抗氧化酶活性等测定方法

1、叶绿体的提取一、试剂配置1、 PBS 提取液：每 L 水依次加入 MES(195.2 X0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33 x182.2=60.126g) 、NaCI(0.010 X58.5=0.585g )、MgCl (0.002 X95=0.19g )、EDTA (292.25 X0.002=0.5845g )、KH2PO4 (200X0.0005=0.1g);使用时加入 ASA-Na ( 198.1 X0.002=0.3962g);2、 悬浮液：将 PBS 提取液中的 MES 换为 238.3 X0.05=11.915g的 HEPES (238.3 X0.05=11.915g )

2、;3 、 80%Percol ： 80ml 原液 +20ml 水； 40%Percol ： 40ml 原液 +60ml 水；实际配制：PBS提取液2000ml(3 个处理*2个品种*3个重复*20ml*3 次=1080ml),悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3 次=54ml );80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.(3 个处理 *2 个品种 *3 个重复 *3ml*3 次=162ml )二、提取步骤1、10g 鲜样加 20ml 提取 PBS(50mM MES PH6.1 ，含 0.33M 山梨糖醇， 10mM NaCl ，2mM MgCl

3、2，2mM EDTA ，0.5 mMKH 2PO4，2mM ASA-Na ，ASA-Na 使用前现配现加)2、 快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4 层纱布过滤，去除残渣(注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿 体膜破碎)3、 滤液 2000g 3min ，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水 平转头，加速度调到 9)，约经 30s 后很快使其下降停止，整个离心持续大约 2-3min 左右完成；4 、沉淀用 1ml 提取液漂洗表面悬浮物；5、用 1ml 悬浮液( 50mM HEPES pH 7.6 ，含 0.33 mM 山梨糖醇， 10mM NaCl ，2mM Mg

4、Cl 2，2mMEDTA， 0.5 mMKH 2PO4，2mM ASA-Na ，ASA-Na 使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用 毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点，含叶绿素 2mg.ml -1 以上，这样有利于保持活性。6 、 2000g 1min;7、沉淀再用悬浮液悬浮 ;（悬浮液同 5 ，可以不做 ）8 、用 Percol 试剂进行梯度离心（将 3ml 含有 80%Percol （原液按 100% 算）铺在 10ml 离心管下层，再 把 3ml 40%Percol 铺在离心管中层， 然后将

5、1ml 叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层） 1500g 2-3min （用 水平离心头的离心机，离心机加速要缓慢上升，加速度调到1 ），下降也要缓慢下降，否则会破碎 Percol的浓度梯度层的形成，取出会看到 3 层绿色带，最上层为破碎的叶绿体，沉在地层的为粗颗粒， 40-80% 的 Percol 之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体 ;9、小心吸出，转移到悬浮介质中，使叶绿体浓度达到1mg.ml -1 ；（计算：取叶绿体悬浮液 0.1ml ，加 4.9ml 80% 的丙酮，摇匀后于 1000g 离心 2min ，上清液置于 1cm 的比色杯，在 625nm 上比色，按照公式 计算：OD 625

6、nm X50/34.5=叶绿素 mg/ml ）10 、测定叶绿体的完整性，完整率达到 85-95% ；参考： Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018.取上述制备的完整叶绿体进行如下测定：1、 用50mM PBS （保护酶或其他测定项目的缓冲液）稀释 2-5倍，用于测

7、定 SOD、POD、CAT、APX ;2、用冷丙酮稀释2倍，取0.5ML提取液用于测定 H2O2 ；（本试验中用0.2 mol/L HClO 4稀释）3、用 5% 的 TCA 稀释 2-5 倍，取 1.5ml 用于测定 MDA ；4、用乙醇：丙酮：水 =4.5 ： 4.5 ： 1 稀释，用于测定叶绿素；抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（ SOD ）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（ 1）0.05mol/L 磷酸缓冲液 （PBS，pH7.8） ：A 母液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：取 Na2HPO4 32H2O （分子量 358.14

