细菌药敏试验及耐药机制研究进展

1、细菌药敏试验及耐药机制细菌药敏试验及耐药机制研究进展研究进展安徽省细菌耐药监控中心安徽省细菌耐药监控中心安徽医科大学临床检验诊断学教研室安徽医科大学临床检验诊断学教研室安徽医科大学第一附属医院检验科安徽医科大学第一附属医院检验科徐元宏徐元宏一、药敏试验种类1、 纸片扩散法2、稀释法 稀释法包括宏量肉汤稀释法(macrodilution test)、微量肉汤稀释法(microdilution test)、琼脂稀释法(agar dilution test)。 3、E-test法 细菌药敏试验-宏量稀释法Minimal inhibitory concentration (MIC)Reference

2、method. Add standard inoculum to dilutions of antibiotic. Incubate overnight. MIC is lowest concentration that inhibits growth (can also be performed by agar dilution). Interpretation (S or R) is based on achievable drug levels 104 cfu420mg/ml微量液体稀释法细菌药敏试验- E-test法E-testStrips containing

3、 a gradient of antibiotic are placed on lawn of bacteria and incubated overnight. MIC is determined at point where zone of inhibition intersects scale on strip.Combines ease of KB with an MIC method. Particularly useful for S. pneumoniae.二、药敏试验基本条件1.肠杆菌科纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法 试验条件 培养基 Mueller-Hinton 琼脂、C

4、AMHB、Mueller-Hinton 琼脂 接种物 生长法或直接菌落悬液法，相当于 0.5 麦氏标准。 孵育 352；空气；16-18 小时 推荐的质控菌株 大肠埃希菌 ATCC 25922； 大肠埃希菌 ATCC 35218（为监控-内酰胺酶/-内酰胺抑制剂纸片用） （1）对于从粪便中分离的沙门菌和志贺菌属，常规仅测试和报告氨苄西林，一种喹酮类药和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。此外对于胃肠外分离的沙门菌属还一定要测试并报告氯霉素及其某一种代头孢菌素的结果。 （2）所有确认产ESBLs的菌株应当报告为耐所有青霉素类，头孢菌素类和氨曲南。（3）出于对流行性，治疗及感染控制方面的考虑，应该把从尿中分离的

5、所有菌株做ESBLs 筛选试验作为一个基本制度。（4）仅当被认为与临床有关时（如菌血症）才进行奇异变形杆菌ESBLs筛选试验（5）肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属可发展为耐药。最初分离的敏感菌株在开始治疗34天内可变为耐药，因此对重复分离菌株应重新进行药敏试验。 。 2.铜绿假单胞菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法 试验条件 培养基 Mueller-Hinton 琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton 琼脂 接种物 生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5 麦氏标准。 孵育 352；空气；16-18 小时 推荐的质控菌株 大肠埃希菌 ATCC 25922；铜绿假单胞菌 ATCC27853

6、； 大肠埃希菌 ATCC 35218（为监控-内酰胺酶/-内酰胺抑制剂纸片用） 用纸片扩散法能可靠地测定分离于囊性纤维化病人的铜绿假单菌的敏感性，但在作为敏感结果报告前，应将孵育时间延长至24小时。 3.不动杆菌属纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法 试验条件 培养基 Mueller-Hinton 琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton 琼脂 接种物 生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5 麦氏标准。 孵育 352；空气；20-24 小时 推荐的质控菌株 大肠埃希菌 ATCC 25922；铜绿假单胞菌 ATCC27853； 大肠埃希菌 ATCC 35218（为监控-内酰胺酶/-内酰胺抑制剂

7、纸片用） 4.洋葱伯克霍尔德菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法 试验条件 培养基 Mueller-Hinton 琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton 琼脂 接种物 生长法或直接菌落悬液法，相当于 0.5 麦氏标准。 孵育 352；空气；20-24 小时 推荐的质控菌株 大肠埃希菌 ATCC 25922；铜绿假单胞菌 ATCC27853； 大肠埃希菌 ATCC 35218（为监控-内酰胺酶/-内酰胺抑制剂纸片用） （1）洋葱伯克霍尔德菌纸片扩散法解释标准 抑菌环直径（mm） 相对应 MIC 值 （g/ml） 试验/报告 分组 抗微生物药纸片含药量 R I S R S 注释 头孢类（注

