铁含量的测定

1、铁含量的测定一、实验原理 铁的吸光光度法所用的显色剂较多，有邻二氮菲（又称邻菲罗啉、邻菲绕啉）及其衍生物、磺基水杨酸、硫氰酸盐等。其中邻二氮菲分光光度法的灵敏度高，稳定性好，干扰容易消除，是较普遍采用的一种方法。在pH值为29的溶液中，Fe2+可与邻二氮菲生成极稳定的橙红色络合物Fe(Phen)32+           该络合物在波长510mm处有最大吸收，其吸光度与铁含量成正比，可用比色法测定。 二、试剂和器材10%盐酸羟胺溶液（用时配制）；0.12%邻菲罗啉显色剂；乙酸钠溶液（1

2、mol/L）；HCl溶液（2mol/L）；HCl溶液（1:1）。铁标准储备液；铁标准使用液；比色管（50ml），电子天平，分光光度计。三、实验步骤1、样品处理精确称取样品35g，用干灰化法灰化后，加少量水润湿，加盐酸溶液（1:1）10mL溶解，移入100mL容量瓶中，用水冲洗坩埚34次，并入容量瓶中，用水定容后过滤。2、标准曲线的绘制吸取10ug/mL的铁标准使用液0、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，置于6个50mL比色管中，分别加入1mL盐酸羟胺溶液、2mL邻菲罗啉显色剂、5mL乙酸钠溶液，每加入一种试剂都要摇匀。然后用水稀释至刻度。10min后，用1cm比色皿，

3、以不加铁标准使用液的试剂空白作参比，在510nm波长处测定各溶液的吸光度。以铁含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。3、测定准确吸取上述待测溶液15mL于50mL比色管中，按标准曲线的绘制步骤，加入各种试剂，测定吸光度，在标准曲线上查出相应的铁含量（ug）。4、结果计算x= m0/(m× V 1/ V2) ×100x样品中铁的含量，ug/100g；m0从标准曲线上查得测定用样液相应的铁含量，ug；V 1测定用样液的体积，ml；V2样液定容的总体积，ml；m样品质量，g四、注意事项1. 应该注意显色时所加试剂的顺序不能改变，否则影响测定结果2. 由于高氯酸对显色剂有干扰

4、，故不能采用硝酸-高氯酸体系消化样品，可采用硝酸-盐酸体系。五、思考题1.怎样用吸光光度法测定水样中的全铁（总铁）和亚铁的含量？2.作标准曲线和进行样品实验时，加入试剂的顺序能否任意改变？为什么？游离氨基酸的测定一、实验原理 氨基酸是食品中的主要成分之一，这是因为它不仅对食品的营养有重要的影响，而且对其风味也有重要的作用。因此在评价食品质量、加工及储藏工艺等方面常要测定氨基酸容量。 本法是根据氨基酸在PH=8.04的缓冲溶液中与茚三酮同时加热，氨基氮与茚三酮形成紫色的络合物，其反应机理如下：二、试剂和器材1/15mol/L的磷酸氢二钠溶液；1/15mol/L磷酸二氢钾溶液；1/15mol/L磷

5、酸缓冲液（pH=8.04）；茚三酮试剂；锥形瓶，25ml比色管，移液管。分光光度计，电子天平。三、实验步骤1、样品处理准确称取蔬菜磨碎样1.000g左右，放在200mL锥形瓶中，加入煮沸蒸馏水80mL，于沸水浴中浸提30min，然后过滤、洗涤，滤液入100mL容量瓶中快速冷却至室温，最后用水定容至100mL，摇匀即为供试液。2、测试取供试液1mL置于25mL比色管中，加pH=8.04的磷酸缓冲液0.5mL，加茚三酮试剂0.5mL，摇匀，在沸水浴中加热15min,。待冷却后加蒸馏水定容至刻度。以蒸馏水代替供试液作为空白对照。于570nm波长处以1.0cm比色杯测定吸光度。3、标准曲线的绘制准确称

