药用真菌猪苓菌核渗出液理化性质探究

1、药用真菌猪苓菌核渗出液理化性质探究摘要探讨不同发育阶段人工培养的猪苓菌核渗 出液的理化性质。对药用真菌猪苓进行培养，系统地观察不 同发育阶段的猪苓菌核及其渗出液的形态特征；对不同发育 阶段猪苓菌核渗出液的ph进行测定；采用硫酸-苯酚法测定 猪苓菌核渗出液的多糖含量；并利用bca蛋白含量测定方法 测定猪苓菌核渗出液的蛋白含量，利用紫外吸收法测定猪苓 菌核渗出液中过氧化氢酶（cat）的含量。在猪苓菌核发育 过程中，菌核渗出液ph出现先升高后降低的趋势；渗出液 的多糖含量逐渐下降；渗出液的蛋白含量及cat含量出现逐 渐升高的趋势，说明猪苓菌核渗出液形成过程中伴随着高水 平的氧化应激反应。添加维生素c

2、以后，部分地消除了活性 氧，因此cat活力下降。猪苓菌核渗出液的ph在猪苓菌核 形成过程中一直维持酸性状态，间接反应出酸性环境有利于 猪苓菌核的形成；菌核渗出液具有逐渐产生且最终被菌核重 新吸收的特征。关键词猪苓；菌核；渗出液；多糖；cat收稿日期2013-07-07基金项目国家自然科学基金项目（31201666）；国际 科技合作项目（2011dfa31260）通信作者*郭顺星，研究员，博士生导师，研究方向 为药用植物菌根生物学，tel: (010) 62829619, e-mail： sxguol986163. com作者简介邢咏梅，博士，助理研究员，研究方向为 药用真菌学，tel :( 0

3、10 ) 62819871 , e-mail :meimary163. com 猪苓 polyporus umbellatus (pers. ) fr. 是一种珍贵的药用真菌。猪苓的药用部位是菌核，用于治疗 水肿、急性肾炎、尿频尿急、黄疸以及腹泻等疾病1-4。 然而，随着猪苓药用范围的扩大，加上野生猪苓资源的商业 采挖，导致野生猪苓资源濒临枯竭。目前，人工栽培猪苓存 在菌核生长缓慢，需要以天然猪苓菌核作为种苓等缺点，严 重制约了猪苓的大面积栽培。本实验室在以往的研究中发 现，人工培养的猪苓菌核与天然猪苓菌核特征性化学成分的 指纹图谱基本一致，具有潜在的应用价值5。然而，许多研究者致力于植物病原

4、菌菌核生理生化特性 的研究，而对于药用真菌菌核的研究报道较少。本研究对人 工培养的猪苓菌核渗出液的理化性质进行研究，为猪苓菌核 形成的生理过程提供重要的理论依据。1材料本实验所用猪苓采自山西古县北平镇党家山村，由中国 医学科学院药用植物研究所郭顺星研究员分离鉴定，保存于 麦魏琼脂培养基。麦芽糖，k2hp04, kh2p04, mgso4 7h20,维生素 b1, 除菌滤器，微孔滤膜（孔径0.22 um,直径13 mm）,琼脂 粉等购自北京科百奥生物科技有限公司。novagen bca protein assay kit购自默克公司，过氧化氢酶（cat）测定 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。培

5、养基：麦芽糖 20. 0 g, k2hp04 1. 0 g, kh2po4 0. 5 g, mgs047h20 0. 5 g,琼脂粉15. 0 g,去离子水1 lo2方法常规高压灭菌后冷却至60 °c左右，0. 05 g - l-1维生 素b1通过0.22 um微孔滤膜加入到灭菌后的培养基中，充 分混匀后于直径9 cm的培养皿中倒平板，每个平皿倒入20 ml 培养基2, 5o维生素c （vit c）添加组在分装培养基前， 将维生素c通过0.22 um微孔滤膜加入至培养基中配制成 终浓度为0. 5g l-1的溶液后再倒平皿，每个平皿倒入20 ml 培养基。2.1观察猪苓菌核渗出液形成情