8、射药物）（包括头孢菌素,和代） B 头孢他啶 30g 17 18-20 21 32 8 碳青霉烯类 B 美洛培南 10g 15 16-19 20 16 4 四环素类 B 米诺环素 30g 14 15-18 19 16 4 叶酸代谢途径抑制剂 A 甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 1.25/23.75g 10 11-15 16 8/152 2/38 （2）洋葱伯克霍尔德菌液体稀释法、琼脂稀释法解释标准 MIC 值（g/ml） 试 验 /报告 分组 抗微生物药 S I R 注释 内酰胺类/内酰胺类抑制剂 B 替卡西林/克拉维酸 16/2 32/2-64/2 128/2 头孢类（注射药物）（包括头孢菌素,和代）

9、 B 头孢他啶 8 18 32 碳青霉烯类 B 美洛培南 4 8 16 四环素类 B 米诺环素 4 8 16 氟喹诺酮类 B 左氧沙星 2 4 8 phenicols B 氯霉素 8 16 32 叶酸代谢途径抑制剂 A 甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 2/38 - 4/76 5.嗜麦芽窄食单胞菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法 试验条件 培养基 Mueller-Hinton 琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton 琼脂 接种物 生长法或直接菌落悬液法，相当于 0.5 麦氏标准。 孵育 352；空气；20-24 小时 推荐的质控菌株 大肠埃希菌 ATCC 25922；铜绿假单胞菌 ATCC278

10、53； 大肠埃希菌 ATCC 35218（为监控-内酰胺酶/-内酰胺抑制剂纸片用） （1）嗜麦芽窄食单胞菌纸片扩散法解释标准 抑菌环直径（mm） 相对应 MIC 值 （g/ml） 试验/报告 分组 抗微生物药 纸片含药 量 R I S R S 注释 四环素类 B 米诺环素 30g 14 15-18 19 16 4 氟喹诺酮类 B 左氧氟沙星 5g 13 14-16 17 8 2 叶酸代谢途径抑制剂 A 甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 1.25/23.75g 10 11-15 16 8/152 3/38 （2）嗜麦芽窄食单胞菌液体稀释法、琼脂稀释法解释标准 MIC 值（g/ml） 试验/报告 分组 抗微生

11、物药 S I R 注释 内酰胺类/内酰胺类抑制剂 B 替卡西林/克拉维酸 16/2 32/2-64/2 128/2 头孢类（注射药物）（包括头孢菌素,和代） B 头孢他啶 8 16 32 四环素类 B 米诺环素 4 8 16 氟喹诺酮类 B 左氧沙星 2 4 8 phenicols B 氯霉素 8 16 32 叶酸代谢途径抑制剂 A 甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 2/38 - 4/76 6.葡萄球菌属纸片扩散法 试验条件 培养基 Mueller-Hinton琼脂 接种物 直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。 孵育 352；空气；1618 小时；测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素需24 小时。试

12、验温度超过35不能检测MRS。 推荐的质控菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923；大肠埃希菌A TCC 35218（为监控-内酰胺酶/-内酰胺抑制剂纸片用） ；金黄色葡萄球菌 ATCC BAA-977 和金黄色葡萄球菌ATCC BAA-976（用于克林霉素诱导试验质量评估） 7.葡萄球菌属液体稀释法、琼脂稀释法 试验条件 培养基 肉汤稀释法：CAMHB；2NaCL+ CAMHB 用于检测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林； 琼脂稀释法：Mueller-Hinton琼脂；2NaCL+ MHA用于检测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林 接种物 直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。 孵育 352；空气；161

