赵学位论文-菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响

1、.东北农业大学学士学位论文 学号：A10100215菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响学生姓名：赵畅指导教师：刘丽波所在院系：食品学院所学专业：食品科学与工程东 北 农 业 大 学中国·哈尔滨2014年 6 月Northeast Agricultural University Bachelor Dissertation No. A10100215Inulin on the influence of thermal streptococcus and Bulgaria lactobacillus acidophilusCandidate: Zhao ChangSuperviso

2、r: Liu LiboCollege: Food Science CollegeMajor: Food Science and EngineeringNortheast Agricultural UniversityHarbin of ChinaJune 2014;菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响摘要本实验研究了菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长影响，在MRS培养基和M17培养基中添加4种不同浓度的菊粉，通过测定生长曲线、ph值曲线、乳酸的测定以及以菊粉为唯一碳源培养，结果表明，菊粉可促进嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长，但菊粉为唯一碳源并不利于乳酸菌的生长。在M17培养基中添加

3、3%的菊粉，嗜热链球菌生长最佳；在MRS培养基中添加4%的菊粉，保加利亚乳杆菌生长最佳。菊粉对乳酸菌生长的影响相应改变乳酸的产量。关键词：菊粉 嗜热链球菌 保加利亚乳杆菌IAbstract This experiment studied the inulin to heat of streptococcus and Bulgaria lactobacillus acidophilus, in MRS culture medium and M17 culture medium to add 4 different concentrations of inulin, through the det

4、ermination of growth curve lactic acid ph curve, and cultivation of inulin as sole carbon source, the results show that the inulin can promote heat of streptococcus and Bulgaria lactobacillus acidophilus, but inulin as the sole carbon source is not conducive to the growth of lactic acid bacteria in

5、the M17 culture medium adding 3% inulin, thermophilic grow best streptococcus; Add 4% of inulin in MRS culture medium, growth of lactic acid bacteria grow best lactobacillus Bulgaria inulin corresponding the influence of the change of lactic acid production.Keywords：inulin Streptococcus thermophilus

6、 Lactobacillus bulgaricus目录摘要I目录III1 前言11.1 菊粉11.2 研究目的及意义12 材料与方法22.1 实验材料22.1.1 供试菌株22.1.2 培养基22.1.2.1 MRS液体培养基22.1.2.2 M17液体培养基22.1.3 主要试验药品22.2 主要仪器设备22.3 试验方法22.3.1 菌株的活化22.3.2 菌株的培养22.3.3 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长曲线的测定42.3.4 菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响42.3.5 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌对菊粉的利用情况42.3.6 菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵乳酸的影响

7、42.4 统计学分析43结果与分析53.1嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长曲线53.2菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响63.3 菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵乳酸的影响114 结论13致 谢15 1 前言1.1 菊粉菊粉是植物中含有的一种特殊的天然果聚糖类碳水化合物，通过-2,1-糖苷键连接及末端连有一个葡萄糖残基的直链结构多糖。菊粉广泛存在于各种植物中，在菊芋和菊苣中含量最高，鲜质量高达20%，（干质量80%），它是除淀粉外植物的另一种能量储存的形式.菊粉可显著促进人大肠中双歧杆菌和乳酸杆菌生长，使大肠杆菌等有害菌数量减少。Kaplan等认为，果聚糖能促进乳酸菌生长，抑制有害

8、菌生长。1.2 研究目的及意义菊粉是一种低聚果糖和高聚果糖的混合物，具有水溶性膳食纤维和生物活性前体的生理功能，可作为防治肿瘤、冠心病、糖尿病、结肠癌、便秘等的保健食品配料和天然药物。不同相对分子质量的菊粉在功能性和工艺性上亦存在差异，本实验探讨了4种不同分子量的菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响，对四种不同效果的差异性做出初步评估，为实现菊粉的有效合理利用和选择性生产提供理论指导，对于提高菊粉的应用价值是很有意义的。2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 供试菌株本试验用菌株为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）KLDS和保加利亚乳杆菌（Lactoba

9、cillus bulgaricus）KLDS，乳品科学教育部重点实验室（东北农业大学）工业微生物菌种保藏中心（KLDS-DICC）保藏。2.1.2 培养基2.1.2.1 MRS液体培养基MRS液体培养基为保加利亚乳杆菌生长的培养基，配方如下：葡萄糖20g柠檬酸氢二铵2g蛋白胨10g磷酸氢二钾2g牛肉膏10g无水乙酸钠5g酵母粉5gMgSO4.7H2O0.58g吐温-801mLMnSO4.4H2O0.25g蒸馏水1000mL用1mol/L的NaOH溶液调pH为6.4±0.2,121高压蒸汽灭菌15min，备用。2.1.2.2 M17液体培养基M17液体培养基为嗜热链球菌生长的培养基，配