6、取赖氨酸100mg,溶于100mL水中，然后用水稀释成如下浓度：25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL、400ug/mL。分别取1.0mL置于25mL比色管中，然后同上处理，测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以每毫升中所含赖氨酸的质量为横坐标绘制标准曲线。4、样品中氨基酸含量的计算 cFX= 100 mx样品所含氨基酸的量，mg/100gc在标准曲线上所查得的每毫升被测试样中氨基酸的量，mgF稀释倍数M样品质量，g四、注意事项 水浴中加热时，必须将容器极大部分浸入水浴，严格控制时间15min和温度100，比色要在2h内完成。实验一 油脂酸价的测定一、实

7、验原理：油脂由于光和热或微生物的作用而被水解，产生游离脂肪酸从而降低了油脂品质，严重时候甚至发生酸败而不能食用。酸败程度的大小用酸价来表示。酸价的定义是指中和1g油脂中游离脂肪酸所需要的氢氧化钾的质量（mg）。油脂中的游离脂肪酸与氢氧化钾发生中和反应，根据氢氧化钾标准溶液的消耗量可计算出游离脂肪酸的量。二、试剂和器材0.1mol /L KOH 标准溶液，1%酚酞指示剂。中性乙醇乙醚混合液：乙醇、乙醚按照1 : 2 混合，使用前以酚酞为指示剂用 0.1 mol/L KOH溶液中和至呈淡红色。锥形瓶，滴定管。 反应式如下： 同一种植物油的酸价高，表明油脂因为水解而产生较多的游离脂肪酸。酸价是反映油

8、脂酸败的主要指标。三、实验步骤精确称取 3 5g 样品，置于锥形瓶中，加入50ml 乙醇乙醚中性混合液，振荡摇动促使样品溶解，以1%酚酞作指示剂，用0.1mol/L的KOH标准溶液滴定至微红色，且于30s内不褪色为终点。按下式计算： cV X 56.11 酸价= m式中 V样品消耗氢氧化钾标准溶液的体积，单位：mL； c氢氧化钾标准溶液的浓度，mol/L； m样品质量，g ; 56.111mL 1mol/L 氢氧化钾溶液相当于氢氧化钾的质量， mg 。四、注意事项1.当试样颜色较深，终点难以判断时，可减少试样用量或稀释试样。2. 氢氧化钾标准溶液也可用氢氧化钠代替，但计算公式不变，即仍以氢氧化

9、钾的摩尔质量计算。五、思考题在食品加工储藏过程中影响食品酸价的因素有哪些？如何降低这些因素的影响？2.2 油脂过氧化值实验实验二 油脂过氧化值的测定一、实验原理：过氧化值是指油脂中过氧化物的总含量，是油脂中不饱和脂肪酸与空气中的氧气发生氧化作用所产生的氢过氧化物，为油脂氧化过程的中间产物。它很不稳定，能继续分解成醛、酮类和氧化物等，使油脂进一步酸败变质。氢过氧化物对人体健康有害，过氧化值超标的油脂不能食用。因此，过氧化值是油脂初期氧化程度的标志，是反映食用油脂新鲜度和氧化酸败程度的重要指标。油脂与空气中的氧发生氧化作用所产生的氢过氧化物，是油脂自动氧化的初级产物，它具有高度活性，能够迅速地继续

10、变化，分解为醛酮类和氧化物等致使油脂酸败变质。因此，氢过氧化物是油脂初期氧化程度的标志。氢过氧化物对人体健康有害，过氧化值高的油脂不宜食用。国家强制性标准规定，花生油、葵花油、米糠油的过氧化值不得超过，菜籽油、大豆油、棉籽油的过氧化值不得超过，色拉油的过氧化值不得超过。 过氧化值（POV）有多种不同的表示方法，一般用碘的百分数表示；也可采用每千克样品中含过氧化物的毫摩尔质量表示，单位用g/100g 或 meq/kg 表示。油脂氧化过程中产生过氧化物，在酸性环境中与碘化钾反应时析出碘，以硫代硫酸钠标准溶液滴定，根据 100g 油脂中所含过氧化物与碘化钾反应生成碘的质量（g）计算过氧化物的含量。反

