分子生物学第06章分子克隆

1、6.1 作为受体细胞的大肠杆菌作为受体细胞的大肠杆菌6.2 由质粒衍生的载体由质粒衍生的载体6.3 由由噬菌体衍生的载体噬菌体衍生的载体6.4 粘粒载体粘粒载体6.5 单链丝状噬菌体单链丝状噬菌体M136.6 外源外源DNA与载体重组与载体重组6.7 重组重组DNA导入受体细胞导入受体细胞6.8 阳性重组体的筛选和鉴定阳性重组体的筛选和鉴定6 分子克隆分子克隆 分子克隆（分子克隆（molecular cloning）是扩增）是扩增DNA片片段的数量。一般程序是将需要扩增的段的数量。一般程序是将需要扩增的DNA片段连片段连接到载体（接到载体（vector）上，再将重组的载体导入宿主）上，再将重组

2、的载体导入宿主细胞中，重组载体在宿主细胞中复制，目的细胞中，重组载体在宿主细胞中复制，目的DNA片段也同时得到扩增。片段也同时得到扩增。 大肠杆菌的一般性质 大肠杆菌是大肠杆菌是需氧或兼性厌氧细菌，革兰氏阴性，需氧或兼性厌氧细菌，革兰氏阴性，在琼脂培养基上形成圆形、光滑的白色菌落。大肠在琼脂培养基上形成圆形、光滑的白色菌落。大肠杆菌中有一个杆菌中有一个4.2106 bp的环状染色体的环状染色体DNA。除少。除少数菌株外，大肠杆菌通常不致病。用于分子克隆的数菌株外，大肠杆菌通常不致病。用于分子克隆的大肠杆菌必须具备一些特殊的性质，除极少数例外，大肠杆菌必须具备一些特殊的性质，除极少数例外，用于分

3、子克隆的大肠杆菌都是由用于分子克隆的大肠杆菌都是由K-12菌株衍生而来菌株衍生而来的。的。为了消除受体大肠杆菌对外源为了消除受体大肠杆菌对外源DNA的限制作用，的限制作用，一般都是选用具有限制缺陷的突变一般都是选用具有限制缺陷的突变体作为受体菌。体作为受体菌。 大肠杆菌的遗传标记 大肠杆菌的遗传标记一般采用三字母命名，如大肠杆菌的遗传标记一般采用三字母命名，如tet r、tet s、amp r等，其中上标等，其中上标r代表抗性（代表抗性（resistance），），s代表敏感（代表敏感（sensitivity）。当大肠杆菌中含有质粒或）。当大肠杆菌中含有质粒或噬菌体时，记为噬菌体时，记为E.

4、coli K-12（pBR322）、）、E. coli K-12（）等。）等。大肠杆菌培养基 液体培养基（液体培养基（LB液体培养基：液体培养基：1g蛋白胨，蛋白胨，0.5g酵母粉，酵母粉，1g NaCl，加重蒸水，加重蒸水100ml，用，用NaOH调调pH至至7.0，高压灭菌。）、固体培养基（加琼脂或琼脂，高压灭菌。）、固体培养基（加琼脂或琼脂糖）。糖）。 有些培养基需要加一些有些培养基需要加一些不耐高温的成分，应在不耐高温的成分，应在培养基高压灭菌后冷却到一定温度再加入，这些成培养基高压灭菌后冷却到一定温度再加入，这些成分的母液可通过过滤除菌。分的母液可通过过滤除菌。在液体培养基中生长 用

5、于转化的大肠杆菌受体菌应采用对数期的细菌；用于转化的大肠杆菌受体菌应采用对数期的细菌；用于提取质粒的应采用饱和期的细菌。在经预备实验用于提取质粒的应采用饱和期的细菌。在经预备实验测出生长曲线后，通过测定培养液的测出生长曲线后，通过测定培养液的O.D.600就可以就可以知道液体培养基中的细菌处于什么期。知道液体培养基中的细菌处于什么期。 在固体培养基上生长 划线法或稀释法可得到单菌落。划线法或稀释法可得到单菌落。 上层琼脂常用于噬菌斑的筛选。浓度较低的上层上层琼脂常用于噬菌斑的筛选。浓度较低的上层琼脂与菌液混合后倒在下层琼脂上面。倒置培养。琼脂与菌液混合后倒在下层琼脂上面。倒置培养。 载 体 载

6、体主要有两类：质粒（载体主要有两类：质粒（plasmid）和噬菌体）和噬菌体（bacteriophage or phage）。它们都经过了人工的）。它们都经过了人工的改造，使其能更好地满足分子克隆工作的需要。它改造，使其能更好地满足分子克隆工作的需要。它们在宿主细胞中都能够复制，并且在带有外源们在宿主细胞中都能够复制，并且在带有外源DNA片段时也不影响它们的复制，而单独的外源片段时也不影响它们的复制，而单独的外源DNA不不能复制。能复制。 载体还必须带有一些遗传标记，以供选择。载体还必须带有一些遗传标记，以供选择。 质粒（plasmid）的一般性质 质粒是质粒是在细胞内能自主复制的双链共价闭合

7、环的在细胞内能自主复制的双链共价闭合环的DNA分子，大小从分子，大小从1kb到到200kb不等。大肠杆菌中的不等。大肠杆菌中的F因子就是一种质粒。因子就是一种质粒。 在质粒上插入一段外源在质粒上插入一段外源DNA，只要不破坏复制起，只要不破坏复制起始点，外源始点，外源DNA就可以和质粒就可以和质粒DNA一起复制。一起复制。 质粒上往往带有编码某些酶的基因。当外源质粒上往往带有编码某些酶的基因。当外源DNA片段插入到某一遗传标记基因中，该基因就失去活性，片段插入到某一遗传标记基因中，该基因就失去活性，若该基因能够赋予细菌某种性状，根据性状的改变就若该基因能够赋予细菌某种性状，根据性状的改变就能筛