13、8 小时；测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素需24 小时。试验温度超过35不能检测MRS。 推荐的质控菌株 金黄色葡萄球菌ATCC29213；大肠埃希菌ATCC 35218（为监控-内酰胺酶/-内酰胺抑制剂纸片用） ；金黄色葡萄球菌 ATCC BAA-977 和金黄色葡萄球菌ATCC BAA-976（用于克林霉素诱导试验质量评估） 8.肠球菌属纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法 试验条件 培养基 Mueller-Hinton琼脂，CAMHB,MHA 接种物 生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。 孵育 352；空气；16-18小时；测万古霉素需24小时 推荐的质控菌株 金黄色葡萄

14、球菌ATCC25923(Mueller-Hinton琼脂);粪肠球菌A TCC29212 （1）对于肠球菌属，头孢菌素，氨基糖苷类（筛选高水平耐药除外），克林霉素和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑可以在体外显示活性但临床上无效，因此这些菌株不应该报告为敏感。（2）肠球菌心内膜炎要求大剂量青霉素或氨苄西林，或万古霉素或替考拉宁联合庆大霉素或链霉素以增加杀菌作用。（3）庆大霉素和链霉素筛选试验，能够预测氨苄西林、青霉素或万古霉素与一种氨基糖苷类抗生素之间的协同效应。其它的氨基糖苷类不需进行测试，因为它们对肠球菌的活性并不优于庆大霉素和链霉素。（4）对血和脑脊液分离株推荐用头孢硝噻吩-内酰胺酶试验。-内酰胺酶试

15、验阳性提示青霉素耐药，同时也对酰胺基，羧基和脲基青霉素耐药。9.流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌纸片扩散法、液体稀释法 试验条件 培养基 嗜血杆菌试验培养基(HTM)，HTM肉汤 接种物 直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准 孵育 352；5%CO2;16-18小时（纸片扩散法）；空气，20-24小时（液体稀释法） 推荐的质控菌株 流感嗜血杆菌 A TCC49247；流感嗜血杆菌 A TCC49766；大肠埃希菌A TCC35218（测试阿莫西林/克拉维酸时） 10.淋 病 奈 瑟 菌 纸 片 扩 散 法 、 琼 脂 稀 释 法 试 验 条 件 培 养 基 G C琼 脂 基 础 +1% 特 定 的

16、 生 长 补 充 品 。 纸 片 扩 散 法 不 需 要 使 用 无 半 胱 氨 酸的 生 长 补 充 品 。 接 种 物 直 接 菌 落 悬 液 法 ， 相 当 于0.5麦 氏 标 准 孵 育 36 1 (不 超 过37 )； 5% CO 2； 20-24 小 时 。 推 荐 的 质 控 菌 株 淋 病 奈 瑟 菌A TCC49226 11.肺 炎 链 球 菌 片 扩 散 法 、 液 体 稀 释 法 试 验 条 件 培 养 基 M ueller-H inton琼 脂 +5% 羊 血 ； CA M H B+2.55% V /V融 解 的 马 血 接 种 物 直 接 菌 落 悬 液 法 ， 相

17、当 于0.5麦 氏 标 准 孵 育 35 2 ； 5% CO 2； 20-24小 时 推 荐 的 质 控 菌 株 肺 炎 链 球 菌A TCC49619 （1）肺炎链球菌对苯唑西林的抑菌环20mm的菌株对青霉素敏感(MIC0.06g/ml) （2）苯唑西林的抑菌环19mm的菌株应当测定青霉素、美洛培南和头孢噻肟或头孢曲松的MICs 12.肺炎链球菌之外其它链球菌的纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法 试验条件 培养基 Mueller-Hinton 琼脂+5%羊血; CAMHB+2.55%V/V 融解的马血；Mueller-Hinton琼脂+5%羊血 接种物 直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准

