酶工程实验指导

1、广东省高教厅重点实验室现代生物技术实验室教材酶工程实验技术华南农业大学广东省教育厅现代生物技术重点实验室酶工程分室2007年11月编 者 的 话华南农业大学现代生物技术实验室酶工程分室是由广东省高教厅和华农大投资建设的教学提高型实验室，面向石牌地区六所高校的高年级本科生及硕士、博士研究生开设酶工程实验技术课程。该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有学生预修“酶工程与蛋白质工程”。本课程实验内容分酶源的获取、酶制剂分离纯化及分析鉴定、酶制剂的体外改造、酶制剂的应用和酶基因的重组表达五大部分，具体如下： 内容实验序号实验项目名称I、酶源的获取1，5产淀粉酶菌株的快速筛

2、选、木瓜蛋白酶制剂的制备II、酶制剂的分离纯化及鉴定分析2鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离3纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析4纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析5木瓜蛋白酶制剂的制备III、酶制剂的体外改造6壳聚糖凝胶颗粒固定化木瓜蛋白酶*实验8中过氧化物酶在滤纸上固定化的部分亦属此部分内容。IV、酶制剂的应用7酶反应器设计及酪蛋白水解物的制备8消毒液中过氧化氢浓度的酶试纸法测定V 酶基因的重组表达9邻苯二酚双加氧酶基因在大肠杆菌中的高效重组表达VI 实验总结及演示等实验总结等。为满足课程教学的需要，经反复修改，特编写了本实验教材。本实验指导的编写由王炜军，郭振飞，方颖、刘娥娥老师参加编写，在此一并表示感谢！

3、本实验指导为试用第五版，试用后我们将根据各校修课的情况作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。 编 者 2006年11月实验一、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。二、原理产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、简单易行等优点。 图 1 产淀粉酶菌落形成的透明圈三、材料、试

4、剂和仪器1、菌的来源取不同地点的表层土壤。2、试剂：RBV-Starch（Sigma）, NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, 2 mol/L NaOH 无菌水和琼脂粉等。3、器皿 250mL三角瓶两个 、 9.0cm培养皿若干、 涂布棒、 200µL移液枪、 200µL枪头若干、牙签若干、 指形管若干、 10mL具塞刻度试管四支、 滴管四支、取样器和塑料直尺等。4、仪器设备 高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。四、实验操作步骤1、器皿的消毒：培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121下灭菌20 min，取

5、出备用。2、培养基的配制与灭菌培养基的组成为：RBV-淀粉（1.2 %, w/v）， NaNO3(0.2%, w/v), K2HPO4( 0.2 %, w/v) , MgSO4·7H2O （0.1%, w/v）, KCl(0.1%, w/v), 琼脂（2% , w/v）, 调PH至6.0左右。 在三角瓶中，121灭菌20 min，将灭菌后的培养基倒入培养皿，每皿大约15mL，静置凝固备用。（倒平板之前务必将培养基摇晃均匀，以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀， 影响菌落的观察。）3、土样的采集及稀释 于校园等不同地点采集土壤样品；取样时，用取样器向下打取1cm左右深度的土样，

6、将从各个地点取得的土样混合；取样点最好选择有机质丰富的地方。4、富集称取5.0 g混合土样和0.5 g的淀粉混合，并加入适量的蒸馏水使其湿润，置于培养皿中富集培养24h。5、菌种的初筛称取1.0g步骤4所得的土样于灭菌具塞刻度试管中，在超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成），加入无菌水至5mL，振荡后静置，待土壤颗粒沉降后，取上层液1mL转移至另一刻度试管中，加入9mL无菌水，摇匀；从第二支试管中取出1mL转移至第三支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀；再从第三支试管中取出1mL转移至第四支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀。如此重复即得到稀释倍数分别10、100、1000倍的土壤稀释

7、液。 用移液枪分别吸取稀释100和1000倍的样品液50 µL，加入至已凝固的培养基表面，用涂抹棒涂布均匀。将涂过样的培养皿倒置放置，于30培养箱里培养，观察菌落透明圈的出现情况。（一般30h后即可出现一些透明圈）。6、菌株的纯化 于超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成）用接种环挑取长势良好且透明圈直径与菌落直径的比值较大的菌落于平板上划线分离，培养一定时间，进一步分离能形成透明圈的单菌落。并在斜面培养基中保存。图 2 平板划线分离法示意图五、结果处理与分析1、菌落产生透明水解圈的观察用直尺分别于不同方向测量菌落和水解圈的直径大小，求平均值，并计算透明水解圈直径与菌落直径

