免疫共沉淀GEImmunoprecipitationStarterPack

1、免疫共沉淀(GE Immunoprecipitation Starter Pack )（一）基本原理研究细胞内蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的相互作用被保存了下来，这时在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体FC片段特异性结合的结合于Agarose珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A/G（其亲和力对pH值非常敏感，随pH值的降低而急剧降低），若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋 白一兴趣蛋白一抗兴趣蛋白抗体一Protein A/G PLUS-Agarose ”，经沸水浴，

2、复合物中的四组分又被分开。然后经 Western blott ing检测目的蛋白是否为预测蛋白。这种方法的优点是：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用的蛋白 复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质一蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方 法本身具有冒险性。（二）实验方法免疫共沉淀的实验过程比较简单，分为三个阶段：

3、a.细胞裂解液的制备；b.细胞裂解液非特异性本底的预处理；c.免疫复合物的形成与纯化。1. 10cm培养皿培养细胞，实验当天细胞约长满80- 90%2. 吸除细胞培养液，用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS3. 加入 1ml 预冷的包含 1 x Protease Inhibitor Cocktail （ Roche）的细胞裂解液，4 °C 孵育10-15min，不时敲击10cm培养皿壁。4. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿上刮下来后将裂解液转移至预冷1.5mlEP 管。（如果裂解获得的蛋白样品浓度过高， 可用裂解液适当稀释， 如果蛋白样品浓度过低， 在以后的 裂解过程中宜适

4、当减少裂解液的用量）。5. 12,000g4°C离心10min，将上清液转移至一新的 1.5ml EP管，不要吸取到白色沉淀，置于冰上（细胞裂解液可-80 °C长期保存）。6. 进行BCA法蛋白定量。7. 吸取适量的 nProtein A Sepharose 4 Fast Flow/Protein G Sepharose 4 Fast Flow至 1.5ml EP 管（nProtein A Sepharose 4 Fast Flow and Protein G Sepharose 4 Fast Flow are supplied preswollen in 20% etha

5、nol）,加入 1ml PBS进行清洗，12000g 4° C离心 20秒，弃上清，反复两次，然后用细胞裂解液配制成50%浓度的悬液，建议减掉枪尖部分，以避免在涉及琼脂糖珠的操作过程中破坏琼脂糖珠。8. （可选）如最后检验步骤是免疫印迹，则预处理可无须进行。a. EP 管加入 50 - 100 卩 l nProtein A Sepharose 4 Fast Flow 或 Protein G Sepharose 4Fast Flow悬液，放置静音混匀器4° C混匀1h。b. 12000g4°C离心20秒，将上清转移到一新的EP管，置于冰上。9. 根据测定结果取约 5

6、00ul 上清物（approximately 100- 500 卩 g total cellularprotein ）至一新的1.5mlEP管，确保每管蛋白总量相等，根据需要加入1-10卩l或0.2- 2ug的一抗（一般来说，2ug 一抗已足够，如抗体过多的话容易产生非特异性本底，尤其是多克 隆抗体），4° C混匀1h （1h的孵育时间可使大部分抗体完成结合反应），同时留取少量上清液备总体蛋白 Western blot 分析 。10. 加入 50l 充分重悬的 nProtein A Sepharose 4 Fast Flow/Protein G Sepharose4 Fast Flo

7、w（50% slurry），放置静音混匀器 4° C,混匀1h至过夜（尽管有些手册建议反应过夜，但实际上并无好处，还会增加背景）。11. 12000g 4°C离心20秒，为了降低背景，去除未结合蛋白，应尽量吸除上清，但宁可留下少量上清也不能吸掉 Protein A/G PLUS-Agarose 。12. 1mlPBS 或细胞裂解液洗涤沉淀 4 次（ RIPA 裂解液有时候会破坏琼脂糖珠 -抗原抗体复合物内部的结合） ， 洗涤时离心条件和吸除上清的要求同步骤11。13. 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入40卩I 1 X SDS-PAGE电泳上样缓冲液（DTT会使 IgG 轻

