死

15、，迅速 在冰上剥离大脑，称重，加入脑重的9倍量生理盐水匀浆，在3500 r/min, 4°c 条件下离心10 min,取上清置于一20°c冻存。按试剂盒说明书测定脑匀浆上清液 中sod和mda含量。2.5数据统计处理实验数据均以均数&plusnw;标准差(x&plusnw;s)表示；采 用prism5.0 demo画图软件进行绘图，采用spss17.0统计软件处理,多个组比较 采用单因素方差分析，p<0.05为差异有显著性；p>0.05为差异不具有显著 性。3结果3.1对明暗箱试验中潜伏期的影响与对照组比较，东萇着碱模型组小鼠的

16、潜伏期明显降低且有显著差异(p<005),与模型组比较，东董君碱前低中剂量 给药组和东萇若碱前后中剂量给药组潜伏期明显延长口有显著差异(p<0.05), 东萇君碱前高剂量给药组和东萇君碱前后低、高剂量给药组潜伏期有所延长但与 模型组比较无统计学差异(p&gt；0.05)o结果见表1和图2。1,3与空白对照组比较p<00524与东萇著碱模型组比较p<0.051,34讨论随着全球人口老龄化，ad的发病率日趋上升，ad其最终影响生活质量的关 键因素是学习记忆和认知功能的障碍，而现在已经证实胆碱能系统的活性与人的 学习记忆和认知功能密切相

17、关。故脑内胆碱能神经元的退化是导致ad的重要原 因之一。而胆碱能受体阻滞剂东罠著碱建立动物学习记忆障碍模型是常用的观察 药物对学习记忆障碍改善的试验方法56。本试验用东萇若碱建立恐惧记忆障碍模型，用明暗箱法观察不同剂量葛根索对恐惧记 忆模型小鼠恐惧记忆的影响。行为学结果显示葛根素450 mg?kg-l具有改善东萇 君碱所致恐惧记忆障碍的作用。sod是体内清除氧自由基的重要酶之一，能够清除氧自由基而对机体细胞产 生保护作用；mda是机体发生脂质过氧化作用的产物，氧自由基可通过过氧化作 用引起细胞损伤。徐晓虹7研究发现葛根素可以通过提高sod活性同吋降低mda 活性来改善d半乳糖致衰老小鼠抗氧化能

18、力；王丽娟等8研究发现葛根素是通 过减少sod的消耗来提高抗氧化酶的活性从而改善u14宫颈癌小鼠的氧化功能; 杨东旭等9对b淀粉样ad模型小鼠学习记忆能力的研究发现葛根素明显改善模 型小鼠的学习记忆，使小鼠脑及血中的sod增多、mda减少；此外研究还发现 10-11葛根素还可以通过增强sod、gsh-px活力和gsh含量，降低mda含量来拮 抗醉洒小鼠体内的氧化反应和缓解过氧化氢引起的大鼠心肌细胞氧化应激损伤; 能够抑制脂质过氧化物所致的衰老退行性变12；本实验发现:葛根素450 mg?kg-l 无论是预防性处理组还是预防结合治疗性处理组，均不同程度的增加sod含量 和减少mda含量。相比之下

19、，预防结合治疗性葛根素450 mg?kg-l处理组升高 脑内sod含量和降低mda含量的效果更佳。陈炜13等在葛根素对阿尔茨海默症的治疗作用及机制初探的研究中发现 葛根素在治疗ad患者中能降低脂质过氧化物酶的含量、增加sod活性，本实验 进一步验证了葛根素可以提高类似ad小鼠的抗氧化能力，故可为临床通过提高 机体抗氧化能力途径治疗阿尔茨海默症提供实验依据。葛根为豆科植物野葛的干燥根，味甘辛，性凉。祖国医学认为，葛根归脾、 胃经，具有解表退热、生津止渴、升阳止泻、透疹发表等功效，可用于治疗外感 发热头痛、津液匮乏、消渴、发疹不透、热痢、高血压头晕、颈项强痛等病证。 临床上常用于治疗高血压、冠心病

20、、心绞痛、心肌梗死、脑缺血、脑淤血、脑梗 死等心脑血管病，但它对东萇君碱诱发的恐惧记忆障碍是否有改善作用还缺乏研 究。通过本实验可发现，葛根素能明显改善东罠著碱诱发的小鼠恐惧记忆障碍且 预防结合治疗性葛根素450 mg?kg-l效果更佳，同吋这一改善作用可能是通过抗 氧化途径实现。参考文献：lpriticxo d. evidenee of oxidative stress in alzheimer's dis-ease brain and antioxidant therapycj. annals of the new york academy of sciences, 2008, (

21、12)： 1147： 70-78.赵保路氧自由基和天然抗氧化剂m生物物理学报,2010,26:263-2743吴燕红，苏子仁，陈建南，等从小鼠体内血药浓度时间曲线与组织分布特 征评价葛根素的给药途径j 中药新药与临床理.2005, 16:112-115宋海滨，李春林，金毅，等两种小鼠恐惧记忆模型建立的比较研究j中 国行为医学科学,2006,15:1076-10775 chaoya ng yao s, lisha x, et a i. effect of en doge nous histami ne in the ven tral hippocampus on fear memory deficits induced by scopolamine as evaluated by step-through avoidanee response in ratsj.phy