6、况随着培养时间的延 长，观察猪苓菌核的形态特征及渗出液的产生，并在菌核发 育的不同阶段收集猪苓菌核渗出液，置-80 £备用。2.2猪苓菌核渗出液的ph测定 取猪苓菌核发育不同阶 段（30, 50, 70, 80 d）的菌核渗出液，以 mettler toledo ph计测定其ph。每个样本重复3次，该实验重复3次。2.3猪苓菌核渗出液多糖含量的测定精确称取无水葡 萄糖（105工干燥至恒重）10 mg置10 ml量瓶，加去离子 水溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精确吸取上述溶液0.1,0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5, 0. 6, 0. 7, 0.8, 0. 9, 1. oml

7、 于具塞 试管中，加去离子水1 ml,加6%苯酚溶液1 ml,加浓硫酸 5 ml,混匀，置沸水浴中加热15 min,取出后立即置冰水中 冷却30 min,在490 nm波长处分别测定吸光度。绘制标准 曲线，求出回归方程。精密量取不同培养时间的猪苓菌核渗 出液lml,以氯仿、丙酮抽提除色素，以石油瞇除酯。加入 8 ml石油瞇，充分混匀，4 500 r min-1离心10 min后， 弃上清，加5 ml去离子水，混匀，超声提取30 min, 4 800 r - min-1离心10 min,弃上清，药渣60 i干燥后转至50 nil 具塞三角瓶，加去离子水20 ml, 80 °c水浴3 h

8、,抽滤，弃 药渣，上清液定容至25 ml,精密吸取1 ml,置10 ml离心 管，加无水乙醇4 ml, 4 °c存放过液。4 800 r min-1离 心10 min,弃上清，沉淀物用80%乙醇洗涤2次，每次2ml, 将沉淀用去离子水溶解，定容至2 ml,精确吸取0.25 ml, 加去离子水175 ml,加6%苯酚溶液1 ml,加浓硫酸5 ml, 混匀，沸水浴15 min,取出置冰水中冷却30 min,在490 nm 波长处分别测定吸光度。2.4猪苓菌核渗出液蛋白含量测定利用novagen bca protein assay kit测定猪苓 菌核不同发育阶段菌核渗出液的蛋白含量。bc

9、a蛋白定量方 法是基于双缩豚反应，即在碱性溶液中蛋白将cu2+还原成 cu+,根据检测到的cu+浓度可以计算体系中的蛋白含量。bicinchoninic acid是一种显色剂，可以螯合cu+,产生一 种在562 nm有强吸收的紫色复合物。制备bsa浓度标准曲 线后，测定猪苓菌核发育的不同阶段菌核渗出液的蛋白含 量。每个样本重复3次，该实验重复3次。2. 5猪苓菌核渗出液过氧化氢酶（cat）含量测定过氧 化氢酶（cat）分解h202的反应可被钮酸铁迅速中止，剩余 的h202与钮酸铁作用后产生一种淡黄色的络合物，在405 nm 处测定其生成量，可计算出cat酶活力。测定无维生素c添 加组及维生素c

10、添加组猪苓菌核发育不同阶段菌核渗出液的 cat含量。每个样本重复3次，该实验重复3次。按照过氧化氢酶（cat）测定试剂盒说明书进行。对照 管中加入经过37 £预温的试剂一（l.oml）、试剂二（0. 1 ml）, 充分混匀后在37 °c精确反应lmin后，加入试剂三（l.oml） 和试剂四（0.1 ml）以及菌核渗出液0. 05 ml,充分混匀， 在405 nm测定其吸光度。测试管中先加入菌核渗出液0. 05 ml,再加入经过37 °c预温的试剂一（l.oml）、试剂二（0.1 ml）,充分混匀后在37工精确反应1 min后，加入试剂三（1. 0 ml）和试剂四（

11、0.1 ml）,充分混匀，在405 nm测定其吸光 度。每毫克组织蛋白每秒钟分解1 nmol h202定义为1个 酶活力单位。组织匀浆中cat活力（umg-1） = （a对照-a测定）x271x160x取样量待测样本匀浆蛋白浓度（271为斜率的 倒数）。3结果与分析3. 1猪苓菌核培养过程中菌核渗出液的产生生长15 d 后，在麦芽糖完全培养基中培养的猪苓菌丝萌发形成灰白 色、蓬松的球形菌核，体积较小，菌核表面生长的菌丝呈绒 毛状、疏松而柔软，表面平滑（图1）。a.培养15 d的猪苓菌核（菌核形成初期）；b.培养30 d的猪苓菌核（菌核生长期）；c.培养70d的猪苓菌核（菌 核成熟期）；d.培养