8、重链解离） ，瞬时高速离心把样品离心至管底。14. 上样样品95-100 C处理3-10min后12000g离心20秒（免疫复合物经电泳上样缓冲 液及沸水浴后 , 原先和 Protein A/G PLUS-Agarose 结合的抗体及兴趣蛋白都会脱落下来 , 离 心沉淀protein A/G PLUS-Agarose ）。将上清转移到另一个 EP管，取20卩I上清液按相应 的 Western BIot 步骤继续实验，应选择合适浓度的凝胶以使目的蛋白与 IgG 的轻重链尽量 分离以避免干扰。（三）注意事项1. 免疫共沉淀 （co-IP） 通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可

9、以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。2. 如何避免 IgG 轻重链的影响 （只要 IP 和 IB 用的是同一种属的抗体，且兴趣蛋白与 IgG 轻、重链分子量有差异，就应该能够看到轻、重链两条带，尤其是重链，轻链可能比较 模糊） ：a. 采用不同种属来源的抗体，如用鼠抗作 co-IP, 兔抗作 Western BIot 检测（因为一般情况下，用于免疫沉淀捕获抗原的抗体也也会一块跟着跑SDS-PAGE并转膜，如果 WesternBIot 还用同样来源的抗体，那么二抗在结合一抗的同时，也会识别膜上捕获抗原的抗体的轻重链，出现25KD 55KD两条杂带，干扰试验结果，尤其是你的目的蛋白的

10、分子量与抗体 轻重链相近的时候。 而不同种属来源的一抗因为跟二抗没有交叉反应， 所以可以避免这个问 题）。b. 使用 eBioscience 的 TrueBIot 系列二抗 ,此二抗特异性识别轻重链间的二硫键， 不能 识别分开的轻链和重链。c. 采用合适的试剂盒，如 Pierce Co-Immunoprecipitation Kit ， GenScript One-Step CompIete IP-Western Kit 。3. 设置对照：a. 同型抗体对照：如果 co-IP 的一抗是鼠源的 IgG, 就用 normaI mouse IgG 做对照 ,说 明蛋白是特异性的抗体 IP 下来的。b

11、. 不加一抗的对照：如果结果有很多杂带或根据分子量仍不好判断目的蛋白的话，可设立这个对照。4. 抗体的性质对免疫沉淀影响很大。般来说，多抗是免疫沉淀最好的选择。另外，纯化的单抗、腹水和杂交瘤上清液也可用于免疫沉淀。? Polyclonal serum contains antibodies against multiple epitopes of an antigen,which helps stabilize the antigen-antibody- Protein A/G PLUS-Agarose complexes, but which also constitutes a probl

12、em with regard to high background during analysis.? Monoclonal antibodies are more specific, which reduces background but sometimes means that less stable immune complexes are formed due to lower affinity. This can be overcome by using pools of different monoclonal antibobodies.5. 从蛋白样品收集开始，所有步骤中蛋白样

13、品都必须在4 C或冰上操作。6. 1 X SDS-PAGE电泳上样缓冲液：60 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)100 mmol/L 二硫苏糖醇( DTT)2% w/v SDS0.01% w/v 溴酚蓝10% 甘油不含有二硫苏糖醇 (DTT)的1 X SDS-PAGE电泳上样缓冲液可保存于室温，二硫苏糖醇(DTT)配成1 mmol/L的贮存液，使用前现加。1 mmol/L二硫苏糖醇(DTT):用20ml 0.01mol/L 的乙酸钠溶液(pH 5.2 )溶解3.09g DTT,过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20 C。7. Protein A和Protein G对不同类型的抗

14、体结合能力存在差异，Protein A和ProteinG的选择主要取决于实验所用抗体的来源与亚类。Species Immunoglobulin IsotypeProtein AProtein GHuman IgG1+IgG2+IgG3-+IgG4+IgMUse anti Human IgMIgE-+IgA-+Mouse IgG1+IgG2a+lgG2b+lgG3IgMRat IgG1IgG2aIgG2bIgG2cGoat All isotypesRabbit All isotypesSheep All isotypes-=no binding+ = weak binding+ +Use anti Mouse IgM- +-+-+-+ +- + + = medium binding+ + + = stro ng8.常见裂解液配方如下:NameDescriptionStringencyLow salt1% IGEPAL CA-630± 50 mM Tris, pH 8,at 1 mM PMSF+NP-40(IGEPAL 匚A