8、选出含有重组质粒的菌落。能筛选出含有重组质粒的菌落。 质粒的遗传标记 质粒携带的常见基因有质粒携带的常见基因有-内酰胺酶基因，带有内酰胺酶基因，带有这种质粒的大肠杆菌能够抗氨苄青霉素（这种质粒的大肠杆菌能够抗氨苄青霉素（amp r）；）；氯霉素乙酰基转移酶基因能够抗氯霉素（氯霉素乙酰基转移酶基因能够抗氯霉素（cat r）。）。其他一些遗传标记有其他一些遗传标记有lacZ、tet r、str r等。等。质粒的复制类型 一般来说，一个质粒上只带有一个复制子一般来说，一个质粒上只带有一个复制子（replicon），目前使用的大多数质粒载体都带有一），目前使用的大多数质粒载体都带有一个来自个来自pMB

9、1质粒的复制子。其他常用的复制子还有质粒的复制子。其他常用的复制子还有ColE1、p15A、pSC101等。等。 质粒在大肠杆菌中的复制有两种类型：一种是松质粒在大肠杆菌中的复制有两种类型：一种是松弛型控制复制（弛型控制复制（relaxed control replication），一种），一种是严紧型控制复制（是严紧型控制复制（stringent control replication）。）。二者的区别是带有的复制子不同，导致在一个细胞中二者的区别是带有的复制子不同，导致在一个细胞中质粒的拷贝数不同。质粒的拷贝数不同。 质粒的复制类型 在正常生长情况下，每个细菌细胞中可有在正常生长情况下，每

10、个细菌细胞中可有1520个拷贝的松弛型质粒（带有个拷贝的松弛型质粒（带有pMB1或或ColE1复制复制子），而对于严紧型质粒（如带有子），而对于严紧型质粒（如带有pSC101复制子）复制子）来说，每个细胞中仅有来说，每个细胞中仅有15个拷贝。当用氯霉素处个拷贝。当用氯霉素处理细菌时，氯霉素抑制了蛋白质的合成，严紧型复理细菌时，氯霉素抑制了蛋白质的合成，严紧型复制质粒的拷贝数并不增加，而松弛型复制质粒的拷制质粒的拷贝数并不增加，而松弛型复制质粒的拷贝数可增加到贝数可增加到20003000个。个。 严紧型控制复制 严紧型控制复制（严紧型控制复制（stringent control replicat

11、ion）的质粒的复制，取决于细菌细胞周期之初合成的不稳的质粒的复制，取决于细菌细胞周期之初合成的不稳定蛋白，因此与细菌染色体的复制同步，每个细菌细定蛋白，因此与细菌染色体的复制同步，每个细菌细胞中只有胞中只有15个质粒拷贝。个质粒拷贝。 pSC101复制子部分来源于复制子部分来源于R6-5质粒的复制子，质粒的复制子，R6-5复制子编码了一个必需的顺式作用蛋白，该蛋白复制子编码了一个必需的顺式作用蛋白，该蛋白对复制起点具有正调节作用，而对自身基因对复制起点具有正调节作用，而对自身基因repA基因基因（编码该顺式作用蛋白的基因）的转录则有负调节作（编码该顺式作用蛋白的基因）的转录则有负调节作用，所

12、以带有这种复制子的质粒属严紧型控制质粒，用，所以带有这种复制子的质粒属严紧型控制质粒，蛋白质合成蛋白质合成抑制剂处理也不能增加它们的拷贝数。抑制剂处理也不能增加它们的拷贝数。 松弛型控制复制 松弛型控制复制（松弛型控制复制（relaxed control replication）的质粒的复制，依靠宿主细胞提供的半衰期较长的酶的质粒的复制，依靠宿主细胞提供的半衰期较长的酶来进行，因此即使宿主的蛋白质合成停止，质粒的复来进行，因此即使宿主的蛋白质合成停止，质粒的复制仍继续进行。当在培养基中加入氯霉素时，抑制了制仍继续进行。当在培养基中加入氯霉素时，抑制了宿主的蛋白质合成和染色体复制，但质粒仍在复制

13、，宿主的蛋白质合成和染色体复制，但质粒仍在复制，最后可达到每个细胞内含最后可达到每个细胞内含20003000个质粒拷贝。这个质粒拷贝。这一性质被利用来进行分子克隆。一性质被利用来进行分子克隆。质粒的不相容性 带有两种不同复制子的质粒带有两种不同复制子的质粒可以稳定地共存可以稳定地共存于于同一个细胞中，称为同一个细胞中，称为质粒的相容性质粒的相容性。 带有两种相同复制子的质粒带有两种相同复制子的质粒不能稳定地共存不能稳定地共存于于同一个细胞中，称为同一个细胞中，称为质粒的不相容性质粒的不相容性。 根据质粒的相容与否，可将质粒分为各个根据质粒的相容与否，可将质粒分为各个不相不相容组容组。同一不相容

14、组的两种质粒不能稳定地共存于。同一不相容组的两种质粒不能稳定地共存于一个细胞中，不同不相容组的两种质粒可以稳定地一个细胞中，不同不相容组的两种质粒可以稳定地共存于一个细胞中。共存于一个细胞中。 现已发现了三十多个不相容组。现已发现了三十多个不相容组。质粒不相容原理 当两个不相容质粒被导入同一细胞时，它们在当两个不相容质粒被导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争。由于质复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争。由于质粒分子是从细胞内的质粒库中随机选取出来进行复制粒分子是从细胞内的质粒库中随机选取出来进行复制的，所以两种不同的质粒在一个细胞中的拷贝数并不的，所以两种不同的质粒在