8、的比值。表 1 不同菌落产淀粉酶能力的比较菌落编号菌落直径（mm）透明圈直径(mm)透明圈直径/菌落直径菌落形态特征2、侯选菌落的形态观察： 观察并描述分离所得菌株的菌落形态，以大致了解产酶菌株属于那一类菌。3、你所用的涂布平板法或划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是请分析原因。六、注意事项1、进行无菌操作前，将接种所需用具放于台面铁架上，对超净工作台即周围环境进行75酒精喷雾，使灰尘沉降，打开紫外灯照射灭菌30min，操作前，用75酒精喷手杀菌。（在本实验中省去此步）。2、 操作应尽量靠里，在酒精灯的火焰旁工作。3、 实验过程中避免说话、走动。4、 每次涂板后涂布棒皆要用火焰灼烧灭菌，冷却

9、后再涂下一块板。实验二、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离一、 目 的 学习和掌握亲和层析法分离纯化酶的基本原理和方法。二、 原 理许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地特异结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合，特异性的抗体一抗原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白的结合，基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合，这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而

10、设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。磁性介质被广泛用于分离细胞、核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质，其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其它固形物间的分离，尤其是当待分离的液体样品含有其它固形物或粘度较大时。磁性亲和分离技术是将亲和吸附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。溶菌酶（Lysozyme, EC.3.2.1

11、7）广泛地存在于动物、植物和微生物中，其中鸡蛋清中的含量较为丰富。鸡蛋清溶菌酶的相对分子质量为14.6 KD，由129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白，含有4个S-S键，在中性及偏酸性条件下结构较为稳定。溶菌酶能催化水解细菌细胞壁多糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的-1，4糖苷键，几丁质（又称甲壳素）则是这类细胞壁多糖的类似物，因此可利用溶菌酶与甲壳素间的特异结合来分离纯化溶菌酶。 三、 材料、试剂及仪器1、 材 料 新鲜鸡蛋清：取自市售的鸡蛋。 亲和层析介质：几丁质磁性凝胶介质（自制）。 溶壁微球菌（Micrococcus Lysodeikticus）（Sigma公司）2、 试 剂 0.

12、15N HAc ：吸取18mL冰乙酸，定容至1000 mL。 10%的HAc：吸取100mL冰乙酸，用蒸馏水定容至1000 mL。 0.2mol/L NaHCO3溶液：称取16.8g NaHCO3，溶解，定容到1000mL。 5mmol/L NaHCO3溶液（含0.2 mol/L NaCl）：先将0.2mol/L NaHCO3稀释40倍，再于每升溶液中加入NaCl 11.688g。 5mmol/L NaHCO3溶液（不含 NaCl）：将0.2mol/L NaHCO3稀释40倍。 10mmol/L NaHCO3溶液：将0.2mol/L NaHCO3稀释20倍。 1/15 mol/L 磷酸缓冲液（

13、pH6.2）：Na2HPO3·12H2O 4.7752g，KH2PO4 7.2576g，溶解，定容至1000mL。 考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝溶于50mL 90%乙醇，加入85%磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000mL，过滤。 2 mol/L NaOH ：称取80g的NaOH定容至1000 mL。0.1mol/L pH 7.8磷酸缓冲液(内含0.5mol/L NH4Ac)：称取32.78 g 的Na2HPO3·12H2O，1.33 g的NaH2PO4·2H2O, 38.54 g的NH4Ac溶解后，定容至1000mL.3、 仪器分部收集器、分光

14、光度计、恒温水浴器、恒流泵、电子天平、强力电动搅拌器、抽滤装置。四、 操 作 步 骤（一）、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离1. 亲和层析介质的再生和平衡：用3-4个床体积的5mmol/L NaHCO3（含 NaCl）溶液淋洗亲和层析介质即可。（若发现介质上有太多杂蛋白和一些微生物污染，可用0.5mlo/L的NaOH淋洗亲和层析进行在位清洗）2. 蛋清提取液的制备：取一个新鲜鸡蛋的蛋清，用5mmol/L NaHCO3 （不含 NaCl）液搅匀并稀释至400mL，双层尼龙布过滤，取滤液。（测定酶液总体积，并留1.0 mL样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定）。3. 酸和热变性：用10%的HAc

15、将稀释后蛋清的pH值调至4.5，60水浴15分钟，双层尼龙布过滤，取滤液，用2 mol/L的NaOH将上清的pH值调回至7.0（边缓慢加入NaOH边搅拌，以免局部溶液pH值过高和将pH值调过头），（测定酶液总体积，并留1.0 mL样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定）。4. 开放吸附： 向步骤3的上清液中加入上述平衡好的磁性凝胶介质，于烧杯中用玻棒缓慢搅拌30 min（见图1-1）。（尽量缓慢地搅拌，以免破碎凝胶颗粒）。在此步骤中溶菌酶被亲和吸附到凝胶介质上。5. 介质的磁性回收及洗涤： 用带环型条纹塑料外套的圆形铁氧体磁铁作为外磁场收集亲和介质，此时介质被吸附于塑料外套的表面，取出塑

