第二章发酵工业菌种选育及保藏

1、第二章第二章 菌种选育、保藏与复壮菌种选育、保藏与复壮v2.1 菌种选育菌种选育目的q 提高生产能力提高生产能力q 提高产品质量提高产品质量q 开发新产品开发新产品q 解决生产实际问题解决生产实际问题q 防止菌种退化防止菌种退化方法方法基因突变：基因突变：自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组：基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：基因的直接进化：点突变、易错点突变、易错PCR、同序法、同序法DNA 、Shuffling等等v一、菌种的来源一、菌种的来源v根据资料直接向有关科研单位、根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门高等院

2、校、工厂或菌种保藏部门索取或购买。索取或购买。v从大自然中分离筛选新的微生物从大自然中分离筛选新的微生物菌种。菌种。v二、从自然界分离筛选新种的步骤二、从自然界分离筛选新种的步骤v定方案：定方案： v采样：采样： v增殖：增殖： v分离：纯种分离和筛选分离：纯种分离和筛选 v性能鉴定：菌种鉴定、发酵性能测定、性能鉴定：菌种鉴定、发酵性能测定、毒性试验。毒性试验。土样采集方法土样采集方法v森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；顺序采集；v水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求

3、不严格，可取离地面筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面515cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。璃瓶中。v在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。根部残留的土，这部分上却为根际土样。植物体采集方法植物体采集方法v 在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全

4、刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。一小块，并注意不要损伤周围边缘。v选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。在一片叶上的取样部位。v采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。时，一般与根际土样一起保存。 水样采集方法水样采集方法v用于细菌检测的水样应收集于用于细菌检测的水样应收集于100mL干净、灭菌干净、灭菌的广口

5、塑料瓶中。的广口塑料瓶中。v由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。静水层中采集水样。v方法是：握住采样瓶底浸入水中方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行之内迅速进行检测，或者检测，或者4下贮存。下贮

6、存。1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法100ml1g/mL9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 释1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法涂布平皿分离法倾注平皿分离法倾注平皿分离法2.平皿划线分离法 a. 连续划线分离法 b. 分区划线分离法1.概念：是利用微生物在一定条件下产概念：是利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选、排除生自发变异，通过分离、筛选、排除劣质形状的菌株，选择出维持原有生劣质形状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产产水平或具有更优良生产性能的高产

7、菌株。菌株。自然状态下，碱基对发生自然突变的自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为机率为10-810-9。三、菌种选育三、菌种选育（一）自然选育（一）自然选育2.导致菌种退化变异的原因：导致菌种退化变异的原因：v（1）遗传基因型的分离）遗传基因型的分离v（2）自发变异的产生）自发变异的产生v（3）人工诱变导致的退化变异。）人工诱变导致的退化变异。3.自然选育操作步骤：自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验（

8、二）、诱变育种（二）、诱变育种1.概念：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行概念：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。的筛选，称为诱变育种。2.诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍（2）、诱变剂处理过程中几个有关的问题）、诱变剂处理过程中几个有关的问题化学诱变剂的优缺点化学诱变剂的优缺点 诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂的选择诱变剂的选择出发菌株的选择出发菌株的选择（1）、诱变剂的作用原理）、诱变剂的

9、作用原理亚硝酸：亚硝酸：0.070.07MNaMNa2 2HPOHPO4 4亚硝基胍：亚硝基胍：1 1MNaOHMNaOH（3 3）诱变剂的选择）诱变剂的选择v碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。用，回复突变率高，效果不大。v亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为常被称为“超诱变剂超诱变剂”。v甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。v吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径

10、的完全中吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。断。v紫外线仍十分有效。紫外线仍十分有效。v电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。近基因的性能。3、诱变育种的一般步骤、诱变育种的一般步骤出发菌株的选择出发菌株的选择处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备诱变处理诱变处理中间培养中间培养分离和筛选分离和筛选(1)(1)出发菌株的选择出发菌株的选择v自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。感，容易达到好