15、一个细胞中的拷贝数并不总能保持相等。最初在随机过程中产生的微小差异，总能保持相等。最初在随机过程中产生的微小差异，将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重的失衡。在一将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重的失衡。在一些细胞中，一种质粒处于优势，而在另一些细胞中，些细胞中，一种质粒处于优势，而在另一些细胞中，另一种质粒处于优势。细菌繁殖几代后，占少数的质另一种质粒处于优势。细菌繁殖几代后，占少数的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代中可含有两种质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代中可含有两种质粒中的任意一种，但不会兼而有之。粒中的任意一种，但不会兼而有之。质粒载体的选择一种理想的质粒载体应具备下述条件：一种理

16、想的质粒载体应具备下述条件：1 分子相对较小，分子相对较小， 3 10 kb 左右。左右。这可使限制性内这可使限制性内切酶在质粒载体上的作用位点减少。切酶在质粒载体上的作用位点减少。 2 2 在复制子以外的适当位点，构建几个限制性内切在复制子以外的适当位点，构建几个限制性内切酶的单一位点，酶切位点最好位于易于检测的表酶的单一位点，酶切位点最好位于易于检测的表型基因上。型基因上。 3 3 质粒能赋予宿主细胞易于检测的表型，重组质粒质粒能赋予宿主细胞易于检测的表型，重组质粒能使表型发生变化。能使表型发生变化。 4 若用于分子克隆，应是松弛型控制质粒。若用于分子克隆，应是松弛型控制质粒。Lac操纵子

17、调控模型互补的原理 现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的）的调控序列和头调控序列和头146个氨基酸（个氨基酸（肽）的编码信息。这个肽）的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框，编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框，但可使少数几个氨基酸插入到但可使少数几个氨基酸插入到半乳糖苷酶的氨基半乳糖苷酶的氨基端，而不影响功能。端，而不影响功能。互补的原理 这种载体适用于可编码这种载体适用于可编码半乳糖苷酶半乳糖苷酶 C 端部端部分序列的宿主细胞。虽然宿主

18、和质粒编码的片段各分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但这两个肽段可以融为一体，形自都没有酶活性，但这两个肽段可以融为一体，形成具有酶学活性的成具有酶学活性的半乳糖苷酶。这种互补叫做半乳糖苷酶。这种互补叫做互补。互补。 半乳糖苷酶能将无色的半乳糖苷酶能将无色的x-gal（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷）半乳糖苷）转变成蓝色的转变成蓝色的5-溴溴-4-氯靛蓝，氯靛蓝，用这种方法可方便地检测出该酶活性的存在。用这种方法可方便地检测出该酶活性的存在。互补的应用 当外源当外源DNA插入到载体插入到载体 lacZ 的多克隆位点上后，的多克隆位点上后， 破坏了破坏了

19、肽，从而不能发生肽，从而不能发生互补，不能产生有活性的互补，不能产生有活性的半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。 当培养基中存在当培养基中存在IPTG（异丙基异丙基-D-硫代半乳糖硫代半乳糖苷）苷）和和x-gal时，由携带了外源时，由携带了外源DNA的重组载体转化的的重组载体转化的细胞长成白色菌落（或无色噬菌斑），而由没有携带细胞长成白色菌落（或无色噬菌斑），而由没有携带外源外源DNA的空白载体转化的细胞长成蓝色菌落（或蓝的空白载体转化的细胞长成蓝色菌落（或蓝色噬菌斑）。色噬菌斑）。质粒pBR322的图谱 pBR322质 粒 带有质 粒 带有pMB1复制子，复制子，属松弛型控制属松弛型控制质粒，经氯霉质粒

20、，经氯霉素处理宿主细素处理宿主细胞后，每个细胞后，每个细胞 中 可 积 累胞 中 可 积 累10003000个个质粒拷贝。质粒拷贝。 重组重组pBR322质粒转化大肠杆菌后的选择方法质粒转化大肠杆菌后的选择方法（假设外源（假设外源DNA插入到插入到ampr基因中）基因中） 4 个菌落都是由质粒转化了的细菌形成的，个菌落都是由质粒转化了的细菌形成的，2,3 两个两个菌落中的质粒没有携带外源菌落中的质粒没有携带外源DNA，1,4 两个菌落中的质粒两个菌落中的质粒携带了外源携带了外源DNA。pUC19质粒 pUC19质粒带有来自质粒带有来自pBR322的的ampr和和pMB1复制子，带有复制子，带有

21、lacZ基因，在基因，在lacZ中含有一个来自单中含有一个来自单链噬菌体链噬菌体M13的多克隆位点（的多克隆位点（multiple cloning site, MCS; or polycloning site）。）。pUC8和和pUC9以及以及Puc18和和pUC19是成对的质粒，在一对是成对的质粒，在一对pUC质粒中质粒中多克隆位点的方向相反。多克隆位点的方向相反。 多克隆位点 多种不同限制性内切酶的单一切割位点密多种不同限制性内切酶的单一切割位点密集排列的集排列的DNA位点，用于插入外源位点，用于插入外源DNA片段。片段。 一般位于一般位于DNA载体的某一遗传标记基因内，以载体的某一遗传标

22、记基因内，以便通过插入失活该基因来鉴别重组体。便通过插入失活该基因来鉴别重组体。（multiple cloning site, MCS or polycloning site） pUC19质粒图谱重组重组pUC质粒转化大肠杆菌后的选择方法质粒转化大肠杆菌后的选择方法（外源（外源DNA插入到插入到 lac Z 基因中）基因中） 6个菌落都是被个菌落都是被pUC质粒转化了的质粒转化了的细菌形成的，其中细菌形成的，其中1,3,4号菌落中的质号菌落中的质粒 没 有 携 带 外 源粒 没 有 携 带 外 源DNA，2,5,6号菌落号菌落中的质粒携带了外中的质粒携带了外源源DNA。pUC质粒拷贝数多的机理