12、90 d的猪苓菌核（菌核成熟期）。图1猪苓菌核发育过程中菌核及渗出液的形态特征fig. 1 morphological characteristics of the sclerotia and the exudate of polyporus umbellatus during sclerotial formation随着培养时间的延长，猪苓菌核迅速增殖，体积增大， 当生长至30 d时，猪苓菌核变成洁白、致密的球形或呈不 规则状，菌核表面的菌丝变得致密，上面均匀布满大小不等 的无色透明或半透明液滴，此时猪苓菌核发育进入菌核生长 期（图1）。随着培养时间的延长，猪苓菌核继续增殖成球形或不规 则形

13、。生长至70 d时，菌核表面的菌丝变得更加致密，上 面不均匀地布满大小不等的棕褐色或棕黄色透明或半透明 的液滴，有时液滴出现逐渐融合现象，此时猪苓菌核发育进 入成熟期（图1）。随着培养时间进一步延长，当培养至90 d时，猪苓菌 核表面变为更加致密、坚硬的球形或不规则形，菌核表面有 灰褐色色素沉着，分布不均匀，同时伴有黑褐色或深褐色点 状色素样物质沉积在猪苓菌核外表面，棕褐色或棕黄色液滴 消失。灰褐色色素沉着部位的猪苓菌核呈固缩状，表面凹凸 不平（图1 ）。3.2猪苓菌核渗出液ph、多糖含量、蛋白含量及cat活 性在猪苓菌核发育过程中，菌核渗出液的ph出现先升高后 降低的趋势。但菌核渗出液的ph

14、在猪苓菌核形成过程中一 直维持酸性状态，菌核渗出液在培养30 d后，即菌核形成 期产生，此时菌核渗出液的ph最低；当猪苓菌核处于成熟 期时，其ph达到最高，随后又出现下降。猪苓菌核生长过 程中，当猪苓菌核发育处于菌核生长期（培养30 d）时，其 渗出液多糖含量最高，随培养时间延长，其多糖含量呈逐渐 下降趋势。当菌核处于成熟期时，猪苓菌核渗出液的多糖含 量最低。猪苓菌核培养过程中，当猪苓菌核发育处于菌核生 长期（培养30 d）时，其渗出液蛋白含量及cat含量最低， 随后出现逐渐升高的趋势，培养80 d的菌核渗出液的蛋白 含量及cat活力最强，此时猪苓菌核发育处于成熟期阶段。 添加外源性维生素c以

15、后，cat活力下降，结果见表1。表1猪苓菌核渗出液ph、多糖含量、蛋白含量及cat活性(土s, n=3)table 1 the ph, polysaccharides, protein contentand cat activity of polyporus umbellatus sclerotial exudate (+s, n=3)注：catvc表示vit c添加组的cat酶活性。4讨论真菌的菌丝体生长到一定的阶段，为适应一定的环境条 件或者抵御不良环境，菌丝体变为紧密交织而成的休眠体， 形成特殊的组织体，称为菌核。真菌菌核的生长发育过程依 据其明显的宏观特征被划分为3个阶段2-3,即菌核

16、形成 初始期、菌核形成生长期和菌核成熟期。菌核形成初始 期一一高度增殖、相互交织的菌丝形成小的明显的菌核原基 (sclerotia initiation, si),即菌核形成初期；菌核形 成的生长期一一在菌核形成初始期的基础上，菌核原基体积 逐渐增大；菌核形成的成熟期 包括菌核表面分界、内部 加固以及色素沉着。在真菌菌核形成阶段，菌核的表面出现 大量透明小液滴，随着培养时间延长，液滴会逐渐增大甚至 融合7。研究发现，菌核渗出液含有脂肪酸、氨基酸、蛋白质、酶，其中包括与黑色素形成相关的多酚氧化酶，以及 过氧化氢酶和过氧化物酶等抗氧化酶8。已有研究 表明，适宜的ph是菌核生长及形成的必要条件。有学

17、者研 究发现9-10,在一般情况下，适于真菌菌丝生长的最佳ph, 同时也是促使菌核形成的最佳pho中性及碱性ph对菌核病 菌sclerotinia sclerotiorum菌核的形成具有抑制作用， 而草酸的累积可以降低环境ph,使菌核更容易形成11。真 菌的菌核渗出物的ph被证明与其来源的菌核ph接近，如s. sclerotiorum成熟菌核分泌物的ph为5. 4；而其成熟菌核 的水提物ph为6. 3,同为酸性7。上述实验结果间接证明 酸性ph有利于菌核形成12 o本研究结果表明，在猪苓菌 核发育过程中，菌核渗出液的ph在猪苓菌核形成过程中一 直保持酸性状态。可见，酸性ph有利于菌核形成2。随