11、的效果。v在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。像，也是良好的出发菌株。v每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。诱变能积累较多的提高。v出发菌株开始时可以同时选出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。v要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高

12、产基因。分是隐性的，特别是高产基因。v 根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的作用于休止期，就可选用孢子。有的作用于休止期，就可选用孢子。 (2)(2)处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备v关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并的菌悬液

13、，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。要离心，洗涤，过滤。带带玻璃珠玻璃珠的的三角瓶三角瓶内内,加无菌水加无菌水(3)(3)诱变处理诱变处理 根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。 (4)(4)中间培养中间培养v由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程程( (生理延迟生理延迟) )，需，需3 3代以上的繁殖才能将突变代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。

14、此过程称为中间培养性状表现出来。此过程称为中间培养v这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。为重要的。 方法：方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。代，以得到纯的变异细胞。 若不经液体培养基的中间培养，直接在平若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，

15、以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。(5(5）分离和筛选）分离和筛选v筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。为主。v复筛则是精选，以质为主，也就是以精确复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。度为主。 v初筛可以在平皿上直接以菌落初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而的大小来挑取参加复筛者，而将将90%90%的菌落淘汰。的

16、菌落淘汰。v在数量减少后就要仔细比较参在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。分离，纯化菌株。摇摇床床复复筛筛降解降解纤维纤维素产素产生产生产透明透明圈圈病病毒毒产产生生产产空空斑斑一、紫外线的诱变育种一、紫外线的诱变育种v 紫外线诱变一般采用紫外线诱变一般采用15W紫外紫外线杀菌灯，波长为线杀菌灯，波长为2537A灯与灯与处理物的距离为处理物的距离为1530cm，照，照射时间依菌种而异，一般为几秒射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。

17、一般我们常以细胞至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在死亡率控制在7080%为宜为宜。举例举例v 被照射的菌悬液细胞数，细菌为被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个个/ /ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。使照射均匀。v由于紫外线照射后有光复活效应，所以由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后

18、的处理应在红灯下进行。照射时和照射后的处理应在红灯下进行。 操作步骤操作步骤 1将细菌培养液以将细菌培养液以3000rmin离心离心5min，倾去上，倾去上清液，将菌体打散加入无菌清液，将菌体打散加入无菌生理盐水生理盐水再离心洗涤。再离心洗涤。 2将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以内用手摇动，以打散菌体打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达浑浊态的细胞液含细胞数可达108个个ml左右，作左右，作为待处理菌

19、悬液。为待处理菌悬液。 3 3取取2 24m14m1制备的菌液加到直径制备的菌液加到直径9cm9cm培养皿内，培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W15W紫外线下紫外线下30cm30cm处。在正式照射前，应先开紫处。在正式照射前，应先开紫外线外线10min10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射在搅拌下照射101050s50s。操作均应在红灯下进行，。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。或用黑纸包住，避免白炽光。 4取未照射的制备菌液和照射菌液各取未照射的制备菌液和照射菌液各

20、0.5ml进进行行稀释分离稀释分离，计数活菌细胞数。，计数活菌细胞数。 5取照射菌液取照射菌液2ml于液体培养基中于液体培养基中(300ml三角三角瓶内装瓶内装30ml培养液培养液)，120rmin振荡培养振荡培养46h。 6取中间培养液稀释分离、培养。取中间培养液稀释分离、培养。 7挑取菌落进行筛选。挑取菌落进行筛选。二、亚硝基胍诱变曲霉菌二、亚硝基胍诱变曲霉菌v N甲基甲基N-硝基硝基-N-亚硝基胍亚硝基胍(NGN，MNNG或或TG)对真核或原核微生物都有对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。精确作用机制尚不清，强烈的诱变作用。精确作用机制尚不清，据认为是伴随着据认为是伴随着重氮甲烷重氮甲