18、孵育 352； 5%CO2； 20-24小时 （纸片扩散法、 琼脂稀释法） ； 空气， 20-24小时（液体稀释法） 推荐的质控菌株 肺炎链球菌A TCC49619 13.幽门螺杆菌的琼脂稀释法 试验条件 培养基 Mueller-Hinton琼脂+5%羊血 接种物 生长法或直接菌落悬液法，相当于2麦氏标准。 孵育 352；微需氧；3天 推荐的质控菌株 幽门螺杆菌ATCC43504 幽 门 螺 杆 菌 的 琼 脂 稀 释 法 解 释 标 准 MIC值 （ g/ml） 试验/报 告 分 组 抗 微 生 物 药 S I R 注 释 大 环 内 酯 类 A 克 拉 霉 素 0.25 0.5 1.0 1

19、4.霍乱弧菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法 试验条件 培养基 Mueller-Hinton琼脂，CAMHB,MHA 接种物 生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。 孵育 352；空气；16-18小时 推荐的质控菌株 大肠埃希菌ATCC25922 （ 1） 霍 乱 弧 菌 纸 片 扩 散 法 解 释 标 准 抑 菌 环 直 径 （ mm） 相 对 应MIC值 （ g/ml） 试验/报 告 分 组 抗微生物药 纸 片 含 药 量 R I S R S 注 释 青 霉 素 类 A 氨 苄 西 林 10g 13 14-16 17 32 8 四 环 素 类 C 四 环 素 30g 14 15-

20、18 19 16 4 叶 酸 代 谢 途 径 抑 制 剂 B 甲氧苄啶/磺胺甲噁 唑 1.25/23.75g 10 11-15 16 8/152 2/38 C 磺 胺 药 250 g或 300g 12 13-16 17 350 100 PHENICOLS C 氯 霉 素 30g 12 13-17 18 32 8 （ 2） 霍 乱 弧 菌 液 体 稀 释 法 、 琼 脂 稀 释 法 解 释 标 准 M IC值 （ g/ml） 试验/报 告 分 组 抗 微 生 物 药 S I R 注 释 青 霉 素 类 A 氨 苄 西 林 8 16 32 四 环 素 类 C 四 环 素 4 8 16 O 多 西

21、环 素 4 8 16 叶 酸 代 谢 途 径 抑 制 剂 B 甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 2/38 - 4/76 C 磺 胺 药 256 - 512 PHENICOLS C 氯 霉 素 8 18 32 15.脑膜炎奈瑟菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法 试验条件 培养基 含 5%绵羊血的 Mueller-Hinton 琼脂；CAMHB+25%融解的马血；MHA+5脱纤维羊血 接种物 直接菌落悬液法，相当于0.5 麦氏标准（纸片扩散法）；来自20-24 小时CO2 环境巧克力平板的直接菌落悬液法，相当于0.5 麦氏标准（液体稀释法、琼脂稀释法）。 孵育 352；5%CO2；20-24 小时 推荐的质

22、控菌株 肺炎链球菌ATCC49619，5%CO2 环境；大肠埃希菌ATCC25922（在空气或5%CO2 环境）用于环丙沙星、萘啶酸和米诺环素监控 （1）脑膜炎奈瑟菌纸片扩散法解释标准 抑菌环直径（mm） 相对应 MIC 值 （g/ml） 试 验 /报告 分组 抗微生物药 纸片 含药量 R I S R S 注释 青霉素类 c 青霉素 10U - - - 0.5 0.06 c 氨苄西林 10g - - - 2 0.12 头孢类 c 头孢噻肟 30g - - 34 - 0.12 c 头孢曲松 30g - - 34 - 0.12 碳青霉烯类 c 美罗培南 10g - - 30 - 0.12 大环内酯

23、类 c 阿齐霉素 15g - - 20 - 2 四环素类 c 米诺环素 30g - - 26 - 2 氟喹诺酮类 c 环丙沙星 5g 32 33-34 35 0.12 0.03 c 萘啶酸 30g 25 - 26 8 4 叶酸代谢途径抑制剂 c 甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 1.25/23.75g 25 26-29 30 0.5/9.5 0.12/2.3 PHENICOLS c 氯霉素 30g 19 20-25 26 8 2 ANSAMYCINS c 利福平 5g 19 19 25 2 2 （2）脑膜炎奈瑟菌液体稀释法、琼脂稀释法 MIC 值（g/ml） 试 验 /报告 分组 抗微生物药 S I R