16、料外套中的磁铁将吸附于塑料外套的表面的介质悬浮于10mmol/L NaHCO3溶液中，缓慢搅拌洗涤介质，磁性回收，如此洗涤介质2次（见图1 2,3）。将洗涤后的介质装柱（测柱径及层析床的高度）， 再用pH 7.8 含0.5mol/L NH4Ac 的0.1mol/L 磷酸钠盐缓冲液(以下称溶液B)洗涤至流出液的A280< 0.05时，再用10mmol/L NaHCO3溶液20mL洗涤以替换柱子中的溶液B，以便下一步的洗脱操作。 1 2 3 图1 鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和吸附分离1溶菌酶的开放吸附； 2亲和介质的磁性收集；3介质的洗涤6. 洗脱：用0.15N HAc溶液进行洗脱，流速控制在 3

17、0ml/h左右，分部收集(4mL/管)，分别测定A280nm（其可快速地监控蛋白的洗脱情况）和酶活性，收集活性部分即为纯化酶，4下保存备用。（测定酶液总体积）。 因本步骤所得酶液的活性很高，故应取部分酶液（如0.2mL）稀释10倍后再用于酶活性测定， 而用于蛋白含量测定时则不必稀释）。7. 用离心管保留粗提液及酸热变性后的酶液，用刻度试管保留亲和层析后的酶液，放置在4，以备实验三和四使用。（二）、测定方法1. 溶菌酶活性的测定 原理：由于溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物悬浮液的浊度（可用450nm波长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm波长下吸光度下降的速度来表示酶活性。 具体方法

18、为：将溶壁微球菌研磨并溶于0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.2）中，使其A450nm在0.6-0.9间。吸取上述底物悬浮液2.0mL于玻璃比色杯，然后加入0.05mL酶液，用移液枪搅动迅速混匀，启动反应，测定1min内A450nm的变化（用0.1mol/L磷酸缓冲液调零，当盖上分光光度计2-3秒钟后开始用秒表计时并读数），每15s记录一次读数。 酶活力的计算：首先要自定义酶活性单位（U）。定义在当前测定条件下，使测定体系在450 nm波长下吸光度每分钟下降0.01所需的酶量为1个酶活力单位（U）。酶液活力（U/mL）=2. 蛋白含量的测定 用考马斯亮蓝G-250法分析溶液中可溶性蛋白的含量

19、。取50uL的样品液加入2.5mL的考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置5 min后，在595nm波长下测定吸光度，并根据标准曲线计算出蛋白含量。（由标准曲线求得的回归方程为：酶样蛋白含量：b (mg/mL) = 1.674 × A595nm - 0.0354）五、 结果处理与分析0.15mol/l HAc1、 绘制亲和层析洗脱曲线。（参考下图格式绘制） 图2 鸡蛋清溶菌酶的亲和层析 ( 2.0×15 cm ) 流速： 60 mL/h； 4.0 mL/管 2、 制作纯化表。对每个纯化步骤中的酶样测定以下3个指标：l 单位体积酶样的活性: a（U/mL）= A450 / （1

20、.0 min × 0.01 × 0.05 mL），即酶液活力。l 酶样的蛋白含量: b（mg/mL）、l 酶样总体积：c（mL）。由此即可制作如下纯化表：表1 鸡蛋清溶菌酶纯化表纯化步骤总体积（mL）总蛋白（mg)总 活 性（U）比活性(U/mg 蛋白）回收率（%）纯化倍数（×）浓缩倍数（×）粗提液C1b1×C1a1×C1a1 / b110011酸、热变性C2b2×C2a2×C2a2/ b2a2×C2a1×C1a2/ b2a1 / b1a2/ a1亲和层析C3b3×C3a3×

21、C3a3 / b3a3×C3a1×C1a3 / b3a1 / b1a3/ a13、 常见的酶活性表示方法有那些（如：U/mL酶液；U / mg protein; U/g干重或鲜重；U / g 酶粉 等）？它们各有什么含义，适用哪些场合？4、 与一般介质相比磁性亲和介质有何优缺点？5、 层析操作中如何更换缓冲液？6、 如何保存介质？六、注意事项1、 搅拌开放吸附时，搅拌的速度不要太快，以免破坏介质，搅拌速度以能使介质悬浮即可。2、 装好层析柱后，应在介质的面上铺一张圆形的小滤纸片，以免在柱层析过程中介质被液滴冲起。实验三、纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析一、 目 的 了解酶（蛋白质

