生物技术-基因工程

1、第八章 基因工程1重组DNA技术23456基因工程的应用7 首字母： 大写：细菌属名2-3字母： 小写：细菌种名 如 EcoR 1 4 : 大写: 菌株 1，2: 分离到的次序第一节、工具酶一、限制酶（restriction enzyme）：限制性内切酶 1 类：限制和修饰作用 * * 2 类：识别DNA内部位点、切割双链 3 类：同类根据酶结构、作用及DNA结合和裂解的特性1、分类2、命名89（2）产生平末端(blunt end):3.酶的识别和切割位点:通常4-6bp,具有回文结构(palindrom)（1）产生粘性末端(sticking end) 5-末端: EcoR 1: 5-GAAT

2、TC-3 3-CTTAAG-5 3-末端:Pst1 : 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 Sma1: 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5105.同尾酶(isoaudamers): 识别序列不同,但产生相同的粘性末端 BamH 1 :GGATCC Sau3A 1: NGATCN4.同功异源酶(isochizomers): 来源不同, 识别和切割位点相同 如:BamH 1 和 Bst 1111、DNA聚合酶 大肠杆菌中第一个发现，MW 109KD 方向：53 还具有53及35外切酶活性. 缺口平移法标记DNA时常用二 修饰酶对DNA 或RNA 末端进行剪切、补平、连接及化学修饰的

3、酶。12 两类：禽类成骨细胞性白血病病毒逆转录酶（AMV） moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV） 方向：53 作用：以RNA为模板合成DNA，构建cDNA文库2、逆转录酶 （reverse transcriptase）将3-OH 与5-P 连接形成3, 5-磷酸二酯键3、T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）134、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）6、Taq DNA聚合酶 和其它耐热DNA聚合酶去除DNA or RNA 5-P，制备载体时可防止载体自身连接， 提高重组效率。5、末端脱氧核苷酰转移酶 ：末端转移酶 作用：在DNA的3-OH上，加上 dN

4、TPPCR时14内切酶、碱性磷酸酶、连接酶的作用15*分类： 克隆载体 质粒 入噬菌体 粘性质粒 M13噬菌体 表达载体 大肠杆菌表达载体 哺乳动物表达载体第二节 载体*本质：DNA 携带外源DNA进入受体细胞的运载工具。16质粒载体 大肠杆菌质粒载体 PBR322 枯草杆菌质粒载体 PNC3 酵母菌质粒载体 农杆菌Ti质粒载体 Ti噬菌体载体 噬菌体载体 Cos噬菌体载体病毒载体 SV40病毒载体 乳头瘤病毒载体17 分子量相对较小，在细菌中稳定存在， 拷贝指数高。 具有遗传标记： 如抗生素性基因 半乳糖酶基因（LacZ） 具 有 多 个 酶 的 单 一 切 点 。 称 多 克 隆 位 点

5、（ multiple cloning sites , MCS） 如 PBR322(人工合成)4.3Kb ：含 AmP(氨卞青霉素)、 Tet(四环素) 24个单一切点一 常用的克隆载体1.质粒（plasmid）：种类很多，但作为克隆载体须具备。18PBR32219质粒的构建20质粒携带外源基因21 溶菌性（Lytic）：在细菌中连续增殖直到细菌裂时， 释放噬菌体。 溶原性（Lysogenic）：将其DNA整入细菌中。 *只有双链DNA的噬菌体才具有溶原周期。2. 噬菌体：最大容量：923kb感染细菌的病毒根据生活周期分 特点双链DNA分子（线性或环形） 两端具有12个nt单链互补粘性末端 具非