23、 RNA和和RNA是以质粒是以质粒DNA同一区段相反的同一区段相反的两条链为模板合成的，两条链为模板合成的，RNA大，大，RNA小，小，RNA与质粒的复制起点与质粒的复制起点DNA结合，经结合，经RNaseH切割切割后，可作为引物复制质粒后，可作为引物复制质粒DNA。 pUC质粒缺乏质粒缺乏rop基因，使得其在一个宿主细胞基因，使得其在一个宿主细胞中的拷贝数在不加氯霉素时可达中的拷贝数在不加氯霉素时可达500700个。个。rop基基因产生一个因产生一个63个氨基酸的小蛋白，称为个氨基酸的小蛋白，称为Rop蛋白，它蛋白，它能增强能增强RNA与与RNA的结合，而的结合，而RNA是质粒复是质粒复制的

24、引物，所以制的引物，所以rop的存在抑制质粒的复制。的存在抑制质粒的复制。pSP质粒 pSP64和和pSP65的多克隆位点方向相反，还带有的多克隆位点方向相反，还带有来自噬菌体的来自噬菌体的SP6启动子，可转录插入片段的一条链。启动子，可转录插入片段的一条链。pSP70pSP73以及以及所有的所有的pGEM在多克隆位点的两侧在多克隆位点的两侧有有SP6和和T7启动子，可在体外加入启动子，可在体外加入SP6或或T7 RNA聚合聚合酶分别转录插入片段的两条链，以制备单链酶分别转录插入片段的两条链，以制备单链RNA探针、探针、制备体外翻译的制备体外翻译的mRNA模板、合成反义模板、合成反义RNA等。

25、等。 pSP64质粒图谱pGEM-3z f (+/)质粒图谱质粒图谱+和和 - 在于在于f1复制复制起点的方向不同起点的方向不同pGEM-3z f (+/)质粒多克隆位点序列图质粒多克隆位点序列图穿梭质粒 穿梭质粒（穿梭质粒（shuttle plasmid）是一种杂合质粒，它）是一种杂合质粒，它们既含有能在原核细胞中复制的复制起始区，又含有们既含有能在原核细胞中复制的复制起始区，又含有能在真核细胞中复制的复制起始区，所以它们可以在能在真核细胞中复制的复制起始区，所以它们可以在两类细胞中扩增。如将酵母的两类细胞中扩增。如将酵母的2m环质粒与环质粒与pBR322融融合在一起的合在一起的pJDB21

26、9就是一种穿梭质粒，用就是一种穿梭质粒，用pJDB219克隆的基因可以先在克隆的基因可以先在E. coli中筛选鉴定（在酵母中操中筛选鉴定（在酵母中操作重组作重组DNA有一定困难），然后再转入酵母中进行表有一定困难），然后再转入酵母中进行表达。达。 穿梭质粒 由大肠杆菌质粒载体和牛乳头瘤病毒（由大肠杆菌质粒载体和牛乳头瘤病毒（bovine papilloma virus，BPV）构建成的）构建成的pBPV-BV1是一是一种典型的动物细胞系统的穿梭质粒载体，它既可以种典型的动物细胞系统的穿梭质粒载体，它既可以在大肠杆菌细胞中复制筛选，也可在动物细胞中复在大肠杆菌细胞中复制筛选，也可在动物细胞中复

27、制表达，每个细胞平均有制表达，每个细胞平均有1030个拷贝。个拷贝。 噬菌体headsheath噬菌体（ phage）基因组的一般性质1 噬菌体为双链噬菌体为双链DNA细菌病毒，在噬菌体头细菌病毒，在噬菌体头部时部时DNA为线性分子，大小为线性分子，大小48.5 kb。2 线性分子的两端有线性分子的两端有12个核苷酸长的个核苷酸长的5突出粘突出粘性末端，称为性末端，称为cos位点（位点（cohesive-end site），），这两个粘性末端富含这两个粘性末端富含CG，能互补，但不是回，能互补，但不是回文结构。通过两端的粘性末端连接，线性分文结构。通过两端的粘性末端连接，线性分子可转变成环状分

28、子。子可转变成环状分子。噬菌体（ phage）基因组的一般性质3 DNA分子可分为分子可分为3个区。左臂区含有编码头个区。左臂区含有编码头部和尾部结构的蛋白基因，右臂区含有负责部和尾部结构的蛋白基因，右臂区含有负责DNA复制、使宿主细胞裂解的基因，以及复制、使宿主细胞裂解的基因，以及这些基因表达的调控序列。中央区的基因对这些基因表达的调控序列。中央区的基因对于形成噬菌体是不必需的，这一段可被外源于形成噬菌体是不必需的，这一段可被外源DNA取代。取代。噬菌体中央区的基因 中央区编码的基因与保持噬菌斑形成能力无关，中央区编码的基因与保持噬菌斑形成能力无关，它们包括一些与重组有关的基因（例如它们包括

29、一些与重组有关的基因（例如redA和和redB），使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中去的），使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中去的int基因，以及把原噬菌体基因，以及把原噬菌体DNA片段从宿主染色体上删片段从宿主染色体上删除下来的除下来的xis基因。若用外源基因。若用外源DNA片段取代这个区域片段取代这个区域的基因，不会影响噬菌体的形成。的基因，不会影响噬菌体的形成。 DNA的结构线性分子线性分子环状分子环状分子左臂左臂 左臂左臂 右臂右臂右臂右臂中央区中央区中央区中央区（40%）Cos位点位点噬菌体载体对大肠杆菌培养条件的要求 噬菌体侵染大肠杆菌时，首先吸附在细胞外膜噬菌体侵染大肠杆菌时，首先吸附在

30、细胞外膜的受体上，这些受体由大肠杆菌的的受体上，这些受体由大肠杆菌的lamB基因编码，基因编码，其正常功能是转运麦芽糖进入细胞内。由于麦芽糖可其正常功能是转运麦芽糖进入细胞内。由于麦芽糖可诱导这些受体的合成，而葡萄糖抑制其合成，故用作诱导这些受体的合成，而葡萄糖抑制其合成，故用作噬菌体宿主的大肠杆菌应在含麦芽糖的培养基上培噬菌体宿主的大肠杆菌应在含麦芽糖的培养基上培养。养。 图图66 噬菌体的生长途径噬菌体的生长途径裂解生长途径 噬菌体与膜上的受体结合噬菌体与膜上的受体结合环化环化环复制环复制产生子代环状产生子代环状DNA转录和翻译出各种蛋白。转录和翻译出各种蛋白。 子代环状子代环状DNA滚环