21、烷的生成及在酸的生成及在酸性条件下生成性条件下生成亚硝酸亚硝酸，直接作用于细胞，直接作用于细胞内的内的DNA复制复制系统，从而诱发了变异。系统，从而诱发了变异。 v 操作步骤操作步骤 1单孢子悬液制备单孢子悬液制备 取斜面，加入取斜面，加入6ml 0.1molL pH6.o的磷酸缓冲液，用接的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液 。 2MNNG溶液的制备溶液的制备 用分析天平称取用分析天平称取2mg，加入，加入2ml 0.1molL pH 6.0磷酸磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。缓冲液

22、，于暗处振荡溶解。 3诱变处理诱变处理 吸取吸取MNNG溶液溶液lml，加入到，加入到1m1孢子悬液中，孢子悬液中，30振荡振荡30min，立即，立即稀释稀释1000倍停止作用，然后以倍停止作用，然后以10-2，10-4两两个稀释度分离培养，个稀释度分离培养，30 3天后计数。天后计数。 4死亡率计算死亡率计算 将未处理的孢子液将未处理的孢子液1ml加加入入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离， 30下培养下培养3天。根据处理前后的活孢子天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。数可计算出死亡率。 5挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量

23、筛选选（三）营养缺陷型的选育（三）营养缺陷型的选育v营养缺陷型营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。的变异株。v对应的是野生型对应的是野生型。v1.1.与筛选与筛选营养缺陷型营养缺陷型有关的三类培有关的三类培养基养基v基本培养基（基本培养基（MM minimal medium） v补充培养基（补充培养基（SM supplemental medium） v完全培养基（完全培

24、养基（CM complete medium） 2.2.筛选营养缺陷型的步骤筛选营养缺陷型的步骤v诱变诱变v淘汰野生型淘汰野生型v检出缺陷型检出缺陷型v确定生长谱确定生长谱诱变方法诱变方法v物理诱变物理诱变v化学诱变化学诱变淘汰野生型淘汰野生型v抗生素法：将诱变处理液在抗生素法：将诱变处理液在MM中培养短中培养短时间让野生型生长，处于活化阶段，而缺时间让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。细菌或陷型无法生长，仍处于休眠状态。细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，活化状态的野生型就被一定量的抗生素，活化状态的野生型就被

25、杀死，保存了缺陷型。杀死，保存了缺陷型。 v菌丝过滤法：对于霉菌，孢子生长后会长菌丝过滤法：对于霉菌，孢子生长后会长出菌丝体，用滤纸过滤法将菌丝滤去，缺出菌丝体，用滤纸过滤法将菌丝滤去，缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。陷型孢子却因未发芽而不能滤过。 检出缺陷型检出缺陷型v原理：原理： 缺陷型在缺陷型在CM上生长良好，而在上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。上则不生长，野生型都能生长。 v具体方法：影印法、点种法、夹层法具体方法：影印法、点种法、夹层法 v将一较平皿直径小将一较平皿直径小1cm1cm的金属圆筒蒙上一层的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。灭菌的丝绒，用金属

26、夹夹住，灭菌。v将完全培养基上长出的全部菌落印在丝绒将完全培养基上长出的全部菌落印在丝绒上，使之成为印模，标记方位。上，使之成为印模，标记方位。v将将MM平皿和平皿和CM平皿在标记的同一方位上平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。 (1)(1)影印法影印法v恒温箱中培养。恒温箱中培养。v二平皿相同方位进行比较，可发现在二平皿相同方位进行比较，可发现在MMMM平皿上长出的菌落少于平皿上长出的菌落少于CMCM平板。平板。MMMM上未上未长而相应于长而相应于CMCM上长出的那几个菌落就可上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。能是缺陷型。v要求平皿上菌落