8、） 71.7g ;B 母液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO42H2O （分子量 156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到 1000ml 。0.05mol/L PBS （ pH7.8 ）的配制：分别取 A 母液（W2HPO4） 228.75ml ,B 母液（NaH 2PO4） 21.25ml ， 用蒸馏水定容至 1000ml 。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000 : 267268。（2）14.5mM 甲硫氨酸溶液：取 2.1637g Met 用磷酸缓冲液（ pH7.8 ）定容至 1000ml 。（3） 30 M EDTA-Na 2溶

9、液：取 0.001gEDTA-Na 2用磷酸缓冲液定容至 100ml。（4） 60 M核黄素溶液：取 0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml ,避光保存。（5）2.25mM 氮蓝四唑 （NBT） 溶液：取 0.1840g NBT 用 PBS 定容至 100ml ，避光保存。（上述试剂先配好，放到 4 度冰箱，用之前临时按下面的方法配，然后放在 4 度冰箱中，不要在最上层， 避免见光，第一组样品加好后拿出来加，加完后放回冰箱，第二组的样品加好后再拿出来加）酶液制备： 取 0.2g （可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L 预冷的磷酸缓

10、冲液（pH7.8 ）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在 4 °C> 12000g下离心20min , 上清液即为酶液。2 、酶活性测定1）反应混合液配制 （以 60 个样为准 ）：分别取 Met 溶液 162ml ，EDTA-Na 2溶液 0.6ml （加的量和前面的浓度要核对） ，磷酸缓冲液 5.4ml ， NBT 溶液 6ml ，核黄素溶液 6ml, 混合后摇匀；SOD 反应混合液： 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *3ml*3 次测定 =162ml（ 实际配置 200ml）（2）分别取3ml反应混合液和30讪（可视情况调整，最好先做一个浓度梯度，看加多少合适，如果

11、 量太少，最好稀释后再加，这样精确）酶液于试管中（尽可能加到试管的底部，要靠着试管壁打下去先加 酶液，后加反应液，加好后摇一摇，看看试管上是不是有雾气，最好拿纱布把试管下边擦一下，免得雾气 挡住光线照过去） ；（3）将试管置于光照培养箱中在 4000 lux 光照下反应 20min ；（照光很重要，试管要选择相同规格 的，因为不同的试管透光率是不一样的，试管架不要选择遮光的，这个最好分组做，同时几组做相互之间 会遮光，每一组一个重复，就是每一组中都要有所有的处理，且都要有一个最大管，处理多的话，把根和 叶分开做，最大管放在中间）同时做两支对照管，其中 1支试管取3ml反应混合液加入 30 M

12、PBS （不加酶液）照光后测定作为最 大光还原管，另 1 支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。（ 4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560（ 出现颜色即可测定 ）。（ 5）酶活性计算： SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原 50 所需酶量（测的样品值要在最大管的一 半左右才合适，否则要调整酶量）为 1 个酶活单位（ u）。SOD 总活性=（Ack-AE ）XV/ （ 1/2A ck XW XVt）SOD比活力=SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW ）;比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示； Ack为照光对 照管的吸光度；Ae为样品管

13、的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积）;Vt为测定时的 酶液用量 （ml， 30ul ）； W 为样品鲜重 （g ，测定时应换算为叶绿体的质量 mg ）；蛋白质含量单位为 mg/g二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同 SOD 。1、过氧化物酶（ POD ）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）:分别取 A 母液（Na 2HPO 4 ） 123ml 和 B 母液（NaH 2PO4 ） 877ml 混匀 即为 1000ml PBS（0.2M ，pH6.0） ；（2）反应混合液配制（以 60 个样为准） :取 200ml PB

14、S（0.2M ，pH6.0） ，加入 0.076ml 液体（原液）愈创木酚（ 2- 甲氧基酚）加热搅拌溶解， 冷却后加入 0.112ml 30 的 H 2 O 2，混匀后保存于冰箱中备用。POD 反应混合液: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *3ml*3 次测定 =162ml （实际配置 200ml,0.076ml,0.112ml）（3）样品测定:取3ml反应液并加入30讪酶液，以PBS为对照调零，而后测定 OD470值（测定40秒）。（边加样边测定， 测定前等待 5 秒，动作要快， 如果慢的话， 要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（4）酶活性计算:以每 min OD 值