10、方如下：胰蛋白胨5.0g硫酸镁0.25g牛肉膏5.0g磷酸甘油二钠19.0g大豆蛋白胨5.0g乳糖5.0g酵母粉2.5g抗坏血酸0.5g蒸馏水1000mL用1mol/L的NaOH溶液调pH为6.9±0.2,121高压蒸汽灭菌15min，备用。2.1.3 主要试验药品葡萄糖天津市天力化学试剂有限公司乳糖天津市天力化学试剂有限公司牛肉膏北京奥博星生物技术有限责任有限公司酵母浸粉北京奥博星生物技术有限责任有限公司蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任有限公司大豆蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任有限公司胰蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任有限公司磷酸氢二钾（K2HPO4.3H2O）天津基准化学试剂有

11、限公司柠檬酸氢二铵天津市科密欧化学试剂有限公司无水乙酸钠天津市天力化学试剂有限公司硫酸锰（MnSO4.H2O）天津市风船化学试剂有限公司硫酸镁（Mg.7H20）天津市天力化学试剂有限公司吐温-80天津巴斯夫化工有限公司磷酸甘油二钠天津市天力化学试剂有限公司抗坏血酸天津市天力化学试剂有限公司其他试剂均为国产分析纯2.2 主要仪器设备各种规格手动移液器德国eppendorf股份公司HIRAYAMA HVE-50型高压灭菌器日本HIRAYAMA公司岛津UV2401PC紫外分光光度计日本岛津公司梅特勒托利多Delta320 pH计瑞士梅特勒托利多有限公司梅特勒托利多 PL2002电子天平瑞士梅特勒托利

12、多有限公司梅特勒托利多 PL203电子天平 瑞士梅特勒托利多有限公司SPX150B生化培养箱天津市泰斯特仪器有限公司GL21M离心机上海市离心机械研究所VD1320型洁净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司HJ-3恒温磁力搅拌器江苏金坛市中大仪器厂2.3 试验方法2.3.1 菌株的活化取在-80冰箱冻存的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌甘油冻存管，室温溶解后，振匀，按2%（v/v）的接种量分别接种到5mL M17培养基和5mL MRS培养基中，振匀，37恒温培养12h，传代活化2次。2.3.2 菌株的培养将活化好的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，按2%（v/v）分别接种量接种到200mL M17和MRS液

13、体培养基中，摇匀，37恒温培养至生长期中期，将培养至生长期中期的菌液按3%（v/v）接种量分别接种到500mL M17和MRS液体培养基中用于试验。2.3.3 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长曲线的测定将接种量为3%的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌培养基，放置在37，恒温静止培养，每隔2h分别取适量菌液，测定OD600nm和pH值。光密度值（OD值）检测原理：当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比。该方法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。2.3.4 菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响在M

14、17和MRS培养基原有成分不改变的基础上，分别添加1%、2%、3%、4%的菊粉，将嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌按3%（w/v）的接种量接种到培养基中，分别测定每组的OD600nm值和pH值，测定方法同上。2.3.5 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌对菊粉的利用情况嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌以菊粉为唯一碳源进行体外发酵试验，添加量分别与M17和MRS基础培养基中乳糖和葡萄糖添加量相等，观察两菌的生长情况，以培养时间为横坐标，培养基的OD值为纵坐标，绘制生长曲线。2.3.6 菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵乳酸的影响将接有嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的M17和MRS培养基及改良后的培养基（原有基础培养基

15、加有1%、2%、3%、4%菊粉，放置在37培养箱，培养24h，取适量样品进行培养基中乳酸含量的测定。乳酸含量的测定用高效液相色谱法（HPLC）。样品处理 取5mL培养至48h的发酵液，在4下，7,311×g离心10min，取上清液，经0.22m针头式过滤器过滤，用于乳酸浓度的测定, 如不立即测定，过滤液转移至10mL离心管，密封，放置在4保存。标准曲线的建立 精确称取100mg乳酸标品于10mL容量瓶里，超纯水溶解并定容，精密吸取储备液，然后依次稀释1.2、2、3、6、25倍，一系列浓度的标准品溶液用于高效液相色谱，以峰面积为纵坐标，乳酸浓度为横坐标做标准曲线，求出直线回归方程。色谱