11、应式如下： 二、试剂和器材 饱和碘化钾溶液：称取14g 碘化钾，加 10ml 水溶解，必要时微热使其溶解，冷却后储存于棕色瓶中，临用时配制。 三氯甲烷冰醋酸混合液：量取40ml 三氯甲烷，加60mL 冰醋酸，混匀。 0.002mol/L 硫代硫酸钠标准溶液。 1%淀粉指示剂：称取可溶性淀粉1g，加入少许水调成糊状，倒入100mL 沸水中调匀，煮沸，临用时配制。 碘量瓶，滴定管。三、 实验步骤 1、精确称取 23g 混匀样品（必要时过滤），置于250mL 碘量瓶中，加30mL 三氯甲烷冰醋酸混合液，溶解样品。加入1.00mL 饱和碘化钾溶液，立即加塞摇匀，放至暗处5min。 2、于碘量瓶中加水1

12、00mL，以0.002mol/L 硫代硫酸钠标准溶液滴定，至淡黄色时，加入1mL 淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为终点。 同时，做一空白实验。 3、结果计算 过氧化值=（V1V2）X c X 0.1269 / m X 78.8式中 V1滴定样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积， mL ; V2滴定空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积， mL ; c硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L; m样品质量，g ；0.1269与1.00mL 硫代硫酸钠标准溶液c(Na2S2O3)=1.000mol/L相当的碘的质量，g 。四、注意事项过氧化值如采用meq/kg表示，则可按式POV（meq/kg）X 0.0126

13、9x=POV(%)即式POV（meq/kg）= POV(%)X78.8五思考题1.如何根据油脂过氧化值的大小判断油脂的酸败程度？2.实验过程中加入碘化钾后，静置时间长短以及加水量的多少对测定结果是否有影响？实验三 油脂碘值的测定一、实验原理所谓碘值就是表示有机化合物中不饱和程度的一种指标。指100g物质中所能吸收(加成)碘的克数。主要用于油脂、脂肪酸、蜡及聚酯类等物质的测定。不饱和程度愈大，碘值愈高。干性油的碘值大于非干性油的碘值。油脂的碘值就是，100g油脂中能吸收的碘的克数。表示此油脂的不饱和度的高低。 碘值的测定是鉴于油脂的不饱和脂肪酸，在每一双键处，可加入2原子的碘。由于碘和脂肪酸的不

14、饱和键加成反应缓慢，因此，利用在酸性环境中溴化碘与不饱和脂肪酸起加成反应，游离的碘被标准硫代硫酸钠溶液滴定，根据消耗硫代硫酸钠的量计算出碘值，反应式如下： Br2 + I2 2IBr H+CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH + IBr CH3-(CH2)7-CHI-CHBr-(CH2)7-COOH IBr(剩余)+KII2+KBrI2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaI二、试剂和器材 溴化碘醋酸溶液：取纯碘13.2g 溶于1000mL纯冰醋酸（99.5%）中，溶解在水浴上进行。先将碘置于烧杯中，徐徐加入醋酸，分批多次加入，使碘溶解，冷却后，加溴3mL（相对密度 3.

15、18），混匀，备用。0.1mol/L 硫代硫酸钠标准溶液，15%碘化钾溶液，三氯甲烷，0.5%淀粉指示剂。碘量瓶，滴定管。三、实验步骤1. 、称取油类0.5g，放入250mL硫代硫酸钠标准溶液，加入三氯甲烷10mL,摇动，使之溶解。2、加入溴化碘醋酸溶液25mL,如加入溴化碘醋酸溶液完全褪色，应再加入若干毫升，至不完全褪色为止。加入溴化碘醋酸溶液须勿沾在瓶壁上，加盖摇动，于暗处静置30min。3、 反应后，加15%碘化钾溶液10mL,充分摇动，加煮沸而冷却的蒸馏水100mL(注意：如有碘液沾于瓶塞，应设法用水冲下)，立即以0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定，最初可迅速滴入，当颜色变浅时，小心滴

16、定至黄色，再加入淀粉指示剂2mL,滴至蓝色消失为止，将至终点时用力摇动，使溶于三氯甲烷的碘与硫代硫酸钠充分反应。同时做空白实验，除不加油脂样品外，其他操作完全与上述相同。4、 结果计算 由于空白实验所需体积减去油脂样品所需硫代硫酸钠的体积，即可计算样品碘值。 碘值=cX（V1V2）X0.1269/mX 100式中 c标准硫代硫酸钠溶液的浓度，mol/L; V1滴定空白消耗硫代硫酸钠溶液的用量，mL; V2滴定样品消耗硫代硫酸钠溶液的用量，mL; m样品质量， g； 0.1269与1.00mL 浓度为1.0000mol/L 的硫代硫酸钠溶液相当的碘的质量，g。五、注意事项1.碘值在一定条件下测定