15、变化（升高） 0.01 为1 个酶活性单位（ u）。POD= （AA470 XVt） / （W XVs X0.01 xt）（u/g min）AA470 :为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g） ; t为反应时间（min） ; Vt为提取酶液总体积（ml， （1.6ml ）； Vs 为测定时取用酶液体积（ ml， 30ul ）。2、过氧化氢酶（ CAT ）活性测定1)试剂配制：0.15mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0 ):取 A 母液(Na2HPO4)457.5 ml 和 B 母液(NaH 2PO4) 292.5 ml 混合后用蒸馏水定容至 1000ml 。(2) 反应液配制：取 200

16、ml PBS (0.15M , pH7.0 ),加入 0.3092ml 30% 的 H2O2 (原液)摇匀即 可。CAT反应液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3 次测定=162ml(实际配置200 ml, 0.3092ml )(3) 样品测定：取3ml反应液加入0.1ml (可视情况调整)酶液，以PBS为对照调零，测定OD240 (紫外)(测定 40s)。(4) 酶活性计算：以每 min OD 值减少 0.01 为 1 个酶活性单位( u)。CAT= AA240 XVt / (W XVs X0.01 xt)(u/g min)AA240 :为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g) ;

17、 t为反应时间(min) ; Vt为提取酶液总体积(ml ,1.6ml ); Vs为测定时取用酶液体积( ml, 0.1ml )。三、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定(缓冲液为 K)1 、试剂配制(按 50 个样计算) ：(1) 0.05 mol/L K 2HPO4-KH2PO4 缓冲液(pH7.0 )的配制：(A) K2HPO4 3H2O : 228.22 X0.05 X0.61=6.9607g(B) KH2PO4：136.09 x0.05 x0.39=2.6538g ，以上两者混合起来用去离子水定容到 1L。(2) 0.1 mM EDTA-Na 2：取 0.01861g EDTA-N

18、a 2用 PBS 溶液定容到 500 ml (372.24 g/M X0.1mM x500ml=0.01861 g)；（3）5 mM AsA :取0.044g 抗坏血酸用 PBS溶液定容到 50ml （现用现配，176.13g/M5mM X 50ml=0.044 g ）;（4 ） 20mMH 2O2 :取 0.2ml,30%H 2O2 用去 离子水 稀释到 100ml（ 30% H2O2 为 550g X30%/（34.01g/M X0.5L）=9.703M）。实际配置0.1 mM EDTA-Na 2: 3个处理*2个品种*3次重复*1.7ml*3 次测定=91.8ml;（实际配置250ml,

19、0.009305g）5 mM 的AsA: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3 次测定=5.4ml;（实际配置50 ml,0.044g）20mM H 2O2: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3 次测定=5.4ml;（实际配置50 ml,0.1ml ）2、酶活性的测定（以 2 ml体系测定）（1 ）取 0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入 1.70 ml 含 0.1 mM EDTA-Na 2 的 PBS （0.05 mol/L , pH7.0 ）,再加入0.10 ml 5 mM 的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H 2O2，立即在20 C下测定 D290 （紫

20、 外）值在40s内（测定时间内变化大可测定的时间短点，否则长点）的变化，计算单位时间内AsA减少量和酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。计算公式：OD/ XVr XVTA Xd XVt XWOD为反应时间内吸光度的变化（40秒吸光度一0秒吸光度）；为反应时间（40秒）；Vr为反应 液体积（2mL ）; VT提取液体积（1.6mL ）; A为消光系数（2.8mM -1 .cm-1）; d为比色杯厚度（1cm ）; Vt测定液体积（0.1mL ）; W为样品鲜重（0.2g ）。四、超氧阴离子自由基（O2.-）产生速率的测定（羟胺氧化法）1、试剂的配制（ 1）1mM 盐酸羟胺溶液：称取 0.02085