22、）纯度鉴定的常用手段。掌握用SDS-PAGE法进行蛋白纯度鉴定。二、 原 理 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学方法，如：电泳、HPLC等。其中常用的电泳分析方法有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等。纯的蛋白质在一系列条件下进行电泳时，都将以单一的速度泳动，它的非变性电泳图谱应只呈现一条染色带。HPLC常用于多肽、蛋白质纯度鉴定，纯的蛋白样品在洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。三、材料、试剂1. 材 料：实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶。2. 试 剂：溶壁微球菌（Micrococcus Lysodeikticus）（Sigma公司）、丙烯酰胺

23、（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、甘氨酸、琼脂、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS）、巯基乙醇、溴酚兰、甘油、考马斯亮蓝R-250、甲醇、冰乙酸等。 低分子量标准蛋白（上海生化研究所），（已处理好不必再加样品裂解液进行处理！）电泳试剂配制：（1）30%凝胶贮液：取30g丙烯酰胺（Acr），0.8 g甲叉双丙烯酰胺（Bis）加水定容至100mL，过滤后置棕色瓶中，于4保存备用。(2）电极缓冲液： Tris 3.03 g， 甘氨酸 14.4 g，SDS 1.0 g，溶解并定容至1000mL（pH 值约8.3） 。（3）1%琼脂糖溶液： 1g琼脂+100mL电极缓冲液加热溶解。

24、（4）样品裂解液（2× SDS 加样缓冲液）： 10 %SDS ： 1.00 mL 巯基乙醇： 0.1 mL 浓缩胶buffer： 0.5 mL 水： 0.15 mL 共：2.5mL 甘油： 0.5 mL 2 % 溴酚兰： 0.25 mL （5）染色液： 称考马斯亮蓝R-250 0.5g ，甲醇 225 mL，冰乙酸50mL ，定容至500 mL。（6）脱色液：取冰乙酸 75 mL，甲醇 50 mL ，定容至1000mL。（7）分离胶缓冲液：取18.15 gTris溶解后，加6mol/L HCl溶液4mL，调pH值至8.8，定容至100 mL。（8）浓缩胶缓冲液：取6.0 gTris

25、溶解后，加6 mol/L HCl溶液8mL，调pH值至6.8，定容至100 mL。（9）10SDS：取10g溶解后，定容到100mL。（10）1过硫酸铵：取0.1g溶解后，定容到10mL。（11）TEMED：分装。 其它试剂： 1mol/L NaOH ：称取20g的NaOH定容至500 mL。四、 操 作 步 骤1. 封琼脂糖：取加热溶解的1% 琼脂糖溶液，用滴管加入两玻璃板底部的凹槽中，冷却凝固以封住两玻板间底部的缝隙。 2. 分离胶制备：加分离胶至玻板顶部3cm处，立即覆盖水层，静置至胶与水层形成清晰的界面。3. 浓缩胶的制备：倒去水层，用滤纸吸干，加浓缩胶，插入梳子，静置聚合。注意：每一

26、次吸胶后，立即用蒸馏水洗净滴管及微量进样器，以免堵塞！ 附：胶溶液配方：分离胶 12.5% 15% 30%凝胶贮液 3.15 mL 3.75 mL 水 2.1 mL 1.60 mL 分离胶buffer pH8.8 1.90 mL 1.85 mL 共7.5ml 10% SDS 0.1 mL 0.10 mL 1%过硫酸铵 0.25 mL 0.25 mL TEMED 5 µL 5 µL （最后加入以启动反应）浓缩胶 30 %凝胶贮液 0.7 mL 水 2.85 mL 10%SDS 0.1 mL 浓缩胶buffer 1.2 mL 共5 mL 1 %过硫酸铵 0.25 mL TEME

27、D 10µL （最后加入以启动反应）4. 样品的浓缩与脱盐：因实验2亲和层析所得的纯化溶菌酶的蛋白浓度太低不利于电泳后染色，故先要对其进行如下浓缩： （注：本实验中的其它样品不必浓缩）1）取a mL样品（在本实验中用1.0 mL 纯化的鸡蛋清溶菌酶），缓慢加入4a mL -20ºC 预冷的丙酮（边加边混匀），然后将其在-20ºC静置2h 以上 。离心（10000rpm，10min）后，弃上清（用吸管轻轻吸取上清），并将试管口倒扣于吸水纸上约半分钟以沥干溶液，沉淀于空气中干燥后备用。 2）取适量样品裂解液（本实验中约用60µL）溶解沉淀-用移液枪反复吸冲壁