17、的，应注意的是有共轭酸存在时，加成反应很慢而不够彻底，所得碘值与实际不饱和度相差甚远。实际测定中，碘值范围与样品取样量也有关。2.称取样品置于碘量瓶中，加提取剂及溴化碘醋酸溶液后，需封闭瓶口，微微震荡后置于暗处反应。六、思考题单质碘也可与脂肪不饱和键发生加成反应，在测定脂肪碘值是为什么不直接采用碘液作为反应液，而使用氯化碘或溴化碘？实验四 油脂皂化值的测定一、实验原理皂化值是指中和1g物料完全皂化时所消耗氢氧化钾的毫克数。皂化值通常用来指示油或脂肪的平均分子量，表示在1g油脂中游离的和化合在酯内的脂肪酸的含量。一般来说游离的脂肪酸的数量较大时，皂化值也较高。氢氧化钾不仅中和游离的脂肪酸，而且中

18、和甘油酯分解所产生的酸。皂化值与脂肪酸的分子量有关，皂化值大，则分子量小，因为低级脂肪酸皂化时所需的氢氧化钾量比同质量的高级脂肪酸多。因此，皂化值测定的原理是，加入过量碱，加热以使其完全皂化，而后再以标准酸滴定过剩碱，由滴定的酸量计算皂化值，反应式如下：R3C6O6H5+3KOH3RCOOK+C3O3H8 甘油酯 肥皂 甘油 KOH(剩余)+HClKCl + H2O二、试剂和器材0.5mol/L KOH乙醇溶液：取纯KOH28.05g溶于1000mL纯乙醇中。0.5mol/L HCl 标准溶液，酚酞指示剂。锥形瓶，滴定管。三、实验步骤1、 称取油脂12g，置于250mL 锥形瓶中（可先称锥形瓶

19、的质量，用移液管或者滴定管吸取油脂约2mL,置于其中，重新称重）。加入0.5mol/L KOH 乙醇溶液50mL,在锥形瓶上安装球形或者蛇形冷凝器，在水浴上加热沸腾（需注意勿使乙醇回流太快），直至完全皂化为止，约需0.5h，冷却，加入酚酞指示剂一滴，以0.5mol/L HCl 标准溶液滴定皂化后剩余的KOH。2、 另取250mL锥形瓶一个，加入0.5mol/L KOH 乙醇溶液50mL，以0.5mol/L HCl 标准溶液滴定，作为空白实验。3、 结果计算 皂化值=cX（V1V2）X56.1/mX 100%式中 c标准盐酸溶液浓度， mol/L; V1滴定空白消耗盐酸溶液的用量，mL; V2滴

20、定样品消耗盐酸溶液的用量，mL; m样品质量， g； 56.1与1.00mL 浓度为1.0000mol/L 的盐酸溶液相当的氢氧化钾的质量，g。四、注意事项1.在用盐酸标准溶液滴定时，应趁热滴定，温度过低，很多油脂会发生凝固，从而影响滴定结果。2.不同植物油的脂肪酸组成不同，所以其皂化值也不同，通常油脂的皂化值有一定的范围。五、思考题为什么皂化后过量的碱用盐酸而不用硫酸中和？实验：糖含量的测定蒽酮比色法一、实验原理蒽铜可以和游离的己糖或多糖中的己糖基、戊醛糖及己糖醛起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在波长为260nm处测定其吸光度，此时吸收值最大。二、试剂和溶液分析中，除非另有说明，限用分析纯试剂、