21、g 盐酸羟胺用蒸馏水定容至 300ml ；（ 2）17mM 对氨基苯磺酸溶液：称取 1.1776g 对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水 =1 ：3 配制）加热溶解后定容至 400ml ；（3 ）7mM a-萘胺溶液：称取0.4008g a-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3 : 1配制）定容至400ml 。实际配置PBS （0.05M , pH7.8 ） : 3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3 次测定=27ml;（实际配置100 ml ）1mM 盐酸羟胺溶液 : 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1ml*3 次测定 =54ml; （实际配置100ml,0.00695g

22、 ）17mM 对氨基苯磺酸 : 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1ml*3 次测定 =54ml; （实际配置100ml,0.2944g ） 7mM a-萘胺溶液：3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3 次测定=54ml;（实际配置100ml,0.1004g ）2、O2-含量的测定（ 1 ）样品液提取方法同 SOD 测定；（2）取 0.5ml 提取液（酶液）（可视情况调整用量） 中加入 0.5ml PBS（0.05M ， pH7.8 ）， 1ml 1mM 盐酸羟胺溶液后摇匀。（3 ）在25 C下保温1小时；（4）依次先加入1ml 17mM 对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mMa-萘胺，

23、混合后快速摇匀；（5 ）在25 C下保温20min后在3000 Xg下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）;（ 6）以对照管调零（用水调零） ，取粉红色水相液测定 OD530 值（测定）；（7） O2.-含量的计算：由测得的 OD530，查NO 2-标准曲线得到NO 2-;根据羟胺与 02.-的反应式： NH 2OH + 20 2.- + H+NO 2- + H2O2 + H20 计算0 2.-，即NO 2- X2=0 2.-;再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量， 求得02.-产生速率（以nmol min -1 mg -1蛋白表示，也可以nmol min -1 g-1 鲜重

24、表示） 。02.-产生速率=（CXV） / （t XW）（nmol min -1 g-1 鲜重）C为标准曲线上查得的浓度（umol/L） ; V为测定时所取提取液用量（叶绿体稀释后的体积）;t为反应时 间 （60min） ; W 为样品鲜重 （叶绿体实际质量 g）参考文献：王爱国，罗广华.植物生理学通讯， 1990 , （ 6）: 5557五、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取 100 mg 考马斯亮蓝，溶于 50 ml 90 乙醇中，加入 100 ml 85 （W/V ）的磷酸，再用蒸馏水定容到1 L。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗

25、中保存一个月。（2）100呃/ml牛血清蛋白（BSA ）标准溶液：称取 25mg BSA加水溶解后定容至 100 ml，再从 中吸取40ml用蒸馏水定容至 100 ml （也可取10mg BSA 定容至100ml即为100呃/ml标准BSA溶液）。实际配置0.05M，pH7.8磷酸缓冲液：3个处理*2个品种*3次重复*0.08ml*3 次测定=0.3456ml;（实际配置 100 ml, ）考马斯亮蓝溶液 : 3个处理 *2 个品种 *3 次重复 *2.9ml*3 次测定 =156.6ml; （实际配置 200 ml ，20mg ）2、样品可溶性蛋白含量的测定（1 ）样品可溶性蛋白含量测定：取

26、 20讪提取液（酶液）加入 80讪，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液（即 稀释成0.1ml提取液），再加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后测OD595 （以100讪缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝为对照调零）（2）蛋白质含量计算：可溶性蛋白质含量（mg/g ） =（C Wt）/（W xVsOOOO）C为标准曲线查得的蛋白质含量（卩g ）; Vt为提取液总体积（稀释后的体积ml ） ; Vs为测定时所用提取液体积（ml，20讪）；W为样品鲜重（g ）。过氧化氢（H2O2 ）含量的测定一、试剂配制：1、 0.2 mol/L HClO 4：取 10.05g HClO 4溶解于 0.5L 的水中；

27、2、4 mol/L KOH ：取 112 g KOH 溶解于 0.5L 的水中；3、 0.1 mol/L , pH 6.5 的磷酸缓冲液：Na 2HPO 4 42H 2O5.6407g+NaH 2PO4 2H 2O5.3433g 用去离子水 定容到 500ml ；4、 显色液：100mL、0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸缓冲液+25 此N,N-二甲基苯胺+10 mg 4- 氨基氨替吡啉；5 、过氧化物酶溶液（ 250 U/mL ）二、测定步骤：称取植株根和叶片组织各0.5g，分别置于研钵中，加入1.6 mL预冷至4 C的0.2 mol/L HClO 4,冰浴匀浆，于10 000 xg离心