27、不能太多，菌落之间应要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。有一定间隔。 (2)(2)点种法点种法v任意法。任意法。v用接种针或牙签将用接种针或牙签将CM上长出的菌落在上长出的菌落在MM和和CM两平板上接种，依次在相应位置点种，然两平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。后一起培养，观察其生长情况。v结果明确，但工作量大。结果明确，但工作量大。 (3)(3)夹层法夹层法v先在培养皿上倒一层先在培养皿上倒一层MM，凝固后涂上一，凝固后涂上一层含菌的层含菌的MM，凝固后再倒一薄层，凝固后再倒一薄层MM ，培养培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上，将出现的菌落标记，然后

28、倒上一层一层CM，再培养。第二批长出的菌落可，再培养。第二批长出的菌落可能是缺陷型。能是缺陷型。v缺点缺点:结果有时不明确，将缺陷型菌落从结果有时不明确，将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易夹层中挑出并不很容易。营养缺陷型生长谱的确定营养缺陷型生长谱的确定v 验证确定是缺陷型后，需确定其缺陷的验证确定是缺陷型后，需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。因子，即生长谱测定。生长谱测定的方法生长谱测定的方法v将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与细胞悬液，与MMMM琼脂培养基混合并倾注平琼脂培养基混合并倾注平皿。凝固后，分别在平皿的皿。凝固后，分别在平皿的5

29、56 6个区间放个区间放上不同的营养组合的混合物或其滤纸圆片。上不同的营养组合的混合物或其滤纸圆片。培养后会在某组合区长出菌落，就可测得培养后会在某组合区长出菌落，就可测得所需营养。所需营养。 缺陷型缺陷型的浓缩：的浓缩：抗生素法抗生素法原理：青霉素、制原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作霉菌素等抗生素作用于生长着的微生用于生长着的微生物细胞，对休止态物细胞，对休止态细胞无作用。细胞无作用。 方法：将菌培养在方法：将菌培养在含抗生素的含抗生素的MMMM基中基中菌丝过滤法菌丝过滤法u适用于：丝状（放线菌、适用于：丝状（放线菌、霉菌）霉菌） u原理：基本培养基上只原理：基本培养基上只有发育成菌丝；有发

30、育成菌丝；auxoauxo孢孢子可通过滤膜，野生型子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。菌丝不能通过。逐个检出法：逐个检出法：（3 3）检出营养缺陷型：）检出营养缺陷型：影印实验（影印实验（replica plating replica plating ）Joshua LederbergJoshua Lederberg and Esther Lederberg and Esther Lederberg（19521952）夹层培养法夹层培养法生长谱法生长谱法 方法简便；方法简便； 回变和污染不影响回变和污染不影响 结果结果 测定物质可为粉末测定物质可为粉末 或纸片或纸片（4 4）鉴定营养缺陷型：）鉴

31、定营养缺陷型：测定一般应分两阶段：测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；体化合物的缺陷型；（四）基因育种（四）基因育种v基因重组育种：是运用体外基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和

32、表达，或者通过细胞间的相互作用，复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另一个细胞的方法。换而转移给另一个细胞的方法。一个完整的基因克隆过程包括以下步骤一个完整的基因克隆过程包括以下步骤v、获得待克隆的、获得待克隆的DNA片段（基因）；片段（基因）；v、目的基因与载体在体外连接；、目的基因与载体在体外连接；v、重组、重组DNA分子导入宿主细胞；分子导入宿主细胞；v、筛选、鉴定阳性重组子；、筛选、鉴定阳性重组子；v、重组子的扩增与或表达。、重组子的扩增与或表达。 基基因因重重组组（五）（五） 原生质体育种原生质体

33、育种1.1.原生质体融合育种的特点原生质体融合育种的特点(1)(1)杂交频率较高：杂交频率较高： (2)(2)受接合型或致育型的限制较小：受接合型或致育型的限制较小： (3)(3)遗传物质传递更为完整：遗传物质传递更为完整： (4)(4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。融合子的可能性。（5 5）有可能采用产量性状较高的菌株作融）有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。合亲株。 (6)(6)提高菌株产量的潜力较大。提高菌株产量的潜力较大。 (7)(7)有助于建立工业微生物转化体系。有助于建立工业微生物转化体系。2 2、原生质体融合育种步骤、原生