21、蒸馏水或相同纯度的水。1） 蒽铜试剂（C14H10O）：取2g蒽铜溶于100ml 80%的H2SO4溶液中。2） 葡萄糖溶液（C6H12O6）：标准葡萄糖溶液 0.1mg/ml。标准葡萄糖溶液的配置：称取葡萄糖100mg，溶于950ml蒸馏水中，用硫酸或氢氧化钠溶液调节溶液的PH=7，定量移入1000ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀。此溶液1ml，含葡萄糖0.1mg。三、仪器1） 恒温水浴锅。2） 分光光度计。四、分析步骤：（1）标准曲线的绘制：1） 标准比色溶液的配置：适用于3cm光径长度比色皿的光度测量。按表所示量，将葡萄糖标准溶液（0.1mg/ml）注入6个大试管中，每个试管按表分别加入蒸

22、馏水（ml）和蒽酮试剂（ml），摇匀，把试管放在试管架上，浸入沸水浴中准确煮沸10min，不时摇动，然后取出，用自来水冷却至室温，放置10min。表一： 葡萄糖标准溶液中葡萄糖的含量试剂管号0 1 2 3 4 5标准葡萄糖溶液/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5蒸馏水/ml 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5蒽酮试剂/ml 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.02） 吸光度测定：在30min内，以葡萄糖吸光度为零的溶液作为参比溶液，在波长620nm处，用分光光度计测定标准比色溶液的吸光度。3） 标准曲线的绘制：以5ml标准比色溶液中所含葡萄糖的毫克数为横坐标，

23、相应的吸光度为纵坐标，用Excel作图。表二：6组浓度测得吸光度值管号 0 1 2 3 4 5葡萄糖标准溶液体积/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5葡萄糖的对应量/mg 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05吸光度值 0 0.035 0.087 0.110 0.165 0.222 表三：标准曲线图（A=bc）（2）测定： 1）试样及试液准备：称取33.23g苹果，用榨汁机搅碎，置于1000ml烧杯中，加水冲干净榨汁机内壁，最后定容至1000ml，然后用真空抽滤装置过滤。取5ml试液，溶于145ml蒸馏水中。 取上诉试液1ml加入大试管中，并加4ml蒽酮试剂，混匀，把

24、试管放在试管架上，浸入沸水浴中准确煮沸10min，不时摇动，然后取出，用自来水冷却至室温，放置10min。2）空白试验：按上述操作步骤进行空白试验，除不用样品外，操作手续和应用的试剂与测定试样时相同。3）吸光度测定：与标准曲线绘制方法相同，对试验及空白试验溶液进行光度测定，测定其吸光度。4）测得吸光度：A=1.384五、分析结果和计算从标准曲线查出所测吸光度对应的葡萄糖的量。试样中葡萄糖含量以质量百分数（%）表示，按下式计算：=CV/m ×100%葡萄糖的质量分数；C从标准曲线上查出葡萄糖质量浓度（mg/ml）；V样品稀释后的体积（ml）；m样品的质量（mg）。总糖和还原糖含量的测定

25、一、实验原理用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行鉴定，这样可分别求出总糖和还原糖的含量。二、试剂和器材山芋粉和其他植物材料。蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000ml体积分数为80%的硫酸中，当日配制使用。标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg 葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴滴甲苯作防腐剂）6mol/L 的HCL溶液10%的NAOH溶液：称取10g NAOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100ml刻度吸管，试管及试管架，容量瓶，玻璃漏斗，量筒，研钵，锥型瓶可见分光光度计，电子分析天平，水浴锅，电炉三、实验步骤1. 葡萄糖标准曲线的绘制2.

26、 样品中还原糖的提取和测定称取样品0.5g，加蒸馏水约3ml ，在研钵中磨成匀浆，转入锥形瓶中，并用约30ml 的蒸馏水冲洗研钵23次，洗出液并入锥形瓶中。于50水浴中保温30min（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100ml。过滤，取1ml 滤液进行还原糖的测定。3样品中还原糖的提取、水解和测定称取样品0.5g，加蒸馏水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入锥形瓶中，并用约12ml的蒸馏水冲洗研钵2 - 3次，洗出液并入锥形瓶中。再向锥形瓶中加入6mol/l 的HCL 10ml，搅拌均匀后在沸水中水解30min，过滤，去滤液10ml，用蒸馏水定容至100ml，为稀释1000倍的总糖水解液。取1m