28、5 min （4 C）,取上清液，加 4 mol/L KOH 调pH值为7.5后，再于10 000 xg离心5 min （4 C）,取上清液1 mL，加0.4 mL显色液和0.1mL过氧化物酶溶液（250 U/mL ）,用 岛津UV-1601分光光度计测定波长 550 nm （可见）处光密度值的变化， H2O2含量以卩mol/gFW 表示。（ 用什么调零？ ）三、计算方法：（ 要做标线？ ）参考：过氧化氢（H2O2）含量的测定参照 Uchida等（2002）方法并加以改进。还原型谷胱苷肽 GSH2 试剂配制（1）1mM GSH 标准液 10mL （现用现配）：称 3.0733mgGSH, 加蒸

29、馏水至 10mL 。（不要）（2）5磺基水杨酸 500mL ： 25g 溶于 500mL 水中。（3）6mM DTNB ：称取 0.118905g DTNB 溶于 50mL PBS （0.1M ，pH7.5 ）中。（4）2mM NADPH ：18.1mg NADPH溶于 10mL PBS 中。（5）ImMGSSG 标准液 10mL : 6.126mg GSSG 力口 PBS 至 10mL。（不要）实际配置0.1M PBS（pH 7.5）:3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3 次测定=27ml;（实际配置50 ml ）6mM DTNB: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.2m

30、l*3 次测定 =10.8ml; （实际配置 50 ml ，实际用量0.1189g ）2mM NADPH: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.1ml*3 次测定 =5.4ml; （实际配置 50 ml, 实际用量18.1mg ）（1U）GR川：3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3 次测定=5.4ml;（实际配置50 ml,实际用量10ml ）5 磺基水杨酸: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.01ml*3 次测定 =0.54ml; （实际配置 10ml ） （实际用量 0.5g/10ml）0.5mM PBS: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3 次测定

31、=81ml;（实际配置100 ml ）乙醚（二乙醚）:3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3 次测定=540ml;（实际配置1000 ml ）PBS Buffer 0.5mM:3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3 次测定=81ml;（实际配置150 ml ）2-乙烯吡啶:3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3 次测定=10.8ml;（实际用量20 ml ）乙醚:3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3 次测定=540ml;（实际用量1000 ml ）1标线制作：配制浓度为 0 ，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的标准 GSH

32、溶液（吸取上述标准液各 0.1mL ）加入 0.5mL 0.1M 磷酸钠 Buffer （pH7.5 ）（含 5mM EDTA） ，0.2mL 6mM DTNB,0.1mL 2mM NADPH,0.1mL（1U）GR 川（谷胱甘肽还原酶）（sigma）,从O.ImL GSH 启动反应，测定650s的A412 （OD412 ），绘制标准曲线。以 PBS 代替 DTNB 作空白。3 . GSH （还原型谷胱甘肽）及GSSH （氧化型谷胱甘肽）（1 ）取1g新鲜叶片，加入10卩L （可以取0.2g鲜样，加1.6ml提取液）5 %磺基水杨酸，研磨后在 14000g 离心 10 分钟，取 1mL 上清液

33、，加入 1.5mL,0.5mM PBS （pH7.5 ）中，再用 5mL 乙醚（二乙 醚）抽取二次（杂质会融到乙醚层中，而乙醚处于整个反应体系得上层，你直接用枪吸取上层乙醚丢弃即 可，反复进行两次即为抽取两次） ，此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。各取 1mL 上清液，加入 1.5mL PBS Buffer 0.5mM （pH7.5）,0.2mL 2- 乙烯吡啶（原装试剂浓度）混 合至乳胶状，在25 C反应1小时，再用5mL乙醚（原装试剂浓度）抽提 2次，此提取液用于分析 GSSG GSSG -氧化型谷胱甘肽，GSH -还原型谷胱甘肽不能够直接测出，需测出氧化型和还原型谷胱甘肽含量，即总的谷胱甘肽含量，然后减去氧化型谷