双水相萃取实验

1、1生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验两水相萃取蛋白质的相图两水相萃取蛋白质的相图及分配系数及分配系数2PEG/(NH4)2SO4两水相系统的相图两水相系统的相图生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验一一. . 实验原理实验原理 高聚物与无机盐成相的原因：高聚物与无机盐成相的原因： 用相图表示两水相形成的条件和定量关系，用相图表示两水相形成的条件和定量关系， 它是一根双节线（它是一根双节线（binodalbinodal）。）。无机盐盐析作用。无机盐盐析作用。PQ互溶区互溶区两相区两相区3二. 相图的制作方法(一一) 溶液配制溶液配制 配制配制43.00%（g/ml）的（）

2、的（NH4)2SO4溶液：溶液： 称硫酸胺称硫酸胺215.0g少量水少量水溶解溶解稀释至稀释至500ml密度计测密度计测密度密度生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验4PEG400% (NH4)2SO4%按表格重复操作按表格重复操作PEG400 0.700g H2O 0.5ml (NH4)2SO4混和混和 H2O 0.3ml浑浊浑浊记录记录(NH4)2SO4 ml数数混均混均（二）相图的制作（二）相图的制作澄清澄清生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验5表表1. 相图制作表相图制作表次次数数H H2 2O Og g(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4溶液加量溶液加量

3、 ml ml g g纯纯(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4累计量累计量 g g溶液累溶液累计总量计总量 g gPEGPEG%(g/g%(g/g) )(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4%(g/g)%(g/g)12345670.50.50.30.30.30.30.30.30.50.50.50.50.50.5(NH4)2SO4溶液浓度溶液浓度 43.00 % (g/ml) 密度密度 1.20 g 溶液溶液 /ml溶液溶液PEG400 = _ g 温度温度 = _生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验6两水相系统中蛋白质分配系数的测定两水相系统中蛋白质分配系数的测定1实验

4、原理实验原理 1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度地分配，分配系数地分配，分配系数 K = C上上/ C下下。 相比相比R = V上上/ V下下 2. 考马斯亮兰（考马斯亮兰（Coomassie Brilliant Blue G-250） 比色比色法测定两相中蛋白质浓度：考马斯亮兰法测定两相中蛋白质浓度：考马斯亮兰G250是一种是一种染料，酸性溶液中呈棕红色。与蛋白质通过范德华键染料，酸性溶液中呈棕红色。与蛋白质通过范德华键结合成兰色复合物，结合成兰色复合物，595nm波长有最大吸收值。波长有最大吸收值。 低浓度时，与蛋白质浓度的关

5、系服从比尔定律。低浓度时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验72操作方法操作方法（一）蛋白质在两相中的分配：（一）蛋白质在两相中的分配： 10ml10ml刻度刻度离心试管离心试管 加加(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4固体固体1.301.30克克 加加PEG400PEG4002.002.00克克 加入糖化酶加入糖化酶2.00ml2.00ml 加水加水总重总重8.00g8.00g离心离心 30003000转转/ /分分5min5min 振摇混和振摇混和( (固体溶解固体溶解) ) 求相比求相比 R R =V =V上上/V/V下下求蛋白质分配

6、系数求蛋白质分配系数 K = CK = C上上/ C/ C下下生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验8生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验 试剂配制试剂配制1. 1. 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250G-250溶液配制：溶液配制： 精确称取精确称取50mg50mg考马斯亮兰，溶于考马斯亮兰，溶于10ml 95%10ml 95%乙醇中，并乙醇中，并加入加入50ml 85% 50ml 85% 浓磷酸，然后，用浓磷酸，然后，用H H2 2O O稀释定容至稀释定容至500ml500ml。2. 2. 牛血清蛋白溶液配制：牛血清蛋白溶液配制： 精确称取精确称取0.012g0.012g左

7、右的牛血清蛋白，加入左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl,0.105gNaCl,溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml100ml，配成，配成 120120 g/mlg/ml的牛血清蛋白原液。的牛血清蛋白原液。 （二）比色测定上、下相蛋白质浓度：（二）比色测定上、下相蛋白质浓度：9生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验牛血清蛋白牛血清蛋白mlmlH H2 2O mlO ml0.2 0.4 0.6 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.8 1.00.8 0.6 0.4 0.8 0.6 0.4 0.2 / 0.2 / 上相液上相液1.0ml

8、1.0ml/ /下相液下相液0.1ml0.1ml 0.9ml0.9ml加考马斯亮兰加考马斯亮兰5.00ml5.00ml，混匀，混匀，252511保温保温1010分钟，冷却分钟，冷却 蛋白质总重蛋白质总重 g g/ODOD（595nm595nm） 标准曲线制作方法：见下表标准曲线制作方法：见下表 上相液：吸取上相液：吸取0.5ml 0.5ml 蒸馏水定容至蒸馏水定容至50ml 50ml 按按下表操作。下表操作。 下相液：直接按下表操作。下相液：直接按下表操作。 空白液：吸取空白液：吸取1.0ml 1.0ml 蒸馏水蒸馏水 5ml 5ml 考马斯亮兰液。考马斯亮兰液。 表表1. 标准曲线和样品的测

9、定标准曲线和样品的测定 牛血清蛋白浓度牛血清蛋白浓度 120 g /ml10mlgKbODC/100上上相标准曲线图：标准曲线图：ODgOD = K OD = K g g b b 求斜率求斜率K K和截距和截距b b mlgKbODC/1 . 01下下相生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验11生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验 思考和讨论思考和讨论: :二二. . 选择正确的离心操作顺序选择正确的离心操作顺序: : 1. 1. 将装有相等体积的两只离心试管将装有相等体积的两只离心试管( (水和样品液水和样品液) )对称放在对称放在离心机中。离心机中。 2. 2. 将两

10、只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡 对称放在离心机中。对称放在离心机中。1 1加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全部溶解，原因是什么？部溶解，原因是什么？ 3 3选择正确的吸出上、下相操作方法：选择正确的吸出上、下相操作方法： 1. 1. 吸管小心插入下相，吸出下相吸管小心插入下相，吸出下相 换吸管，吸出上换吸管，吸出上相。相。 2. 2. 吸管小心吸出上相吸管小心吸出上相 插入下相，吸出下相。插入下相，吸出下相。 3. 3. 吸管小心吸出上相吸管小心吸出上相 将多余上相和少量下相弃将多余上相和少量下相弃去去 换吸管，吸出下相。换吸管，吸出下相。12生化物质分离纯化基础实验生化物质分离纯化基础实验四四. 可调式移液器（枪）正确的操作方法（是非题）：可调式移液器（枪）正确的操作方法（是非题）： 1. 要吸取要吸取0.4ml液体，可用液体，可用1000 5000 l 规格的枪。规格的枪。 2. 向顺时针方向旋，数值减小；逆时针方向旋