28、然后吸取至1.5mL离心管中沸水浴加热3-5min离心备用（12000rpm，5min）。3）本实验中的其它样品(粗酶、酸和热变性酶)不必浓缩，按1：1加入样品裂解液（100µL酶液加100µL样品裂解液），100加热处理5min 离心后备用；标准分子量蛋白100加热处理3-5min后，即可使用。5. 上样 向电泳槽中加上电极缓冲液，上接负极（黑），下接正极（红）。 用微量进样器在加样孔中点样。 （上样量在15-25µL间比较合适）6. 电泳： 开始时用8 mA电流，当溴酚蓝迁移至分离胶处后，改用10mA电流。7. 染色、脱色：取出凝胶平板（从尾部撬出！以免弄烂玻

29、璃板）切去浓缩胶或琼脂糖部分，于蒸馏水中漂洗3min，如此重复2次，浸于染色液中，不断振荡1-2hr, 脱色，半小时换一次脱色液。五、 电泳结果分析1. 根据电泳图谱分析溶菌酶的纯化情况。2. 根据标准蛋白的分子量和迁移率及目的蛋白的迁移率，计算目的蛋白的分子量（以lgM 对迁移率 R 作图，其中M 为蛋白质分子量）。 1 2 3图1鸡蛋清溶菌酶的SDS-PAGE图谱1. 亲和层析后的鸡蛋清溶菌酶；2. 低分子量标准蛋白；3. 粗酶。其中标准分子量蛋白分别为：鸡蛋清溶菌酶（14.4 KDa）、胰蛋白酶抑制剂（20.1 KDa）、牛碳酸酐酶（31.0 KDa）、兔肌动蛋白（43.0 KDa）、牛

30、血清白蛋白（66.2 KDa）、兔磷酸化酶B（97.4 KDa）。实验四、纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析一、目的了解各环境因素（如：温度、pH值等）对酶稳定性的影响。了解衡量酶稳定性的指标：半衰期T1/2。二、原理酶的稳定性是指酶抵抗各种因素的影响而保持其活性的能力，酶的稳定性在生产应用上具有重要的意义。酶的稳定性常用半衰期（T1/2）来衡量，其表示一定条件下酶活力丧失50%所需的时间。一般来说半衰期越长表明酶在特定条件下的稳定性越好。溶菌酶的热失活行为可简化为不可逆的一级失活模型。以E和D分别表示活性酶与失活酶，则失活反应方程式可以表示为：式中Kd和Kr分别表示正反应和逆反应的速度常数，因是

31、不可逆失活反应，故Kr=0。令时间为t时活性酶的浓度为Et, 酶活性为At，则有：根据式（1），以对处理时间t 作图其斜率即为。进而通过式（2）便可求得半衰期（T1/2）。 三、材料、试剂1. 材 料：实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶、指形管等。2. 试剂和仪器： 0.5 mol/L NaOH；pH计。四、实验步骤1. 取亲和层析所得的纯化溶菌酶用蒸馏水稀释5倍后（此时溶菌酶所处的环境为酸性的醋酸溶液），分装入5根指形管中，每管0.5mL，放入75水浴中保温，分别处理0, 10, 20, 40, 60 min后取出，在自来水下冷却，测定酶液的残留活力，以未经处理（即0 min）的酶液活性为

32、100%，计算其它加热处理酶液的相对活力，并以“相对活力”对“加热处理时间”作图。2. 同时取稀释后的纯化溶菌酶5mL, 在pH计上用0.5 mol/L NaOH将酶液的pH值调至8.0左右（此时溶菌酶所处的环境为中-偏碱性的溶液，此步调pH值特别关键，避免过碱或过酸！），分装入5根指形管中，每管0.5mL，同步骤1将其放入75水浴中加热，处理0, 10, 20, 40，60 min后，分别测定酶液的残留活力，做与上述同样的分析。五、实验结果与分析：1. 观察加热处理中酶液的变化情况（如沉淀的出现）。2. 以“相对活力”对“加热处理时间”作图。3. 以对处理时间t 作图，其斜率即为，进而便可求

33、得半衰期（T1/2）。4. 比较两者酶液热稳定性的差异，并分析环境pH值条件对酶分子热稳定性影响的原因。六、注意事项1. 由于所得纯化酶的活力太高不便于活力的测定分析，故应将实验二所得的纯化酶作适当稀释（本实验约为5倍）后，再进行加热处理试验。2. 在步骤2中，要确保酶液的pH值被调至8.0左右。实验五、木瓜蛋白酶的制备一、 目的 学习和掌握有关酶源（本实验为木瓜乳汁）的选取、采集及粗酶提取等方面的基本原理和方法。二、 原理木瓜又名番木瓜（Carica Papaya），多年生常绿大型草本植物，生长在南北纬32º之间。木瓜蛋白酶则被广泛地应用于食品医药等行业， 如：啤酒的澄清、饼干的膨