31、复制产生线状多聚体滚环复制产生线状多聚体包包装成子代噬菌体颗粒。装成子代噬菌体颗粒。 溶源性生长 子代环状子代环状DNA整合到大肠杆菌染色体上整合到大肠杆菌染色体上随随染色体染色体DNA复制而复制。复制而复制。 噬菌体改建成载体的基础1 噬菌体可在细菌细胞中大量繁殖。噬菌体可在细菌细胞中大量繁殖。2 噬菌体的中央区对于自身繁殖是不必需的，噬菌体的中央区对于自身繁殖是不必需的，可将外源可将外源DNA插入或取代中央区，外源插入或取代中央区，外源DNA将随着将随着噬菌体噬菌体DNA的扩增而扩增。的扩增而扩增。3 噬菌体噬菌体DNA改建成载体后，可以携带较大的改建成载体后，可以携带较大的外源外源DNA

32、（最大容量可达（最大容量可达22kb，质粒载体最，质粒载体最大只能携带大只能携带15kb的外源的外源DNA）。）。4 噬菌体载体转导细菌的效率比质粒载体转化噬菌体载体转导细菌的效率比质粒载体转化细菌的效率高得多。细菌的效率高得多。对重组噬菌体大小的要求 宿主细胞内的宿主细胞内的噬菌体噬菌体DNA必须具有适当的大小，必须具有适当的大小，才能被包装到事先组装好的、由蛋白质组成的头部才能被包装到事先组装好的、由蛋白质组成的头部（前头）。野生型（前头）。野生型噬菌体噬菌体DNA为为48.5kb，被包装的效，被包装的效率最高，并且形成的噬菌体颗粒感染力最强。实验表率最高，并且形成的噬菌体颗粒感染力最强。

33、实验表明，当构建的明，当构建的DNA分子的长度在野生型的分子的长度在野生型的78105%范围内，仍可被包装成具有感染力的噬菌体颗粒。如范围内，仍可被包装成具有感染力的噬菌体颗粒。如果构建的果构建的DNA小于野生型的小于野生型的78%或大于其的或大于其的105%，就不能形成具有感染力的噬菌体颗粒。就不能形成具有感染力的噬菌体颗粒。 将噬菌体改建成载体的措施1 消除基因组必需区内不必要的限制性内切酶消除基因组必需区内不必要的限制性内切酶酶切位点。酶切位点。2 在可替代区构建所需的酶切位点。在可替代区构建所需的酶切位点。3 可在外源可在外源DNA插入位点之前加入适当的启动插入位点之前加入适当的启动子

34、，以表达外源子，以表达外源DNA。4 加入易检测的表型基因（如加入易检测的表型基因（如 lacZ）。）。5 重组重组噬菌体最好能够包装，以增加转导率。噬菌体最好能够包装，以增加转导率。 （使用（使用噬菌体载体时，培养基中必须加入麦噬菌体载体时，培养基中必须加入麦芽糖）芽糖）转化、转染和转导转化（转化（transformation）： 使质粒使质粒DNA进入宿主细胞进入宿主细胞转染（转染（transfection）： 使裸露的噬菌体使裸露的噬菌体DNA直接进入宿主细胞直接进入宿主细胞转导（转导（transduction）： 使用完整的噬菌体颗粒感染宿主细胞，使用完整的噬菌体颗粒感染宿主细胞，噬菌

35、体噬菌体DNA在噬菌体蛋白及宿主细胞的受在噬菌体蛋白及宿主细胞的受体蛋白协助下进入宿主细胞体蛋白协助下进入宿主细胞插入型载体和取代型载体 在在载体中，只有单个切点供外源载体中，只有单个切点供外源DNA插入插入的叫插入型载体（的叫插入型载体（insertion vectors）；那些具有）；那些具有成对的切点，且切点间的片段又可被除去并被外成对的切点，且切点间的片段又可被除去并被外源源DNA取代的载体叫取代型载体或替换型载体取代的载体叫取代型载体或替换型载体（replacement vectors）。）。 载体的优点经改造的经改造的载体比质粒载体的优点在于：载体比质粒载体的优点在于： 可携带较大

36、的外源可携带较大的外源DNA片段，其最大容量可片段，其最大容量可达达1822kb，而质粒载体的最大容量一般不超过，而质粒载体的最大容量一般不超过15kb。 重组后的重组后的DNA在体外包装成噬菌体颗粒，与在体外包装成噬菌体颗粒，与质粒转化细菌的效率相比，转导具有更高的效率。质粒转化细菌的效率相比，转导具有更高的效率。 重组的噬菌体容易筛选和贮存。噬菌斑原位重组的噬菌体容易筛选和贮存。噬菌斑原位杂交比细菌菌落原位杂交灵敏。杂交比细菌菌落原位杂交灵敏。 合适载体的选择 取代型载体容量较大（最大取代型载体容量较大（最大23kb），适合于），适合于构建基因文库，插入型载体适用于克隆较小的外构建基因文库

37、，插入型载体适用于克隆较小的外源源DNA片段。片段。 优先考虑带有插入失活基因标记基因的载体，优先考虑带有插入失活基因标记基因的载体，如如lacZ。 选择带有适当酶切位点（与外源选择带有适当酶切位点（与外源DNA片段相片段相应）的载体。应）的载体。 在替换型载体中，没有替换的载体（两臂直在替换型载体中，没有替换的载体（两臂直接相连）不能形成有感染力的噬菌体颗粒，所以接相连）不能形成有感染力的噬菌体颗粒，所以只要形成了噬菌斑的都是重组只要形成了噬菌斑的都是重组DNA。插入型载体gt10和gt11图谱gt10的特点 gt10为为C阳性，在带有阳性，在带有 h f l 突变（高频溶源突变（高频溶源化