6、必需区（中间区约1/3长度） 可在E.Coli中大量繁殖 可克隆15Kb左右的外源基因22噬菌体的溶原周期和溶菌周期2324 插入型载体：外源DNA克隆到分子上，使噬菌体的某种生物 功能丧失效力，即插入失活效应。 如：半乳糖酶失活的插入型载体（蓝白筛选） 编码 载体类型 （两种）A :载体中含一个LacZ基因 半乳糖苷酶 X-gal(无色) X(蓝色)+gal(半乳糖) *其中X为有色基因：（4-溴-5-氯吲哚）与gal结合成无色的X-galB:在含X-gal的培养基中，在Lac操纵子诱导物IPTG（异丙硫半乳糖苷）作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，此菌落为蓝色。25C.若Lac Z

7、基因被外源DNA插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为无色（白色）。26取代型载体（又叫替换型载体） 图8-4基因工程原理P258在DNA分子的中央，插入一段DNA片段： 具有多克隆位点的反向重复序列 当外源DNA插入时其可被置换掉 作用：提高了克隆外源DNA的能力。27*由DNA的Cos区与质粒构建*环状双链DNA特点；含质粒的抗性标记如Amp，Tet 带Cos区，可进行体外包装 一个或多个酶切位点 分子量小，容量大 /筛选AP平板2、粘性质粒（Cosmid）：容量40-50kb282930（1）大肠杆菌噬菌体（2）基因组DNA全长6.5kb（单链）（3）感染后，可复制成双链DNA（RF，

8、DNA）（4）当RF100200后，只有（+）链复制 4种常用载体的比较 P146 表82 筛选：蓝白筛选3、M13噬菌体（M13 phage）3132在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。二. 表达载体（expressing vector） 大肠杆菌表达载体 除克隆载体的特性外还含有：表达系统元件 启动子 核糖体结合位点 克隆位点 转录终止信号启动子：常用的有 trp-lac启动子（or tac启动子） 噬菌体Pc启动子 T7噬菌体启动子33除含有原核序列：在E-Coli中的复制起始点、便于筛选的抗性基因还包括真核表达元件 启动子/增强子 克隆位点 终止信号和加poly（A）信号哺乳

9、动物表达载体原核受体 E-Coli受体系统 外源基因复制、扩增场所 链霉菌受体系统 外源基因表达场所 酵母菌受体系统真核受体 动物（哺乳）细胞受体系统 一般只作基因表 植物/ 昆虫细胞受体系统 达场所基因工程的受体系统341. 特点：遗传背景清楚利于研究 繁殖快易获得大量基因产物（20一代） 含质粒利于基因转移 表达非E-Coli基因，其潜力几乎是无限的. E-Coli受体系统2. 缺点：高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠 基因产物纯化工艺复杂 基因产物易受污染（内毒素） 基因产物对受体菌有毒害作用 基因产物易被水解 从安全角度并不理想 缺乏基因产物表达后加工机制35特点：安全性大 遗传

10、信息和生理状况更适合于真核基因表达 基因产物外分泌 遗传背景较清楚 具基因表达后加工机制二. 酵母菌受体系统36目的基因的获得载体的选择与制备目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接）重组DNA导入受体重组体筛选和鉴定目的基因表达基因产物的分离纯化第三节 重组DNA技术的基本过程七步：37. 目的基因的制备方法： 1. 内切酶法 2. 机械力降解 3. 化学合成 4. cDNA合成 5. PCR制备法 6. 从基因文库中提取1.限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法） 用酶降解染色体DNA（esp原核生物），将降解的DNA克隆到载体上，从而得到目的基因优点：原理简单，操作简便，具有一定的应用范围。缺

11、点：随机性有限，盲目性大，筛选麻烦，应用范围有限 （只适用于原核生物）382、机械降解法优点：随机性大缺点：所得基因片段不能直接连接，需加工修饰。用超声波震荡等机械法使DNA断裂。3. cDNA合成cDNA文库（Cdna library）：将一个细胞中，所有cDNA都与载体连接成重组DNA，并列入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称为cDNA文库。cDNA的获得： 图85 七年制P149 不同细胞，不同细胞状态，得到的cDNA文库不同。394.PCR（polymerase chain reaction）3、化学合成法a.acodeDNA化学合成nt5.从基因文库中提取基因文库（genom