16、条件 色谱柱为Aminex HPX-87H糖分析柱（氢型），300mm×7.8mm（BIO-RAD）,流动相为5mmol/mL的稀硫酸（1L去离子水中加270L98%的浓硫酸），流速0.5mL/min，柱温65，上样量为10L，检测器为紫外检测器，波长为210nm。2.4 统计学分析数据采用Microsoft Excel 2003软件统计分析，每个试验重复3次，结果用3次独立试验的均值±标准差（±SD）形式表示。试验采用Microsoft Excel 2003软件制图。3结果与分析3.1嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长曲线本试验测定了嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在M

17、17和MRS基础培养基中每培养2h的OD600nm和pH值，见表3-1和3-2。以培养时间为横坐标，OD600nm和pH值为纵坐标，建立嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长曲线，见图3-1和3-2。表3-1 嗜热链球菌生长OD600nm值和pH值Tab. 3-1 thermophilic growth of streptococcus OD600nm and pH values 培养时间（h）OD600nmPH值00.1776.6532.0256.1663.385.8893.5425.81123.5465.79153.5545.75183.5715.75213.5785.73243.585.7图3

18、-1嗜热链球菌生长曲线（正常M17培养基）Fig.3-1 thermophilic streptococcus growth curve (normal M17 culture)嗜热链球菌在正常M17培养基中6h就进入稳定生长期，培养24h其生长OD600nm值最高为3.58，pH呈下降趋势，培养24h，最低pH为5.7。表3-2 保加利亚乳杆菌OD600nm值和pH值Tab.3-2 lactobacillus Bulgaria OD600nm and pH values培养时间（h）OD600nmPH值00.0975.4430.1885.3760.5055.1491.2754.79123.8

19、23.97154.163.85184.23.81214.173.83244.223.81图3-2 保加利亚乳杆菌生长曲线（正常MRS培养基）Fig.3-2 Bulgaria lactobacillus growth curve (normal MRS culture medium保加利亚乳杆菌在正常MRS培养基中培养至13h时进入稳定生长期，培养24h其生长OD600nm值最高为3.58，pH呈下降趋势，培养24h，最低pH为5.7。3.2菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响对添加1%、2%、3%、4%（w/v）菊粉的M17和MRS基础培养基分别接种3%（v/v）的嗜热链球菌和保加利亚乳

20、杆菌，37恒温培养，每隔3h测定各培养基的OD600nm和pH值，见表3-3至3-4。不同菊粉添加量下，两株菌的生长曲线和pH曲线见图3-3和3-4。表3- 3添加菊粉后嗜热链球菌生长OD600nm值和pH值Tab.3-3 after adding inulin thermophilic growth of streptococcus OD600nm and pH values培养时间（h）1%菊粉组2%菊粉组3%菊粉组4%菊粉组OD600nmpHOD600nmpHOD600nmpHOD600nmpH00.1686.650.1736.610.1776.580.1716.631.9866.082

21、.0016.032.1425.952.058663.3855.853.495.763.7655.663.575.793.6545.774.245.674.5995.544.4475.61123.6575.684.345.574.6285.474.4685.53153.665.644.3475.534.6335.44.4735.47183.725.624.3565.54.6385.374.4815.43213.75.64.365.514.6425.384.4845.42243.6725.594.3625.484.6435.354.4865.42图3-3a 添加菊粉后嗜热链球菌生长OD600nm值

22、Fig.3-3 a thermophilic after adding inulin streptococcus OD600nm value growth图3-3b 添加菊粉后嗜热链球菌pH变化Fig.3-3 b after adding inulin thermophilic streptococcus pH changes由表3-3和图3-3可知，嗜热链球菌在1%菊粉添加量的培养基和正常培养基中生长，都是在培养至9h时进入稳定期，1%菊粉可促进嗜热链球菌的生长，但是不太明显，1%菊粉添加组0D600nm最大为3.67，稍高于不加菊粉组的3.58。2%、3%及4%菊粉添加组，嗜热链球菌都是在

23、培养至12h时进入稳定期，均能明显促进嗜热链球菌的生长，但并不是菊粉含量越高越好，3%菊粉添加组促进嗜热链球菌的生长为最佳，其OD600nm最大能达到4.643，远远高于正常培养基。pH值随着菊粉添加量的增加也是逐渐减小的，都低于不加菊粉组，当添加量为3%时到达最小值5.35。表3- 4添加菊粉后保加利亚乳杆菌生长OD600nm值和pH值Tab.3-4 lactobacillus Bulgaria growth after adding inulin OD600nm and pH values培养时间（h）1%菊粉组2%菊粉组3%菊粉组4%菊粉组OD600nmpHOD600nmpHOD600n