38、）的大肠杆菌中化）的大肠杆菌中C基因能够高效表达，基因能够高效表达，C产产物能抑制早期转录并阻断晚期基因的表达，与物能抑制早期转录并阻断晚期基因的表达，与C同时表达的同时表达的int基因产物可识别宿主菌和噬菌体基因基因产物可识别宿主菌和噬菌体基因组中的组中的att位点，并在该部位将二者结合，使噬菌体位点，并在该部位将二者结合，使噬菌体载体载体DNA整合到细菌染色体中，整合到细菌染色体中，以极高的速率以极高的速率进入进入溶源状态（溶源状态（ 99%）在培养基平板上形成浑浊的噬）在培养基平板上形成浑浊的噬菌斑（因细菌生长缓慢造成）。菌斑（因细菌生长缓慢造成）。gt10的特点 在在C基因中有一个基因

39、中有一个EcoR位点，在此位点插位点，在此位点插入外源入外源DNA后，破坏了后，破坏了C基因，合成活性阻遏物基因，合成活性阻遏物的功能遭到破坏，噬菌体的功能遭到破坏，噬菌体DNA大量复制，进入裂解大量复制，进入裂解周期，在培养基平板上形成清晰的噬菌斑。周期，在培养基平板上形成清晰的噬菌斑。 在在BNN102（C600 h f l A）宿主菌中筛选重组体，）宿主菌中筛选重组体，在在C600（无（无h f l ）宿主菌中增殖载体。）宿主菌中增殖载体。gt11的特点 gt11 DNA中有中有lacZ基因，在基因，在lacZ基因中有基因中有EcoR位点，没有插入外源位点，没有插入外源DNA的载体所形成

40、的载体所形成的噬菌斑呈蓝色，插入了外源的噬菌斑呈蓝色，插入了外源DNA的噬菌斑为无的噬菌斑为无色。若外源色。若外源DNA的读码框与的读码框与lacZ的读码框相吻合，的读码框相吻合，就可以表达出融合蛋白，这样便于用抗体检测。就可以表达出融合蛋白，这样便于用抗体检测。ZAP噬菌噬菌体载体结构体载体结构和其中的和其中的pBluescript噬菌粒噬菌粒ZAP载体的特点 ZAP载体是一个插入型载体是一个插入型噬菌体载体，噬菌体载体，在在噬菌噬菌体的中间区用一个体的中间区用一个叫叫pBluescript的噬菌粒取代的噬菌粒取代（pBluescript也是一种可以独立使用的载体）。也是一种可以独立使用的载

41、体）。pBluescript载体是由载体是由pUC质粒载体衍生而来，它含有质粒载体衍生而来，它含有一段来自一段来自M13或或f1噬菌体（单链丝状噬菌体）的复制噬菌体（单链丝状噬菌体）的复制起点和终点，故称为噬菌粒（起点和终点，故称为噬菌粒（phagemid）。噬菌粒）。噬菌粒（phagemid）既有单链噬菌体的性质，又有质粒的性）既有单链噬菌体的性质，又有质粒的性质。质。ZAP载体的特点 pBluescript中含有中含有lacZ，lacZ中有多克隆位点，中有多克隆位点，可插入外源可插入外源DNA。多克隆位点两侧有。多克隆位点两侧有T3和和T7启动子，启动子，利用这两个启动子可在体外分别以外源

42、利用这两个启动子可在体外分别以外源DNA的两条链的两条链为模板转录出两条链的为模板转录出两条链的RNA。ZAP载体感染大肠杆载体感染大肠杆菌后能形成噬菌斑，可利用蓝白噬菌斑筛选重组菌后能形成噬菌斑，可利用蓝白噬菌斑筛选重组DNA。在辅助噬菌体在辅助噬菌体M13（或（或f1）超感染下，辅助噬菌体基）超感染下，辅助噬菌体基因因表达的蛋白质会识别表达的蛋白质会识别f1的复制起点，并以滚环式的复制起点，并以滚环式沿沿pBluescript序列合成单链序列合成单链DNA，直到，直到f1终点止，然终点止，然后切割下来，两端连接成单链环状后切割下来，两端连接成单链环状DNA，最终被，最终被M13（或（或f1

43、）辅助噬菌体合成的蛋白质包装成单链噬菌体）辅助噬菌体合成的蛋白质包装成单链噬菌体颗粒，排出细胞。颗粒，排出细胞。 ZAP载体的特点 被包装成单链噬菌体颗粒的噬菌粒可以感染新被包装成单链噬菌体颗粒的噬菌粒可以感染新的细胞，在新感染的细胞中以质粒的形式扩增和表的细胞，在新感染的细胞中以质粒的形式扩增和表达外源达外源DNA。 由于由于lacZ的作用，可用蓝白噬菌斑和蓝白菌落的作用，可用蓝白噬菌斑和蓝白菌落选择重组子。多克隆位点的两端有选择重组子。多克隆位点的两端有T7启动子和启动子和T3启动子，可以在体外加入相应启动子，可以在体外加入相应RNA聚合酶，转录出聚合酶，转录出外源外源DNA的任意一条链。

44、的任意一条链。 此载体可以携带此载体可以携带10kb的外源的外源DNA。粘粒（cosmid）载体的特点 粘粒载体长度为粘粒载体长度为46kb，由，由质粒的复制子质粒的复制子（通常是（通常是ColE1）和）和噬菌体的粘性末端噬菌体的粘性末端（cos）合）合在一起构建而成，含有一个抗药性标记（通常是在一起构建而成，含有一个抗药性标记（通常是ampr）和若干个限制性内切酶的单一切割位点，）和若干个限制性内切酶的单一切割位点，能容纳能容纳3545kb长的外源长的外源DNA片段。插入外源片段。插入外源DNA后可被后可被噬菌体的包装蛋白包装，然后转导大肠杆噬菌体的包装蛋白包装，然后转导大肠杆菌。在宿主细胞