27、l总糖水解液，测定其还原糖的含量。4.结果计算按照下列公式分别计算样品中还原糖和总糖的质量分数X1   = c1V1/ m ×100X2   = c2V2/ m ×0.9×100式中  X1 -  还原糖的质量分数，%X2 - 总糖的质量分数，%C1 还原糖的质量浓度，由标准曲线查得，mg/mlC2 水解后总糖的质量浓度，由标准曲线查得，mg/mlV1 样品中还原糖提取液的体积，mlV2 样品中总糖提取液的体积，mlM 样品的质量，mg四、注意事项计算总糖含量的公式，在测定干扰杂志很少、还原糖含量相对总糖

28、含量很少时适用，乘0.9是为了从测定总糖水解成单糖量中，扣除水解时所消耗的水量。五、思考题1.样品中总糖的提取和水解过程中应注意什么？2.解释测定总糖实验的原理和方法。食品中总酸的测定一.实验原理根据酸碱中和的原理，用碱液滴定试液的酸，以酚酞为指示剂确定滴定终点，按碱液的消耗量计算食品中总酸含量。二试剂和器材0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液。1%酚酞指示剂溶液。组织捣碎机，水浴锅，碱式滴定管。新鲜韭菜样品，烧烤韭菜样品。三实验步骤1.试样的制备去新鲜韭菜样品和烧烤韭菜样品各5.0g，磨碎后加入与200mL蒸馏水，混匀，转移至500mL的烧杯中。置于沸水浴中煮沸30min，取出，冷却至室温，

29、用快速滤纸过滤，收集滤液备测。2.测定取25mL试液，置于250mL锥形瓶中，加4060mL水及0.2mL1%酚酞指示剂溶液。用0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至微红色30s不褪色，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液V。3.结果计算总酸以每千克样品中酸的质量表示，按下式计算：式中 x每千克样品中酸的质量，g/kg； c氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L； V滴定试液时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL； F试液的稀释倍数； m试样的取样量，g； K酸的换算系数（该处取苹果酸的换算系数，0.067.）四、注意事项本法适用于果蔬制品、饮料、乳制品、酒、蜂产品、淀粉制品、谷物制品和调味品等食

30、品中总酸的测定，不适用于深色或浑浊度大的食品。五、思考题1、简述酸度测定在啤酒、白酒和制醋工业中的地位、2、简述酸度测定的其他方法和优缺点。食品中叶绿素含量测定-丙酮提取法一、实验原理叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为：A=

31、Kbc式中： A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示：A663=82.04Ca+9.27Cb （1

32、）A645=16.76Ca+45.60Cb （2）解方程（1）和（2）得：Ca=12.7 A6632.59 A645 (3)Cb=22.9 A6454.67 A663 (4)Ca十b20.3 A6458.04 A663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。二、材料、仪器、药品1材料：植物绿色叶片。 2仪器：(1) 分光光度计；（2）天平；(3) 研钵；(4) 滤纸；(5) 漏斗；(6) 5ml移液管；(7) 打孔器；（8）滴管；（9）剪刀；（10）2

33、5ml容量瓶；（11）毛刷；（12）擦镜纸。3. 药品：80%丙酮三、实验步骤 1取样：用毛笔或毛刷清除叶片表面的灰尘，用打孔器从绿叶和黄叶上各打取0.25dm-2的叶圆片，立即称重，剪碎后放入研钵中。（在正规实验中应各重复3次，本实验为减少丙酮向环境中的排放，故不设重复）。注意取样时要避开大的叶脉。如果需要计算叶片干样叶绿素含量，另取一份相同样品置于烘箱中烘干，用于测定干重。2研磨提取：向研钵中加入80%丙酮2.5ml，以及少许CaCO3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止35min后，用一层干滤纸

34、过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。3读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗23次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645、652nm处，以

35、80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100%。 4结果计算：将645、663、652nm处测得的吸光度代入公式（3）、（4）、（5）、（6）中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式（7）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。食品中蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法） 一、实验原理用Bradford建立的考马斯亮蓝法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出特点，因而正

36、在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变成595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质的浓度成正比。二、试剂和材料：分析中，除非另有说明，限用分析纯试剂、去离子水或相同纯度的水。1） 标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（BSA）配置成0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。标准蛋白质溶液的配置：称取BSA 100mg（实称100.8mg），溶于950ml蒸馏水中，定量移入1000