34、松等，其大量存在于木瓜乳中。现有木瓜酶的生产上是以未成熟的木瓜果实为原料来采集木瓜乳。本实验以生长在植株上的木瓜果实为材料，通过划破果皮来采集新鲜的乳汁，进而用缓冲液抽提其中的蛋白酶，并分析其酶活性。三、 材料、试剂和仪器1. 材料 种植在网室中结有果实的木瓜树、牙签、烧杯、离心管等。2. 试剂l 0.4mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2）：Na2HPO4·12H2O 103.14g，NaH2PO4·2H2O 17.5g，溶解，定容至1000mL。l 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2）：将0.4mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2）稀释4倍。l 1% 的酪蛋白溶

35、液：称10g的酪蛋白用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2）配至1000 mL。l 激活剂：用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2）配制含半胱氨酸10 mmol/L, EDTA 1mmol/L 的混合液。 即2.423g半胱氨酸，0.744gEDTA溶解于2L pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液。l 10% 三氯乙酸（TCA）：称取100 g的TCA，定容到1000mL。3. 仪器：分光光度计、离心机、HZS-H水浴振荡器、Sartorius BP110S电子天平。四、 操 作 步 骤 1. 木瓜乳的采集 选取谢花坐果60天以上的的木瓜果实，用湿棉布小心檫净表面，而后用牙签，在

36、果实的表面划若干条深约1-2mm 的伤口，此时便有大量的白色乳汁流出，用培养皿接在底下收集，片刻后收集的乳汁便会凝固（若天气干燥可在割乳的前一天浇灌大量的水），称取所收集乳汁的重量。 2. 木瓜蛋白酶的抽提 往上述凝固的木瓜乳中加适量的0.1mol/L 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）在研钵中充分研磨，离心（10000rpm， 10min），取上清，量体积后放置备用。 3. 酶活性的测定：先自定义酶活力单位（U）。（参照实验二中对酶活力单位的定义） 样 品测 定 步 骤（按从左到右的顺序进行）酶液（mL）10%TCA（mL）激活剂（mL）35保温10min1% 的酪蛋白（mL）摇匀35反应10mi

37、n10%TCA（mL）过滤或离心，测定滤液或上清的A275nm值对照管0.111.910反应管（3个）0.101.9114. 蛋白含量的测定 考马斯亮兰G-250法，取50 uL的样品液加入2.5mL的考马斯亮兰G-250溶液，摇匀，放置5 min后，在595nm波长下测定吸光度，并根据标准曲线（酶样蛋白含量 (mg/mL) = 1.674 × A595nm - 0.0354）计算出蛋白含量。五、实验结果与分析1. 计算所得酶样的活力 先要自定义酶活力单位（U）。 （参照实验二中酶活力单位的定义）酶液的活力（U / mL 酶液）。酶液的蛋白含量（mg 蛋白 / mL）。比活力（U /

38、 mg 蛋白）。2. 计算酶得率（U / g 木瓜乳）。六、注意事项1. 选取谢花坐果60-100天左右的木瓜果实（果皮青绿色）来采集木瓜乳。2. 不能将果实摘取下来后，再来划线采集木瓜乳。这是由于不再有根压的存在，而导致无木瓜乳流出。3. 若天气过干旱，要在采乳前一天适当浇水。实 验 六：壳聚糖凝胶颗粒固定化木瓜蛋白酶 一、目的 学习壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的方法、掌握共价结合法固定化酶的原理和方法。 二、原理 甲壳素是由N-乙酰基-D-葡胺糖通过b- (1,4) 糖苷键联结的直链状多糖，甲壳素脱去分子中的乙酰基就转变成壳聚糖, 其基本组成基本单位是D-葡胺糖。壳聚糖是一种生物相溶性好、可生物

39、降解、无毒易得的天然功能高分子材料，被广泛用来作为固定化酶的载体。壳聚糖分子中D-葡胺糖的-NH2可与双功能试剂戊二醛的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO与酶的游离氨基缩合，从而形成壳聚糖 - 戊二醛 - 酶结构，即固定化酶。本实验采用以戊二醛为双功能试剂的载体交联法固定化木瓜蛋白酶。三、 材料、试剂和仪器1. 材料：壳聚糖，木瓜蛋白酶液。2. 试剂：（1） 1% 的冰醋酸溶液； （2） 甲醛（37%）；（3） 1mol/L NaOH；（4） 0.8%的戊二醛（用磷酸缓冲液配制）：量取32mL的25戊二醛，稀释到1000mL；（5） 0.1mol / L磷酸缓冲液（pH 7.2）（6）