45、中以质粒的形式扩增。菌。在宿主细胞中以质粒的形式扩增。图图 6 粘粘粒粒载载体体及及其其克克隆隆步步骤骤9粘粒（cosmid）载体的特点 通过转导进入宿主细胞后，通过转导进入宿主细胞后，cos位点连接成环状，位点连接成环状，以质粒的方式复制，但不能裂解宿主细胞。若给宿主以质粒的方式复制，但不能裂解宿主细胞。若给宿主细胞再感染细胞再感染噬菌体，或使溶源性宿主菌转变成裂解噬菌体，或使溶源性宿主菌转变成裂解生长，则裂解出的转导性颗粒中一部分含有重组粘粒，生长，则裂解出的转导性颗粒中一部分含有重组粘粒，其余部分含有其余部分含有噬菌体噬菌体DNA。若感染的。若感染的噬菌体是噬菌体是cos序列缺陷的，则裂

46、解出的转导性颗粒全部是重组粘粒。序列缺陷的，则裂解出的转导性颗粒全部是重组粘粒。这些含有重组粘粒的转导性颗粒既可以用于转导其它这些含有重组粘粒的转导性颗粒既可以用于转导其它细菌细胞，也可以用于保存。细菌细胞，也可以用于保存。 粘粒（cosmid）载体的特点 在载体中增殖的在载体中增殖的DNA片段越大，基因文库中重片段越大，基因文库中重组体的数目就越小，有利于减少工作量，还能克隆组体的数目就越小，有利于减少工作量，还能克隆完整的真核基因（含有内含子，很大）。粘粒载体完整的真核基因（含有内含子，很大）。粘粒载体适合于克隆大片段的适合于克隆大片段的DNA，小片段，小片段DNA插入后因插入后因不能形成

47、有感染力的转导性颗粒，反而不能克隆。不能形成有感染力的转导性颗粒，反而不能克隆。粘粒载体容纳外粘粒载体容纳外源源DNA的范围是的范围是4733kb 。单链丝状噬菌体M13载体的特点1 基因组为单链环状基因组为单链环状DNA（正链），全长（正链），全长6407个核苷酸。个核苷酸。2 在宿主细胞中可转变成双链环状在宿主细胞中可转变成双链环状DNA（双链（双链复制型）。复制型）。3 在宿主细胞中可大量合成单链在宿主细胞中可大量合成单链DNA（正链）。（正链）。4 在双链环状在双链环状DNA中插入外源中插入外源DNA，可大量合，可大量合成外源成外源DNA的一条链（插在噬菌体正链的一条链（插在噬菌体正链

48、DNA中的那一条），为中的那一条），为DNA测序提供模板，或提测序提供模板，或提供单链探针。供单链探针。图图610 M13mp18载体图谱载体图谱M13单链噬菌体载体的构建 在在M13噬菌体的基因噬菌体的基因和基因和基因之间有一个之间有一个507bp的间隔，对的间隔，对M13进行改造以使其成为载体主要进行改造以使其成为载体主要是在这一位置进行，在此位置插入标记基因是在这一位置进行，在此位置插入标记基因lacZ和多和多克隆位点，但不要影响复制起始区的功能，因为复克隆位点，但不要影响复制起始区的功能，因为复制起始区也在这一位置。制起始区也在这一位置。 M13噬菌体载体可以携带约噬菌体载体可以携带约

49、30kb的外源的外源DNA。M13噬菌体RF DNA的复制 当当M13噬菌体以吸附细胞壁上性纤毛的方式，感噬菌体以吸附细胞壁上性纤毛的方式，感染雄性大肠杆菌（染雄性大肠杆菌（F+）后，在细菌胞内酶的作用下合）后，在细菌胞内酶的作用下合成负链成负链DNA而成为双链而成为双链DNA，称为复制型，称为复制型DNA（replication form DNA，RF DNA）病毒基因以）病毒基因以RF DNA负链为模板转录，当基因负链为模板转录，当基因产物在亲代产物在亲代RF DNA的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩增即开始。新合成的正链逐渐取代原

50、有的正链。当复增即开始。新合成的正链逐渐取代原有的正链。当复制叉绕负链模板整整一周时，基因制叉绕负链模板整整一周时，基因产物将被取代的产物将被取代的正链切下，经环化及合成负链后，又产生了一个正链切下，经环化及合成负链后，又产生了一个RF DNA，依此继续扩增。，依此继续扩增。 M13噬菌体RF DNA 的复制M13噬菌体正链DNA的复制 当细菌细胞内当细菌细胞内RF DNA的拷贝数达到的拷贝数达到100200个个时，细胞内也产生了足够量的单链时，细胞内也产生了足够量的单链DNA结合蛋白结合蛋白（基因（基因产物），这些蛋白有两个作用，一是抑制基产物），这些蛋白有两个作用，一是抑制基因因mRNA的

51、翻译，二是与新合成的正链的翻译，二是与新合成的正链DNA结合，结合，阻止它再转变成阻止它再转变成RF DNA。此时。此时RF DNA的数量保持的数量保持不变，但单链正链不变，但单链正链DNA的合成不断进行。产生的子的合成不断进行。产生的子代单链代单链DNA在溢出宿主细胞时被衣壳蛋白包被，衣在溢出宿主细胞时被衣壳蛋白包被，衣壳蛋白是基因壳蛋白是基因和基因和基因的产物。的产物。 感染M13噬菌体形成浑浊噬菌斑 感染感染M13噬菌体的细菌并不被裂解，可继续生噬菌体的细菌并不被裂解，可继续生长，但感染了长，但感染了M13噬菌体的细菌的生长速率为正常噬菌体的细菌的生长速率为正常生长速率的生长速率的1/2