24、mpHOD600nmpH00.1686.650.1736.610.1776.580.1716.631.9866.082.0016.032.1425.952.058663.3855.853.495.763.7655.663.575.793.6545.774.245.674.5995.544.4475.61123.6575.684.345.574.6285.474.4685.53153.665.644.3475.534.6335.44.4735.47183.725.624.3565.54.6385.374.4815.43213.75.64.365.514.6425.384.4845.42243.6

25、725.594.3625.484.6435.354.4865.42图3-4a 添加菊粉后保加利亚乳杆菌生长OD600nm值Fig.3-4 a thermophilic after adding inulin Bulgaria lactobacillus OD600nm value growth图3-3b 添加菊粉后保加利亚乳杆菌pH变化 Fig.3-3 b after adding inulin Bulgaria lactobacillus pH changes由表3-4和图3-4可知，保加利亚乳杆菌在5组培养基中均是在培养至12h时进入稳定期，不同添加量的菊粉均能促进保加利亚乳杆菌的生长，且

26、随着添加量的增加是逐渐增加的，但1%和2%菊粉添加组对保加利亚乳杆菌生长的影响相近，无明显差别。4%菊粉添加组可使保加利亚乳杆菌OD600nm达到4.486，不添加菊粉组仅为3.58。随菊粉添加量的增加，培养基pH也相应的逐渐降低。本试验考察了菊粉为唯一碳源时对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响，以生长曲线反应对菊粉的利用情况，见图3-4和3-5。图3-4嗜热链球菌生长曲线Fig.3-4 thermophilic streptococcus growth curve由图3-4可知，嗜热链球菌以菊粉为唯一碳源时，进入稳定期的时间延后，12h时进入稳定期，比正常培养基延后3h，且OD600nm最

27、大值也较正常培养基低，说明菊粉随能促进湿热链球菌的生长，但菊粉为唯一碳源时，并不利于嗜热链球菌的生长。图 3-5 保加利亚乳杆菌生长曲线Fig.3-5 Bulgaria lactobacillus growth curve由图3-5可知，菊粉为唯一碳源时对保加利亚乳杆菌的生长周期没有影响，但OD600nm最大值降低，菊粉为唯一碳源时，也不利于保加利亚乳杆菌的生长。3.3 菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵乳酸的影响本试验通过HPLC测定乳酸在培养基中的含量，确定菊粉对乳酸代谢的影响。准确配制一些列浓度的乳酸标准溶液，按照实验方法测定，确定乳酸保留时间（见图3-15a），绘制乳酸浓度标准曲线（

28、见图3-15b）。图 3-15a 乳酸标准品HPLC分离色谱图 Fig.3-15a HPLC chromatogram of lactic acid standard图 3-15b 乳酸标准曲线（n=3）Fig. 3-15b The standard curve of lactic acid (n=3)由图3-15可知，乳酸的保留时间是14.19min，乳酸标准曲线线性回归方程为y=850962x-20546，R2=0.9986，由相关系数R2可知，乳酸浓度在0.32-8mg/mL范围内线性关系较好，可用于本试验样品乳酸浓度的测定。本试验测得的各培养基中乳酸浓度见表3-5和3-6。表3-5 菊

29、粉对嗜热链球菌生成乳酸的影响Table 3-5 inulin effects on thermophilic streptococcus produce lactic acid组别乳酸（g/L）0%菊粉5.391%菊粉5.452%菊粉5.573%菊粉5.684%菊粉5.61表3-6 菊粉对保加利亚乳杆菌生成乳酸的影响Tab.3-6 inulin effects on Bulgaria lactobacillus to generate lactic acid组别乳酸（g/L）0%菊粉8.531%菊粉8.612%菊粉8.633%菊粉8.784%菊粉8.94由表3-5和3-6可知，菊粉对乳酸菌乳酸

30、发酵有一定的影响，保加利亚乳杆菌比嗜热链球菌产酸能力强，当菊粉添加量为3%时，嗜热链球菌乳酸产量最大，当菊粉添加量为4%时，保加利亚乳杆菌乳酸产量最大。4 结论本试验研究了菊粉对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响，得出以下结论：（1）菊粉可促进嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长，但菊粉为唯一碳源并不利于乳酸菌的生长。（2）在M17培养基中添加3%的菊粉，嗜热链球菌生长最佳；在MRS培养基中添加4%的菊粉，保加利亚乳杆菌生长最佳。（3）菊粉对乳酸菌生长的影响相应改变乳酸的产量。参考文献1.陈晓明,金征宇;菊粉降解生产低聚果糖J;饲料工业;2000年11期2.孙纪录;菊芋对双歧杆菌（Bifidob

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