岛津LC-10AT型液相基础知识

1、第一节第一节 岛津岛津LC-10AT型型HPLC操作规程操作规程Leo.xu 目的目的:规范岛津规范岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。型高效液相色谱仪的使用。范围范围:适用于岛津适用于岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。型高效液相色谱仪的使用。职责职责:质检员对本规程的实施负责。质检员对本规程的实施负责。一、一、 系统组成系统组成 本系统由本系统由2个个LC-10ATvp溶剂溶剂输送泵输送泵（分（分主主/A泵和副泵和副/B泵）、泵）、Rheodyne 7725i手动手动进样进样阀阀、SPD-10Avp紫外紫外-可见可见检测器检测器、N2000色谱色谱数据数据工作站工作站和和电脑电

2、脑等组成，另外还包括打印机、等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。不间断电源等辅助设备。 二、二、 准备准备1 、准备所需的流动相，用合适的准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜滤膜过滤，超声脱气过滤，超声脱气20min。2 、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。量环。3、 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的的0.45m滤膜过滤。滤膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）4 、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是

3、否连接正检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。常。 接通电源，依次开启不间断接通电源，依次开启不间断电源电源、B泵泵、A 泵泵、检测器检测器，待泵，待泵和检测器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开和检测器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱色谱工作站工作站。三、三、 开机开机四、四、 参数设定参数设定1、 波长设定波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按在检测器显示初始屏幕时，按func键，用数字键输入所需波长键，用数字键输入所需波长值，按值，按Enter键确认。按键确认。按CE键退出到初始屏幕。键退出到初始屏幕。2 、流速设定：流速设定：在在A泵显

4、示初始屏幕时，按泵显示初始屏幕时，按func键，用数字键输入所需的流速键，用数字键输入所需的流速（柱在线时流速一般不超过（柱在线时流速一般不超过1ml/min），按），按Enter键确认。按键确认。按CE键退出。键退出。3 、流动相比例设定：流动相比例设定：在在A泵显示初始屏幕时，按泵显示初始屏幕时，按conc键，用数字键输入流动键，用数字键输入流动相相B的浓度百分数，按的浓度百分数，按Enter键确认。按键确认。按CE键退出。键退出。四、四、 参数设定参数设定4、 梯度设定梯度设定：4.1 ：在在A泵显示初始屏幕时，按泵显示初始屏幕时，按edit键，键，Enter键；键；4.2 ：用数字键输

5、入时间，按用数字键输入时间，按Enter键，重复按键，重复按func键选择所需功能键选择所需功能（FLOW设定流速，设定流速，BCNC设定流动相设定流动相B的浓度），按的浓度），按Enter键，用数键，用数字键输入设定值，按字键输入设定值，按Enter键；键；4.3： 重复上一步设定其它时间步骤；重复上一步设定其它时间步骤；4.4 ：用数字键输入停止时间，重复按用数字键输入停止时间，重复按func键直至屏幕显示键直至屏幕显示STOP，按，按Enter键。按键。按CE键退出。键退出。五、五、 更换流动相并排气泡更换流动相并排气泡1： 将将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；管路的

6、吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；2 ：逆时针转动逆时针转动A/B泵的排液阀泵的排液阀180，打开排液阀；，打开排液阀；3 ：按按A/B泵的泵的purge键，键，pump指示灯亮，泵大约以指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速冲的流速冲洗，洗，3min（可设定）后自动停止；（可设定）后自动停止；4 ：将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。5 ：如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。6 ：如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中，如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放

7、入废液瓶中，设流速为设流速为5ml/min，按，按pump键，冲洗键，冲洗3min后再按后再按pump键停泵，重键停泵，重新接上柱并将流速重设为规定值。新接上柱并将流速重设为规定值。六、六、 平衡系统平衡系统1、查看基线查看基线：1.1：按按N2000色谱数据工作站操作规程色谱数据工作站操作规程打开打开“在线色谱工作站在线色谱工作站”软件，软件，1.2：输入实验信息并设定各项方法参数后，输入实验信息并设定各项方法参数后，1.3：按下按下“数据收集数据收集”页的页的 按钮。按钮。 六、六、 平衡系统平衡系统2 、等度洗脱方式等度洗脱方式 2.1 ：按按A泵的泵的pump键，键，A、B泵将同时启动

8、，泵将同时启动，pump指示灯亮。用指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积倍柱体积的流动相。的流动相。 2.2 ：检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。 2.3 ：观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过不超过1MPa。如超。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再检查管路后再操作。操作。 2.4 ：观察基线变化。如果冲洗至基线漂移观察基线变化。如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为，噪声

9、为25mmol/L25mmol/L的缓冲液的缓冲液4.4.每天冲洗柱每天冲洗柱5.5.稳定进样条件稳定进样条件, ,调节流动相调节流动相6.6.采用保护柱采用保护柱二、二、 保留时间缩短保留时间缩短 1.1.流速增加流速增加2.2.样品超载样品超载3.3.键合相流失键合相流失4.4.流动相组成变化流动相组成变化5.5.温度增加温度增加1.1.检查泵检查泵, ,重新设定流速重新设定流速2.2.降低样品量降低样品量3.3.流动相流动相PHPH值保持在值保持在37.537.5检查柱的方向检查柱的方向4.4.防止流动相蒸发或沉淀防止流动相蒸发或沉淀5.5.柱恒温柱恒温三、三、 保留时间延长保留时间延长

