IPTG诱导蛋白表达的原理

1、IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候 ,需要诱导物进行诱导(相当于点火 ),但乳糖可以被细胞利用掉 ,所以利用 IPTG(异丙基 -D-硫代半乳糖苷 )在结构上与乳糖的相似性也可以将 基因表达 启动 ,但它不能被细胞利用掉 ,从而实现持续的表达 .IPTG 是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶， 它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网

2、上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。最早应用于的表达系统是 Lac 乳糖操纵 子，乳糖的类似物 IPTG 可以和 lacI 产物结合，使其构象改变离开 lacO，从而激活转录 .这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表 达系统载体构建的常用元件。 tac 启动子是 trp 启动子和 lacUV5 的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比 lacUV5 更优越。 trc 启动 子是 trp 启动子和 lac 启动子的拼合启动子， 同样具有比 trp 更高的转录效率和受 lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的大肠杆菌中， lacI 阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac 操纵子，无法应付多拷贝

3、的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI 阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc 表达系统的表达菌株。现在的 Lac/Tac/trc 载体 上通常还带有 lacIq 基因，以表达更多 lacI 阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。 IPTG 广泛用于诱导表达系统， 但是 IPTG 有一定 毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适， 因而也有用乳糖代替 IPTG 作 为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI 的温度敏感突变体， 30度下抑制转录， 42 度开发。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加

4、热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7 启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen 公司的 pET 系统为杰出代表。强大的 T7 启动子完全专一受控于 T7 RNA 聚合酶，而高活性的 T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合酶快 5 倍 当二者同时存在时， 宿主本身基因的转 录竞争不过 T7 表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅 几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋 白的 50%以上。由于大肠杆菌本

5、身不含 T7 RNA 聚合酶，需要将外源的 T7 RNA 聚合酶 引入宿主菌，因而 T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了 T7 系统的调控模式 非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状 态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿 主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制 诱导条件控制 T7 RNA 聚合酶的量，就可以 控制产物表达量，某些情况下可以提高产 物的可溶性部分。有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7 表达系统.1.噬菌体 DE3 是 lambda 噬菌体的衍生株，含有 lacI 抑制基因和位于 lacUV5 启动子下的 T7 RNA 聚合酶基因。 DE3 溶源化的菌株

6、如 BL21(DE3) 就是最常用的表达菌株，构建好 的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac 一样都是 IPTG 诱导 .2.另一种策略是用不含T7 RNA 聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用 CE6噬菌体侵染宿主细胞 CE6 是 lambda 噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和 pL/pR 启动子控制 T7 RNA 聚合 酶的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成 .此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供 T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA 聚合酶合成，

7、据说这比较适合工业化发酵的条件控制.由于 T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手 段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平。2.是采用带有 T7lac 启动 子的载体 在紧邻 T7 启动子的下游有一 段 lacI 操纵子序列编码表达 lac 阻遏蛋白 (lacI) ，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染 色体上 T7 RNA 聚合酶前的 lacUV5 启动子并抑制其表达，也作用于载体 T7 lac 启动 子，以阻断任何 T7 RNA 聚合酶导致的目的 基因转录。 pLacI 工转化也是同样的原理 .如果这还不够，更为严谨调控手段还有 在宿主菌中表达另一个可以结合并 抑制 T7 RNA 聚合酶的基因 T7 融菌酶，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有 pLysS 和 pLysE，相容的 ori 都不会影响后继的表达 质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而 pLysE 会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现 过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平 .通过几种不同方法来巧妙调控 T7 聚合