24、注释 青霉素类 C 青霉素 0.06 0.12-0.25 0.5 C 氨苄西林 0.12 0.25-1 2 头孢类（包括头孢菌素,和代） C 头孢噻肟 0.12 - - C 头孢曲松 0.12 - - 碳青霉希类 C 美罗配南 0.25 - - 大环内酯类 C 阿齐霉素 四环素类 C 米诺环素 2 - - 氟喹诺酮类 C 环丙沙星 0.03 0.06 0.12 C 左氧沙星 0.03 0.06 0.12 叶酸代谢途径抑制剂 C 甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 0.12/2.4 0.25/4.75 0.5/9.5 C 磺胺药 2 4 8 PHENICOLS C 氯霉素 2 4 8 ANSAMYCINS C

25、 利福平 0.5 1 2 16.炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、土拉热弗朗西丝菌、布鲁氏菌属液体稀释法 试验条件 培养基 布氏肉汤： PH7.07.2,适合布鲁氏菌属； CAMHB适合炭疽芽孢杆菌、 鼠疫耶尔森菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌；土拉热弗朗西丝菌需加2生长物质 接种物 生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。 孵育 352，空气，20-24 小时；对于鼠疫耶尔森菌需要 24 小时；对于布鲁氏菌属、土拉热弗朗西丝菌需要48小时。 推荐的质控菌株 大肠埃希菌ATCC25922 （适合所有微生物） ； 大肠埃希菌ATCC35218 （适合

26、阿莫西林/克拉维酸和类鼻疽伯克霍尔德菌） ；金黄色葡萄球菌ATCC29213(适合炭疽芽孢杆菌和土拉热弗朗西丝菌)；铜绿假单胞菌ATCC27853（适合鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、土拉热弗朗西丝菌）；肺炎链球菌ATCC49619（只适合布鲁氏菌属） 炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、土拉热弗朗西丝菌、布鲁氏菌属液体稀释法解释标准 MIC 值（g/ml） 微生物分组 抗微生物药 S I R 注释 青霉素类 炭疽芽孢杆菌 青霉素 0.12 - 0.25 内酰胺类/内酰胺类抑制剂 类鼻疽伯克霍尔德菌 阿莫西林/克拉维酸 8/4 16/8 32/16 头孢类（

27、注射药物）（包括头孢菌素,和代） 鼻疽伯克霍尔德菌、 类鼻疽伯克霍尔德菌 头孢他啶 8 16 32 碳青霉烯类 鼻疽伯克霍尔德菌、 类鼻疽伯克霍尔德菌 亚胺培南 4 8 16 氨基糖苷类 庆大霉素 4 8 16 鼠疫耶尔森菌 链霉素 4 8 16 庆大霉素 4 土拉热弗朗西丝菌、 布鲁氏菌属 链霉素 8 四环素类 四环素 1.0 炭疽芽孢杆菌、 布鲁氏菌属 多西环素 1.0 四环素 4 8 16 鼠疫耶尔森菌、 鼻疽伯克霍尔德菌、 类鼻疽伯克霍尔德菌 多西环素 4 8 16 四环素 4 土拉热弗朗西丝菌 多西环素 4 氟喹诺酮类 炭疽芽孢杆菌 环丙沙星 0.5 鼠疫耶尔森菌 环丙沙星 1 2

28、4 环丙沙星 0.5 土拉热弗朗西丝菌 左氧沙星 0.5 叶酸代谢途径抑制剂 类鼻疽伯克霍尔德菌、鼠疫耶尔森菌 甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 2/38 - 4/76 布鲁氏菌属 甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 2/38 - PHENICOLS 鼠疫耶尔森菌 氯霉素 8 16 32 土拉热弗朗西丝菌 氯霉素 8 三、耐药表型的检验1、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌中ESBLs检测的筛选与确证试验 纸片法 ：初筛和确证液体稀释法：初筛和确证 （1）肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌中ESBLs检测的筛选与确证试验 （纸片法） 方法 初步筛选试验 表型确证试验 培养基 Muel