34、质体融合育种步骤（1 1）标记菌株的筛选和稳定性验证。）标记菌株的筛选和稳定性验证。（2 2）原生质体制备。）原生质体制备。（3 3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。（4 4）涂布于再生培养基，再生出菌落。）涂布于再生培养基，再生出菌落。（5 5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。合子进一步试验、保藏。（6 6）生产性能筛选。）生产性能筛选。 3 3、原生质体融合育种的要点、原生质体融合育种的要点（1 1）标记菌种的选择）标记菌种的选择 采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型采用常规诱变育种，筛

35、选出营养缺陷型或和抗药性菌株。或和抗药性菌株。 (2)(2)原生质体的制备原生质体的制备 在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，剩下由原生质膜包住的类细胞壁分离剥离，剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 放线菌和细菌放线菌和细菌溶菌酶；溶菌酶； 酵母和霉菌酵母和霉菌蜗牛酶或纤维素酶。蜗牛酶或纤维素酶。 影响原生质体制备的因素影响原生质体制备的因素v菌体的前处理菌体的前处理 使酶作用的效果好一些。使酶作用的效果好一些。 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。v菌体的培

36、养时间菌体的培养时间 选择增殖期的菌体。选择增殖期的菌体。v酶浓度酶浓度 v酶处理温度酶处理温度 v渗透压渗透压 渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和醇，蔗糖等有机物和KClKCl和和NaClNaCl等无机物。等无机物。v（3）原生质体融合）原生质体融合v加入表面活性剂聚乙二醇，钙、镁离子加入表面活性剂聚乙二醇，钙、镁离子等。等。v（4 4）再生培养。）再生培养。v（5 5）挑取融合子进一步试验、保藏。）挑取融合子进一步试验、保藏。v（6 6）生产性能筛选。）生产性能筛选。v（六）杂交育种（六）杂交育种v1.概念：是指两个基因型不同的菌株通概念：是指两

37、个基因型不同的菌株通过接合或吻合使遗传物质重新组合，从过接合或吻合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。中分离和筛选具有新性状的菌株。v2.杂交育种的目的：杂交育种的目的：v获得新的具有优良性状的菌株获得新的具有优良性状的菌株v3.杂交育种的程序杂交育种的程序v（1）菌种准备）菌种准备v原始亲本：用来进行杂交的野生型菌株，遗原始亲本：用来进行杂交的野生型菌株，遗传基础差别要大。传基础差别要大。v直接亲本菌株：直接用于进行配对的菌株，直接亲本菌株：直接用于进行配对的菌株，一般是原始亲本经诱变剂处理后得到的，常一般是原始亲本经诱变剂处理后得到的，常用的是营养缺陷型。用的是营养缺陷型。

38、v（2）杂交育种方法（略）杂交育种方法（略 ）2.2 菌种保藏与复壮理想的菌种保藏方法应具备的条件理想的菌种保藏方法应具备的条件(1) 经长期保藏后菌种存活健在；经长期保藏后菌种存活健在；(2) 保证高产突变株不改变表型和基因保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。真空。工业微生物菌种保藏技术工业微生物菌种保藏技术 (1)冷冻干燥或真空干燥保藏；冷冻干燥或真空干燥保藏； (2)超低温或在液氮中冷冻保藏；超低温或在液