18、着 培养时间延长，猪苓菌核渗出液多糖含量呈现逐渐下降趋 势，推测可能与猪苓菌核培养过程中糖类物质逐渐消耗有 关。研究发现，菌核渗出液中富含蛋白质，糖，脂肪酸，氨, 抗氧化酶（如过氧化物酶和过氧化氢酶等）8。本研究结 果表明，猪苓菌核形成过程中，菌核渗出液的蛋白含量及cat 含量呈现逐渐升高趋势，这可能与猪苓菌核渗出液随着培养 时间的延长，水分蒸发、浓缩及重新回归菌核内并被吸收有 关。培养基中添加维生素c以后，消除了活性氧，使cat活 力下降。这一实验结果间接反映出猪苓菌核形成过程中与高 水平的氧化应激相关。随着培养时间的延长，猪苓菌核发育 成熟后，其渗出液明显减少，这可能与渗出液中水分的蒸发

19、以及渗出物重新沉淀于菌核中有关13,从而引起渗出液 ph、蛋白含量及酶活力的变化。猪苓菌核渗出液化学成分及 其与菌核形成的关系值得在后续研究中深入探讨。参考文献1 guo w j, xing y m, chen j, et al. growthpromoting effects of water extract of armillaria mellea rhizomorph on mycelia of polyporus umbellatusj cryptogamie mycol, 2011,32 (2)：171.2 xing y m, chen j, lv y l, et a 1. dert

20、erminationof optimal carbon source and ph value for sclerotial formation of polyporus umbellatus under artificial conditionsj. mycol prog, 2011,10 (1 )：121.3 xing y m, zhang l c, liang h q, et al.sclerotial formation of polyporus umbellatus by low temperature treatment under artificial conditionsj.

21、plos one, 2013,8 (2)：e56190.4 邢晓科，郭顺星.伴生菌对猪苓菌丝生长及多糖含量的影响j中国中药杂志，2008,33 (13)：1575.5 邢咏梅，郭顺星.环境因子对猪苓菌丝体生长发育的影响j中国药学杂志，2011,46 (7)：493.6 周微微.猪苓菌核及发酵菌丝体化学成分研究及 质量分析d.北京：中国医学科学院北京协和医学院，2008.7 colotelo n, sumner j l, voegelin w s chemicalstudies on the exudate and developing sclerotia of sclerotinia scle

22、rotium ( lib) debaryj can j microbiol, 1971,17：1189.8 georgiou c d,papapostolou l, geroge z.sclerotial metamorphosis in filamentous fungi is induced by oxidative stressj integr comp biol, 2006,46,6：691.9 rudolph e d. the effect of some physiologicaland environmental factors in sclerotial aspergilli

23、j am j bot,1962,49：71.10 griffin d m, nair g n. growth of sclerotium rolfsii at different concentrations of oxygen and carbon dioxidej. j exp bot, 1968,19： 812.11 chen c b, harel a, gorovoits r, et al. mapkregulation of sclerotial development in sclerotinia sclerotiorum is linked with ph and camp se

24、nsing j mol plant microbe in, 2004,17：404.12 erental a, dickman m b, yarden 0. sclerotialdevelopment in sclerotinia sclerotium :awakeningmolecular analysis of a "dormant”strueturejfungal biol rev, 2008,22：6.13韩建荣，姚鹏，戚敬，等.青霉pt95菌株渗出液的产生及理化性 质的研究打山西大学学报：自然科学版，2007, 30 (2)： 274.physicochemical pro

25、perties of medicinal funguspolyporus umbellatus sclerotial exudate xing yong-mei, li hong-lian, guo shunxing (1. institute of medicinal plant development, chinese academy of medical sciences &peking union medical college, beijing 100193, china；2. agriculture commit tee of guxian country, guxian

26、042400, china)abstract this study was conducted to investi百ate the physicochemical proper ties of polyporus umbel latus sclerotial exudate. morphological characteristics of the sclerotia and its exudate were observed during differe nt st ages of scler otial format io n. the ph of the exudate was detected at different time during cultivation. a phenol-sulfuric acid method was employed to determine the polysaccharide content of