29、ler-Hinton琼脂 Mueller-Hinton琼脂 抗微生物药物纸片浓度 肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌： 头孢泊肟 10g 或头孢他啶 30g 或氨曲南 30g 或头孢噻肟 30g 或头孢曲松 30g 奇异变形杆菌： 头孢泊肟 10g 或头孢他啶 30g 或头孢噻肟 30g (使用一种以上的药物进行筛选将会提高检测的敏感性) 头孢他啶30g， 头孢他啶/克拉维酸 30g/10g 和头孢噻肟30g，头孢噻肟/克拉维酸 30g/10g 确证试验需要同时使用头孢噻肟和头孢他啶，单独和联合克拉维酸的复合制剂） 接种 按标准纸片扩散法的规定进行 按标准纸片扩散法的规定进行 孵育条件 3

30、5空气 35空气 孵育时间 16-18 小时 16-18 小时 判读结果 肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌： 头孢泊肟抑菌环直径17mm 头孢他啶抑菌环直径22mm 氨曲南抑菌环直径 27mm 头孢噻肟抑菌环直径27mm 头孢曲松抑菌环直径25mm 奇异变形杆菌： 头孢泊肟抑菌环直径22mm 头孢他啶抑菌环直径22mm 头孢噻肟抑菌环直径27mm 上述抑菌环直径提示菌株可能产生 ESBLs 2 个药物中有任何一个， 在加克拉维酸后，抑菌环直径与不加克拉维酸的抑菌环相比，增大值5mm 时，判定为产 ESBLs（ 如 ， 头 孢 他 啶 的 抑 菌 环 16mm；头孢他啶/克拉维酸的抑菌环2

31、1mm） 质控建议 当执行 ESBL 筛选试验时，肺炎克雷伯菌ATCC700603 被用于质量评估（如训练，能力或试验评价） ， 肺炎克雷伯菌 ATCC700603 或 大肠埃希菌 ATCC25922 用于常规 QC（如：每周或每日） 。 大肠埃希菌 ATCC25922（应在敏感范围） 肺炎克雷伯菌 ATCC700603： 头孢泊肟抑菌环 9-16mm 头孢他啶抑菌环 10-18mm 氨曲南抑菌环 9-17mm 头孢噻肟抑菌环 17-25mm 头孢曲松抑菌环 16-24mm 当执行 ESBL 确认试验时，肺炎克雷伯菌 ATCC700603* 和大肠埃希菌 ATCC25922 用于常规 QC（如

32、：每周或每日） 大肠埃希菌 ATCC25922：所测试药物联合克拉维酸后的抑菌环直径与单药抑菌环相比，增大值2mm。 肺炎克雷伯菌 ATCC700603： 头孢他啶/克拉维酸抑菌环直径增大5mm； 头孢噻肟/克拉维酸抑菌环直径增大3 mm。 （2）肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌中ESBLs 检测的筛选与确证试验 （液体稀释法） 方法 初筛试验 确证试验 培养基 CAMHB CAMHB 药物浓度 肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌： 头孢泊肟4g/ml 或 头孢他啶1g/ml 或 氨曲南1g /ml 或 头孢噻肟1g/ml 或 头孢曲松1g/ml 奇异变形杆菌： 头孢泊

33、肟1g/ml或 头孢他啶1g/ml或 头孢噻肟1g/ml （使用一种以上的药物进行筛选将会提高检测的敏感性） 头孢他啶 0.25-128g/ml, 头孢 他 啶 /克 拉 维 酸0.25/4-128/4g/ml 和头孢噻肟 0.25-64g/ml,头孢噻肟/克拉维酸0.25/4-64/4g/ml。确证试验需要同时使用头孢他啶、头孢噻肟，单独和联合克拉维酸复合制剂。 接种 按标准肉汤稀释法的规定进行 按标准肉汤稀释法的规定进行 孵育条件 35空气 35空气 孵育时间 16-20 小时 16-20 小时 结果判读 生长=可疑ESBLS产生 肺炎克雷伯菌、 产酸克雷伯菌和大肠埃希菌对于头孢泊肟MIC