39、氮中冷冻保藏； (3) 转接培养或斜面传代保藏；转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。一、一、 冷冻保藏冷冻保藏 冷冻，使微生物代谢活动停止。冷冻，使微生物代谢活动停止。 通常在培养物中加入冷冻保护剂。温通常在培养物中加入冷冻保护剂。温度度 -20以下以下 。v缺点：培养物运输较困难。缺点：培养物运输较困难。冷冻保藏种类冷冻保藏种类 1 1、普通冷冻保藏技术、普通冷冻保藏技术(-20)(-20)2 2、超低温冷冻保藏技术、超低温冷冻保藏技术(-60-80(-60-80)3 3、液氮冷冻保藏技术、液氮冷冻保藏技术 （一）普通冷冻保藏技术（一）普通

40、冷冻保藏技术(-20)(-20)v贮藏于温度范围在贮藏于温度范围在-5-5-20-20的普通冰箱的普通冰箱(-(-20)20)中。中。v维持微生物活力维持微生物活力1 12 2年。年。v注意：注意：v 一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏；一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏；v 注意控制保藏温度；注意控制保藏温度； v 密封。密封。（二）（二）. .超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术(-60(-60-80-80)v长期保藏长期保藏 。v具体方法：具体方法：v (1)离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；v (2)用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；用新鲜

41、培养基重新悬浮所收获的细胞；v (3)加入等体积的加入等体积的20甘油或甘油或10二甲亚砜；二甲亚砜；v (4)分装入冷冻指管或安瓿中，于分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰超低温冰箱中保藏。箱中保藏。v若干细菌和真菌菌种。若干细菌和真菌菌种。v保藏保藏5 5年。年。（三）、液氮冷冻保藏技术（三）、液氮冷冻保藏技术 冷冻保护剂冷冻保护剂 二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油般为甘油10、二甲亚砜、二甲亚砜5。 甘油一般高压蒸汽灭菌，二甲亚砜甘油一般高压蒸汽灭菌，二甲亚砜过滤除菌。过滤除菌。 复苏复苏 1.迅速将安瓿置于迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻水浴

42、中，并轻轻摇动以加速解；轻摇动以加速解；2.用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有无菌液体培养基的试管中，反复抽含有无菌液体培养基的试管中，反复抽吸数次，取吸数次，取0.1-0.2ml 转接入琼脂斜面转接入琼脂斜面上。上。二二 冻干保藏冻干保藏 v原理：通过在减压条件下使冻结的细胞悬原理：通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。液中的水分升华，使培养物干燥。v微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。一。v须使用冷冻保护剂：脱脂乳和蔗糖动物血须使用冷冻保护剂：脱脂乳和蔗糖动物血清等。清等。v保藏保藏10年之

43、久年之久 。 v无需进行冷冻保藏，便于运输。无需进行冷冻保藏，便于运输。v密封。密封。培养物的冻干过程培养物的冻干过程冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生1 1保藏：低于保藏：低于55下保藏。较低的保藏下保藏。较低的保藏温度温度(-20(-20-70)-70)对于培养物的长期对于培养物的长期稳定更好。稳定更好。2 2复苏：复苏： 启用时，拿出安瓿瓶，酒精表面消启用时，拿出安瓿瓶，酒精表面消毒，无菌条件打开，加入毒，无菌条件打开，加入0.30.30.5mL0.5mL新鲜液体培养基溶解，移至斜面或液新鲜液体培养基溶解，移至斜面或液体培养基进行培养。体培养基进行培养。三、其他保藏方法三、其他保藏

44、方法传代保藏传代保藏 矿物油中浸没保藏矿物油中浸没保藏 ( (一一) )、传代保藏、传代保藏v将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。v可用于实验室中若干菌种的保藏。可用于实验室中若干菌种的保藏。v此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。备。v但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。突变。v因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同

45、时转接菌量应保持较低水平。淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。v斜面培养物应在密闭容器中于斜面培养物应在密闭容器中于55保藏，以防保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。止培养基脱水并能降低代谢活性。v此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。方法。( (二）、矿物油中浸没保藏二）、矿物油中浸没保藏v将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。温下保藏，此方法简便有效。v可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏在固体培养基上形成孢