12、ic library）：因限制性内切酶将基因组 DNA切成片段，每一段与一个载体连接成重组DNA，并引入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称基因文库。401.粘性末端连接 5末端连接（易） 3末端连接（难） 二.载体的选择和制备分离纯化三.DNA分子的体外连接（外源DNA与载体连接） P与OH形成二酯键T4连接酶：载体经酶切后，易自身环化，形成自身载体。 处理方法之一：碱性磷酸酶处理5P412、利用人工接头（linker）连接带有限制性内切酶切点的一段人工DNA片段423、加入同聚体尾连接：TdT末端加尾的原理43444.平端连接 所用ATP及T4DNA连接酶的浓度比，粘性末端连接要高些

13、（大于2.5倍）45转化程序： 感受态细胞+质粒DNA 42、90sec 不含抗生素的培养基热休克37 涂布选择性平板 37 得到细胞的克隆 30-60min （合适抗生素） 10hr （使质粒扩增）四、将重组DNA导入宿主细胞1.转化（transformayion）将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞的过程。宿主：大肠杆菌感受态细胞（Competent Cell）：E-coli经Cacl2处理（0-5），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力。46DNA E-coli 转染动、植物病毒DNA 动植物细胞 （transfection） 噬菌体颗粒 E-coli 感染病毒颗粒 动、植物细

14、胞 2.感染（infection）：也称转导（transduction）由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程有一个：体外包装过程47（1）遗传学方法 （2） 免疫学方法 （3）核酸杂交法 （4）PCR技术 （5）酶切鉴定1.遗传学方法 筛选转化菌： 含抗性基因的质粒，转化后，细菌在含这种抗生素的培养基中培养，未被转化的细菌即被杀死，能生长的，就是一转化的。五、重组体的筛选484950A：当M13感染空载宿主后，产生完整的LacZ产物。 -半乳糖苷酶 Xgal X（兰色）+gal（无外源DNA） B：当M13插入了外源DNA后，其LacZ基因被破坏，不能与宿主细胞中LacZ的互补，产生

15、LacZ产物。 Xgal X （兰色） （含外源DNA 重组克隆）C：蓝白筛选： 筛选带有重组体的克隆插入失活法（insertion inactivation）鉴别：质粒重组体和非重组体适用于： 具有两个或两个以上抗生素性标记的质粒。 -互补 （-complementation）M13噬菌体（插入了一段LacZ基因）宿主（删除了一段LacZ基因 Lac-512免疫学方法 原理：以目的基因在受体细胞中的表达产物作为Ag，免疫动物制备Ab，通过Ag、Ab反应，将带目的基因的克隆筛选出来。方法：放免、化学方法、显色反应等。523. 核酸杂交法 从基因文库、cDNA文库或重组反应质粒中筛选目的基因。

16、将含有外源DNA的细菌生长在琼脂板上 将NC膜或尼龙膜覆盖平板表面 NaOH处理膜 32P-DNA杂交或RNA X线曝光 放射自显影 阳性斑点534. PCR技术5、酶切鉴定54第四节真核细胞转染一. 基本方法和原理1.磷酸钙共沉淀法（Calcium phosphate co-pecipitation）外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合，形成微小颗粒，沉积在细胞表面，被宿主细胞摄取。2.电穿孔法（electroporation）外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流作用下，细胞膜出现许多小孔，外源DNA进入宿主细胞。553、DEAE葡聚糖（DEAEDextran）法（带正点荷）经细胞内吞作用吸入细胞短暂表达外源DNA（带负电荷）4、脂质体(liposome)介导基因导入阳离子脂质体（膜成分） DNA负电荷与细胞膜溶合外源DNA被释放到胞浆 短暂表达565、显微注射法（microinjection）将外源基因通过毛细玻璃管，再显微镜下注释到受精卵的细胞核内的方法。57 tk tk 转入外源