37、ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀。此溶液1ml，含BSA 0.1mg。2） 考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg（实称100.5mg）考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1L。 3）牛奶三、仪器1） 可见分光光度计；2） 旋涡混合器3） 试管，1L容量瓶，烧杯，玻璃棒等。四、分析步骤：（1）标准曲线的绘制：1）标准比色溶液的配置：适用于3cm光径长度比色皿的光度测量。 取13支试管，一只作空白，其余试管分为两组，分别加入0、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液（浓度为0.1mg/ml）

38、，然后用去离子水补充至1.0ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，里面产生大量气泡而难于消除）。表一:蛋白质标准溶液中蛋白质的含量试剂管号1 2 3 4 5 6 7标准蛋白质溶液/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0去离子水/ml 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝G-250试剂/ml5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.02）吸光度测定：加完试剂25min后，即可开始用1cm比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光度，以未加蛋白质溶液的第一支试管

39、作为空白对照，即1mlH2O加5.0mlG-250试剂。 3）标准曲线的绘制：以标准蛋白质量（mg）为横坐标，相应的吸光度值为纵坐标，用Excel作图。表二：7组浓度测得吸光度值管号 1 2 3 4 5 6 7标准蛋白质溶液体积/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蛋白质的对应量/mg 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10吸光度值 0 0.105 0.178 0.276 0.415 0.512 0.664 残基：在蛋白质的序列中,氨基酸之间的氨基和羧基脱水成键,而剩下的没有脱水成键的基团。表三：标准曲线图（A=bc）标准蛋白质量（mg）（2）样品的

40、测定： 1）试样及试液准备：m（牛奶）=0.9810g，稀释，用500ml容量瓶定容。（1.962mg/ml） 取1ml样品溶液（其中含蛋白质10100g/ml）加入试管，再加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，立即在旋涡混合器上混合，测定吸光度值。2）空白试验：取1ml蒸馏水代替样品作为空白对照。按上述操作步骤进行空白试验，除不用样品外，操作手续和应用的试剂与测定试样时相同。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。3）吸光度测定：与标准曲线绘制方法相同，对试验及空白试验溶液进行光度测定，测定其吸光度。4）测得吸光度：A= 的五、分析结果和计算根据所测样品的吸光度值，在标准曲线

41、上查出相应的蛋白质质量，从而计算出样品溶液的蛋白质含量（mg/100g）。蛋白质含量=c×100/m式中：c由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg； m样品质量，g。六、注意事项：1、不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，以洗去染料。塑料比色皿绝不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。2、由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用G球蛋白为标准蛋白，以减少这方面的偏差。3、标准曲线有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白

42、质的浓度。七、思考题考马斯亮蓝法中G-250和R-250均可作为蛋白质染料，比较这两种试剂的不同点。食品中亚硝酸盐的测定一、实验原理：试样经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺耦合形成紫红色化合物，颜色的深浅与亚硝酸盐的含量成正比，其最大吸收波长为538nm，可测定吸光度，并与标准样品比较定量。二、试剂和材料：分析中，除非另有说明，限用分析纯试剂、去离子水或相同纯度的水。3） 标准亚硝酸钠溶液：用亚硝酸钠（分析纯）配置成5g/ml的标准蛋白质溶液。标准亚硝酸钠溶液的配置：称取亚硝酸钠0.005g，溶于950ml蒸馏水中，定量移入1000ml容量

43、瓶中，稀释至刻度，混匀。此溶液1ml，含亚硝酸钠5g。2）4g/L对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g（实称0.4050g）对氨基苯磺酸，溶于100ml 20%盐酸中，置于棕色瓶中混匀，避光保存。3）2g/L盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2g（实称0.2050g）盐酸萘乙二胺溶解于100ml水中，混匀后，置于棕色瓶中，避光保存。4）实验材料：腌菜，如榨菜等。三、仪器：4） 可见分光光度计；5） 50ml比色皿7个，容量瓶，烧杯，玻璃棒等。四、分析步骤：（1）标准曲线的绘制：1）标准比色溶液的配置：适用于3cm光径长度比色皿的光度测量。 取7支50ml比色皿，分别加入0、0.2ml、0.4ml、0.6ml