10、 1.1.流速下降流速下降2.2.硅胶柱上活性点变化硅胶柱上活性点变化3.3.键合相流失键合相流失4.4.流动相组成变化流动相组成变化5.5.温度降低温度降低1.1.管路泄漏管路泄漏, ,更换泵密封圈更换泵密封圈, ,排除泵内气泡排除泵内气泡2.2.用流动相改性剂用流动相改性剂, ,如加三如加三乙胺乙胺, ,或采用碱至钝化柱或采用碱至钝化柱3.3.流动相流动相PHPH值保持在值保持在37.537.5检查柱的方向检查柱的方向4.4.防止流动相蒸发或沉淀防止流动相蒸发或沉淀5.5.柱恒温柱恒温四四 、 出现肩峰或分叉出现肩峰或分叉 1.1.样品体积过大样品体积过大2.2.样品溶剂过强样品溶剂过强3

11、.3.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道4.4.柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效5.5.进样器损坏进样器损坏1.1.用流动相配样用流动相配样, ,总的样品体积小于第一峰总的样品体积小于第一峰的的15%15%2.2.采用较弱的样品溶剂采用较弱的样品溶剂3.3.更换色谱柱更换色谱柱, ,采用较弱腐蚀性条件采用较弱腐蚀性条件4.4.更换烧结不锈钢更换烧结不锈钢, ,加在线过滤器加在线过滤器, ,过滤样品过滤样品5.5.更换进样器转子更换进样器转子五、五、 鬼峰鬼峰 1.1.进样阀残余峰进样阀残余峰2.2.样品中未知物样品中未知物3.3.柱未平衡柱未平衡4.4.三氟乙酸三氟乙酸(TFA)(T

12、FA)氧化氧化( (肽谱肽谱) )5.5.水污染水污染( (反相反相) )1.1.每次用后用强溶剂清洗阀每次用后用强溶剂清洗阀, ,改进阀和样品的改进阀和样品的清洗清洗2.2.处理样品处理样品3.3.重新平衡柱重新平衡柱, ,用流动相作样品溶剂用流动相作样品溶剂 ( (尤其是尤其是离子对色谱离子对色谱) )4.4.每天新配每天新配, ,用抗氧化剂用抗氧化剂5.5.通过变化平衡时间检查水质量，用通过变化平衡时间检查水质量，用HPLCHPLC级级的水的水六、六、 基线噪声基线噪声 1.1.气泡气泡( (尖锐峰尖锐峰) )2.2.污染污染( (随机噪声随机噪声) )3.3.检测器灯连续噪声检测器灯连

13、续噪声4.4.电干扰电干扰( (偶然噪声偶然噪声) )5.5.检测器中有气泡检测器中有气泡1.1.流动相脱气流动相脱气, ,加柱后背压加柱后背压2.2.清洗柱清洗柱, ,净化样品净化样品, ,用用HPLCHPLC级试剂级试剂3.3.更换氘灯更换氘灯4.4.采用稳压电源采用稳压电源, ,检查干扰的检查干扰的来源来源( (如水浴等如水浴等) )5.5.流动相脱气流动相脱气, ,加柱后背压加柱后背压七、七、 峰拖尾峰拖尾 1.1.柱超载柱超载2.2.峰干扰峰干扰3.3.硅羟基作用硅羟基作用4.4.柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效5.5.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道6.6.死体积或柱外

14、体积过大死体积或柱外体积过大7.7.柱效下降柱效下降1.1.降低样品量降低样品量, ,增加柱直径采用较高容量的固定相增加柱直径采用较高容量的固定相2.2.清洁样品清洁样品, ,调整流动相调整流动相3.3.加三乙胺加三乙胺, ,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相低流动相PHPH值值, ,钝化样品钝化样品4.4.更换烧结不锈钢更换烧结不锈钢, ,加在线过滤器加在线过滤器, ,过滤样品过滤样品5.5.更换色谱柱更换色谱柱, ,采用较弱腐蚀性条件采用较弱腐蚀性条件6.6.连接点降至最低连接点降至最低, ,对所有连接点作合适调整对所有连接点作合适调整, ,尽可能

15、尽可能采用细内径的连接管采用细内径的连接管7.7.用较低腐蚀条件用较低腐蚀条件, ,更换柱更换柱, ,采用保护柱采用保护柱八、八、峰展宽峰展宽 1.1.进样体积过大进样体积过大2.2.在进样阀中造成峰扩展在进样阀中造成峰扩展3.3.数据系统采样速率太慢数据系统采样速率太慢4.4.检测器时间常数过大检测器时间常数过大1. 1. 用流动相配样用流动相配样, ,总的样品体积小总的样品体积小于第一峰的于第一峰的15%15%2.2.进样前后排出气泡以降低扩散进样前后排出气泡以降低扩散3.3.设定速率应是每峰大于设定速率应是每峰大于1010点点4.4.设定时间常数为感兴趣第一峰设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的半宽的10%10%八、八、峰展宽峰展宽5.