52、。在琼脂或琼脂糖覆盖层内生长的未。在琼脂或琼脂糖覆盖层内生长的未感染细菌生长较快，形成较为浑浊的背景，相对于感染细菌生长较快，形成较为浑浊的背景，相对于这一背景，由生长缓慢的感染细菌形成一个不断扩这一背景，由生长缓慢的感染细菌形成一个不断扩大的环带，最终形成肉眼可见的噬菌斑。每个感染大的环带，最终形成肉眼可见的噬菌斑。每个感染细胞内每一代可产生数百个病毒颗粒，因此，在培细胞内每一代可产生数百个病毒颗粒，因此，在培养基中将积聚大量的病毒颗粒。养基中将积聚大量的病毒颗粒。 DNA分子的连接1 粘性末端的连接可使用大肠杆菌粘性末端的连接可使用大肠杆菌DNA连接酶。连接酶。2 DNA连接酶催化连接酶催

53、化DNA连接反应时要加连接反应时要加ATP。3 平端的连接应采用平端的连接应采用 T4 噬菌体噬菌体DNA连接酶。连接酶。4 平端连接相对于粘端连接是低效反应，它要求平端连接相对于粘端连接是低效反应，它要求 4个条件：低浓度的个条件：低浓度的ATP、高浓度的连接酶、高浓度的连接酶、高浓度的平端底物、没有亚精胺类的多胺。高浓度的平端底物、没有亚精胺类的多胺。5 加入适量的聚乙二醇（加入适量的聚乙二醇（PEG）能促进平端的连）能促进平端的连接。接。平端产生的方法 用适当的限制性内切酶直接切出平端；用适当的限制性内切酶直接切出平端； 对对5突出粘性末端用突出粘性末端用Klenow片段或片段或T4 D

54、NA 聚合酶补平；聚合酶补平； 对对3突出粘性末端用突出粘性末端用T4 DNA聚合酶修平；聚合酶修平； 对对3突出或突出或5突出粘性末端用突出粘性末端用S1核酸酶切平。核酸酶切平。平端加连接子后连接平末端添加平末端添加连接子（连接子（linker）后，用）后，用限制性内切酶切出粘性末端限制性内切酶切出粘性末端后连接后连接平端加适配器后连接平末端添加适配器（平末端添加适配器（adaptor），产生粘性末端后连接），产生粘性末端后连接平端的同聚物加尾连接相同粘性末端的连接切口切口不同粘性末端的连接（T4 DNA聚合酶有聚合酶有35外切活性）外切活性）补齐法补齐法切齐法切齐法 为了分子克隆，重组为了

55、分子克隆，重组DNA应导入易于培养繁殖应导入易于培养繁殖的细胞，如大肠杆菌、酵母等。为了获得转基因物的细胞，如大肠杆菌、酵母等。为了获得转基因物种，也可导入动物、植物或其它微生物细胞。对于种，也可导入动物、植物或其它微生物细胞。对于不同的受体细胞，应选用相应的载体（能否复制、不同的受体细胞，应选用相应的载体（能否复制、遗传标记、能否表达、插入失活等）。在一般情况遗传标记、能否表达、插入失活等）。在一般情况下，受体细胞对于质粒转化和病毒下，受体细胞对于质粒转化和病毒DNA转染是不敏转染是不敏感的。采用适当的物理或化学方法处理受体细胞，感的。采用适当的物理或化学方法处理受体细胞，可以使其成为接受外

56、源可以使其成为接受外源DNA的敏感态，这时的受体的敏感态，这时的受体细胞称为感受态细胞。细胞称为感受态细胞。 重组DNA导入受体细胞CaCl2法（化学法） 低温下用低温下用CaCl2处理，即可形成感受态细胞。处理，即可形成感受态细胞。加入重组质粒，加入重组质粒，42保温保温1.5分钟即可使外源分钟即可使外源DNA进入宿主细胞。进入宿主细胞。 高压电穿孔法（物理法） 将受体细胞和重组将受体细胞和重组DNA（或直接是外源（或直接是外源DNA）混合后，加高压电脉冲可导致转化。转化效率受电混合后，加高压电脉冲可导致转化。转化效率受电压高低、电脉冲时间长短影响。电压越高、电脉冲压高低、电脉冲时间长短影响

57、。电压越高、电脉冲时间越长，越有利于转化，但细胞生存率随之降低。时间越长，越有利于转化，但细胞生存率随之降低。所以须选择适当的参数操作。一般当所以须选择适当的参数操作。一般当50%70%的的细胞死亡时，转化的效率达到最高。细胞死亡时，转化的效率达到最高。 三亲本杂交接合法 部分质粒含有部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞（如大肠基因，指令宿主细胞（如大肠杆菌）产生菌毛（杆菌）产生菌毛（pilus），合成细胞表面物质，促使），合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移到另一细胞中。含移到另一细胞中。含tra基因的质粒称为接

58、合质粒基因的质粒称为接合质粒（conjugative plasmid）。一般来说，接合质粒分子）。一般来说，接合质粒分子较大，拷贝数较少，并且宿主广，比较不安全，不宜较大，拷贝数较少，并且宿主广，比较不安全，不宜用作外源基因的载体。不含用作外源基因的载体。不含tra基因的质粒称为非接基因的质粒称为非接合型质粒（合型质粒（non-conjugative plasmid），这类质粒分），这类质粒分子小，拷贝数多，不会自行接合转移，比较安全。因子小，拷贝数多，不会自行接合转移，比较安全。因此，用于构建克隆载体的质粒一般是非接合型质粒。此，用于构建克隆载体的质粒一般是非接合型质粒。 三亲本杂交接合法 三亲本杂交（三亲本杂交（tri-parental mating）接合转化）接合转化法是