40、2 mol/L的NaOH3. 仪器：抽滤装置，恒温水浴震荡器，冰箱，摇床等。 四、实验步骤1. 壳聚糖凝胶颗粒的制备称取0.5克壳聚糖充分溶解于35 mL1% 的冰醋酸溶液中，加入3.0 mL 甲醛（37%）迅速混匀，在40水浴中静置保温100 min ,得到透明的凝胶，加小量蒸馏水将凝胶挤压破碎，倒出并在研钵中进一步破碎成适当大小凝胶颗粒，接着在烧杯中使其悬浮于100mL蒸馏水中，不断地用2 mol/L的NaOH将悬浮液的pH值调至8.0，放置10min，而后用蒸馏水在抽滤漏斗上洗涤凝胶颗粒数次，抽去多余水分，备用。2. 壳聚糖凝胶颗粒的活化取上述凝胶颗粒10 g，加入40mL 0.8%的戊

41、二醛，室温放置100min，用0.1mol / L磷酸缓冲液（pH 7.2）洗涤凝胶颗粒3-4次，以除去多余的戊二醛，抽滤备用。 3. 固定化往上述的凝胶颗粒中加入15mL 木瓜蛋白酶液，4下放置2h，中间搅动数次，而后用0.1mol / L磷酸缓冲液（pH 7.2）洗涤凝胶颗粒3-4次，（注意：收集洗液，不要超过50mL）以除去未固定的木瓜蛋白酶， 即得固定化木瓜蛋白酶。4. 酶活力测定首先要定义酶活性单位（U）。定义在当前测定条件下，使测定体系在275nm波长下的吸光度每分钟增加0.01所需的酶量为1个酶活力单位（U）。 （1）溶液酶活力测定 与实验五的酶活性测定方法相同。 （2）残留酶活

42、力测定 取0.1mL残留液测酶活。残留酶活力数（U）A275/min ×V收集液/（10 min × 0.01 × 0.1 mL） （3）固定化酶活力测定 称取0.1g固定化酶，加入 2mL激活剂。其余步骤与溶液酶活性测定方法相同。 五、 数据处理及计算 活力回收（%）×100% 相对活力（%）= ×100%实验七、酶反应器设计及酪蛋白水解物的制备一、 目 的 学习酶反应器的原理和掌握若干类型酶反应器的设计、组装及应用。比较各种类型反应器的特点。二、 原 理以酶作为催化剂进行反应所需的场所称为酶反应器，即是游离酶、固定化酶或固定化细胞催化反应的

43、容器。其作用是以尽可能低的成本，由反应物制备产物，因此，酶反应器是酶工艺的中心环节，是原料到产品的纽带。酶反应器主要有搅拌罐式反应器、超滤膜反应器、固定床式反应器、流化床型反应器、膜型反应器、鼓泡塔型反应器等形式，各具优缺点，根据具体需要、具体条件选择不同反应器。 蛋白水解物在食品、医药和日用化妆品等上具广泛的用途，用蛋白酶水解各类蛋白是较常用的方法。本实验将用实验四所固定化木瓜蛋白酶制成的酶反应器来制备酪蛋白水解物。三、 材料、试剂和仪器1. 试剂（1）0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2）。（2）1% 的酪蛋白溶液：称取酪素1.000g，加入适量的磷酸缓冲液约80mL，在70的水浴中

44、边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用磷酸缓冲液稀释至刻度。此溶液应在冰箱内贮存。(3) 激活剂：用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2）配制含半胱氨酸10 mmol/L, EDTA 1mmol/L 的混合液。(4) 10%（W/V）三氯乙酸（TCA）。(5) 固定化木瓜蛋白酶。(6) 反应底物溶液：将1% 的酪蛋白溶液和激活剂按1:1.5的体积比混合即得。2. 仪器：分光光度计、离心机、TH-磁力搅拌器、超级循环恒温水浴、恒流泵。四、操 作 步 骤1. 按图连接好各反应器组件，打开超级循环恒温水浴，将温度设定在35，并将实验四所制备的固定化木瓜蛋白酶装入玻璃反应

45、柱内。2. 在取样瓶中加入反应底物溶液150mL，并打开恒流泵启动反应，计时，每隔5min从取样瓶中抽取反应样品，分别测定反应过程中底物的减少和产物的增加以了解反应进程。3. 底物的减少以反应液中蛋白含量的减少来表示，其中蛋白含量的测定用考马斯亮兰G-250法，取50µL的样品液加入2.5mL的考马斯亮兰G-250溶液，摇匀，在595nm波长下测定吸光度。 产物的增加以反应物中酪氨酸和含酪氨酸的短肽的变化表示，测定方法为取2mL的反应液加入2mL的10%的TCA混匀，过滤，取滤液测定OD275nm值。具体操作步骤如下：反应时间（min）051015备注反应液取2mL取2mL取2mL取