34、8 g/ml或对于头孢他啶、 氨曲南、 头孢噻肟、 头孢曲松MIC2 g/ml； 奇异变形杆菌对于头孢泊肟、 头孢他啶、 头孢噻肟MIC2g/ml 对2个中任何一个药物的MIC，在加入克拉维酸后， MIC与不加克拉维酸的MIC 值降低3 个以上对倍稀释度，判定为 ESBLS（如头孢他啶的 MIC=8 g/ml，头孢他啶/克拉维酸的MIC为1g/ml） 质控建议 大肠埃希氏菌ATCC25922不长 肺炎克雷伯氏菌ATCC700603应当生长 头孢泊肟MIC8g/ml 头孢他啶MIC2g/ml 氨曲南MIC2g/ml 头孢噻肟MIC2g/ml 头孢曲松MIC2g/ml 肺炎克雷伯氏菌 ATCC70

35、0603：联合克拉维酸的复合制剂的MIC与单药的MIC相比， 应当降低3个以上对倍稀释度 2.耐甲氧西林葡萄球菌检测 （1）耐甲氧西林葡萄球菌纸片初筛法： 抗菌药物(纸片含药量) 微生物群 抑菌环直径（mm） 注释 头孢西丁（30g） 金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌 21 22 头孢西丁对金黄色葡萄球菌纸片扩散法抑菌环直径19mm应报告对苯唑西林耐药20mm应报告对苯唑西林敏感。 除路邓葡萄球菌外的凝固酶阴性葡萄球菌 24 25 头孢西丁对凝固酶阴性葡萄菌纸片扩散法抑菌环直径24mm应报告对苯唑西林耐药，25mm报告对苯唑西林敏感。 （2）耐甲氧西林葡萄球菌琼脂初筛法： 筛选试验 苯唑青霉素耐药

36、 培养基 含 NaCL 的 M-H 琼脂（4%W/V；0.68mol/l） 抗生素含量 6g/ml 苯唑青霉素或 10g/ml 甲氧西林 接种 直接菌落悬液约 0.5 麦氏比浊管，用拭子浸润菌悬液后，在平板表面点种或划线。 培养条件 35空气 培养时间 24 小时，对于甲氧西林/苯唑青霉素耐药的凝固酶阴性葡萄球菌，孵育48 小时后再检测最可靠。 结果 1 菌落=耐药 推荐质控菌 金黄色葡萄球菌 ATCC29213敏感，金黄色葡萄球菌 ATCC43300-耐药 3.D试验-克林霉素诱导耐药试验（1）机制：对大环内酯耐药的葡萄球菌可能有天然或诱导性对克林霉素的耐药通过erm 基因编码的23S rR

37、NA 甲基化也称为MLSB（大环内酯、林可和B 型链阳霉素）耐药，或只对大环内酯类耐药（由msrA 基因编码的外排机制）。（2）方法：MHA或血平板，纸片相邻试验，对于葡萄球菌，距红霉素纸片（15g/片）边缘1526mm 处放置克林霉素纸片(2g/片)来进行检测；对于-溶血链球菌，将克林霉素纸片(2g/片)和红霉素纸片（15g/片）贴在相邻的位置，纸片边缘相距12mm。（3）结果判读：35空气，16-20小时孵育后，克林霉素抑菌环不出现“截平”现象，应报告分离株对其敏感。邻近红霉素纸片侧克林霉素抑菌环出现“截平”现象（称为“D”抑菌环），提示存在可诱导的克林霉素耐药，应报告分离株对其耐药，在报告中应注明“通过诱导克林霉素耐药试验，推测此菌株对克林霉素耐药，克林霉素对某些病人可能仍有效”；若无“截平”现象，则应报告菌株对克林霉素敏感。 葡萄