46、2mL.以反应物中酪氨酸和含酪氨酸的短肽的增加来表示产物的生成。10% TCA加2mL加2mL加2mL加2mL. 分别过滤或离心（4000rpm、min），滤液或上清在275nm波长处测OD值反应液0.05 mL0.05 mL0.05 mL0.05 mL用蛋白含量的减少来表示底物的减少。考马斯亮兰G-2502.5 mL2.5 mL2.5 mL2.5 mL.混匀，放置5min测定OD595nm， 图3 固定化木瓜蛋白酶水解酪蛋白反应器装置图1、 带外套的玻璃反应柱 2、固定化木瓜蛋白酶 3、超级循环恒温水浴 4、恒流泵 5、取样瓶 6、磁力搅拌器 五、结果处理与分析1. 用示意图表示反应器的结构

47、与控制。2. 绘制反应进程表。3. 绘制反应进程曲线。4. 观察并比较不同底物流方向对反应器运行的影响。六、 相关知识1. 固定床反应器：是由连续流动的液体底物和静止不动的固定化生物催化剂组成（也可由连续流动的气体和静止不动的固体底物和微生物组成）。2. 流化床反应器：通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态而进行反应的装置。流化床中固体颗粒与流体的混合较充分，传热传质性能好，床层压力降小，但对固体颗粒的磨损较大。实验八、酶试纸法检测样品中H2O2的浓度一、 目 的1. 学习和掌握酶法分析的原理和操作。 2. 初步掌握酶试纸的制备及应用。二、 原 理酶法分析是利用酶催化反应的高度专一性的特点

48、，用酶将样品混合物中的待测物质转变为某一可观察或检测的信号如：颜色、电压等。从而达到检测分析专一（不受其它物质的干扰）、灵敏和快速的要求。其被广泛地用于生产和临床中的各种物质的检测分析。H2O2（又称双氧水）常用于各种消毒液，本实验是利用固定化有过氧化物酶的滤纸片，在特定的显色条件下将待测样品中的H2O2转变为颜色信号，因而通过观察酶试纸条的显色程度即可测得样品中的H2O2浓度范围。该方法为一半定量的方法，具快速简便的优点。图4 H2O2酶法测定显色反应式三、 材料与试剂1. 材料：未知H2O2浓度的消毒液。2. 试剂：l 壳聚糖；l 1%HAC溶液：取2mL冰醋酸定容至200mL；l 0.0

49、5mol/LNaOH溶液；l 0.8%戊二醛溶液；l 8µmol/L H2O2,浓度：取184.48µL 30% H2O2溶液定容至200mL；l 显色液：0.1 mol/L苯酚25mL和30 mmol/L 4-氨基氨替吡啉25mL混合；l 辣根过氧化物酶溶液：0.5mg/10mL （用20 mmol/L，pH7.0 PBS溶液溶解）；l 0.1mol/L pH7.0 PBS溶液：称取Na2HPO4.2H2O 21.846g ，NaH2PO4.12H2O 6.08439g 定容至1L。 3. 仪器与消耗品：吹风筒，滤纸，反应板(96孔平底)四、实验步骤1. 固定化过氧化物酶

50、的滤纸片的制备：（1） 滤纸的预处理： 将滤纸剪成3.0×3.0 cm 大小，放入1%的壳聚糖溶液中浸泡10min后取出，沥干，在0.05mol/L的NaOH溶液中浸泡5min后，蒸馏水漂洗1-2次，接着在0.8% 的戊二醛溶液中浸泡100min，取出在蒸馏水中漂洗2-3次，用吸水纸吸干备用。（2） 辣根过氧化物酶的固定化：将辣根过氧化物酶溶液和显色液的混合（1.5：1 V/V），而后将上述的滤纸片浸泡于其中约30min，取出用风筒正反面吹干(注意：风筒不要离滤纸过近，滤纸不用吹得过干，最好稍微湿润)，最后将其剪成0.5×3cm的6条细条备用。2. 标准浓度梯度H2O2的试

51、纸显色实验：取200 µL 8 µmol/L的H2O2加入反应板的第一个孔中，而在其它3个孔中加入100µL蒸馏水，从第一孔中吸出100µL 8 µmol/L的H2O2加入第二个孔中并反复吸取混匀即配得4µmol/L H2O2，再取100 µL加入第三孔中，依照同样的方法依次稀释得到0.5µmol/L，1.0 µmol/L ，2 µmol/L ， 4 µmol/L一系列浓度的H2O2。，用制备好的滤纸片依次蘸取0.5µmol/L， 1 µmol/L， 2 µmol/L ， 4 µmol/L， 8µmol/L浓度的H2O2，待2-3min后观察所显现的颜色。 3. 未知溶液H2O2浓度的分