44、、0.8ml、1.0ml标准亚硝酸钠溶液（浓度为5g/ml），第7支比色皿加1ml待测液。再分别向7个试管中加入2.0ml对氨基苯磺酸溶液，混匀后，静置3-5min；再分别向7支比色皿加1ml盐酸萘乙二胺，混匀静置15min，再加水至50ml。表一: 标准亚硝酸钠溶液中亚硝酸钠的含量试剂管号1 2 3 4 5 6 7待测液/ml 0 0 0 0 0 0 1对氨基苯磺酸/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0亚硝酸钠标准溶液/ml0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0盐酸萘乙二胺溶液/ml1 1 1 1 1 1 12）吸光度测定：加完蒸馏水25min后，即可开始用1

45、cm比色皿，在分光光度计上测定各样品在538nm处的吸光度。 3）标准曲线的绘制：以标准亚硝酸钠（g）为横坐标，相应的吸光度值为纵坐标，用Excel作图。表二：7组浓度测得吸光度值管号 1 2 3 4 5 6 7（待测）标准亚硝酸钠溶液体积/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 亚硝酸钠的对应量/g 0 1 2 3 4 5 吸光度值 0 0.013 0.030 0.041 0.061 0.073 0.039表三：标准曲线图（A=bc）标准亚硝酸钠质量（g）（2）样品的测定： 1）试样及试液准备：称取5.0g试样，置于50ml烧杯，加入12.5ml硼砂饱和溶液混匀，70左右加热，加入

46、约300ml的水将试样加在500ml容量瓶，沸水浴15ml，冷却，边转动边加入5ml亚铁氰化钾，摇匀，加5ml醋酸锌沉淀蛋白质，加水至刻度混匀放置0.5h除去上层脂肪，滤纸过滤，备用。2）空白试验：取1ml蒸馏水代替样品作为空白对照。按上述操作步骤进行空白试验，除不用样品外，操作手续和应用的试剂与测定试样时相同。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。3）吸光度测定：与标准曲线绘制方法相同，对试验及空白试验溶液进行光度测定，测定其吸光度。4）测得吸光度：A= 的五、分析结果和计算根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质质量，从而计算出样品溶液的亚硝酸钠含量。X= A&

47、#215;100 M×V2/V1×100式中：X试样中亚硝酸盐含量mg/kg； m样品质量，g。 A测定用样液中亚硝酸盐的质量（由标准曲线得）g V1试样处理液兑体积ml V2测定用样液体积ml 食品中钙含量的测定一、实验原理 将试样中的有机物质破坏，钙变成溶于水的离子、用三乙醇胺、乙二胺、盐酸羟胺和淀粉溶液消除干扰离子的影响。以钙红为指示剂，在碱性溶液中（pH=12-14）用乙二胺四乙酸二钠（EDTA）络合滴定钙离子，置换出钙红指示剂，溶液由酒红色变成纯蓝色为终点，同时做空白试验，根据消耗的EDTA标准溶液的量计算样品中钙的含量二、试剂和器材10%的NaOH 、钙红指示剂

48、、0.01mol/L EDTA，1%淀粉溶液，硝酸，高氯酸（70%-72%）。电子天平，高温炉，电炉，坩埚及坩埚钳。三、实验材料干菜类食品四、实验步骤1、试样的分解干法：称取试样2-5g于坩埚中，准确至0.0002g，在电炉上小心炭化，再放入高温炉于600下灼烧3-6h，必要时灼烧前加入少许双氧水。灰化后在盛灰坩埚中加入6mol/L盐酸溶液10mL，加热溶解后经过滤，移入100mL容量瓶，用热水洗涤残渣和滤器3-5次，合并滤液，冷却至室温，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。2、测定准确吸取试样分解液5-25mL（钙含量5-25mg）于250mL锥形瓶中，加蒸馏水50mL，淀粉溶液5mL，

49、三乙醇胺溶液2 mL，乙二胺1mL，加10%NaOH溶液使溶液pH值为12，之后加入盐酸羟胺溶液1mL，再加入钙红指示剂少许，立即用乙二胺四乙酸二钠标准溶液滴定，使溶液由酒红色变为纯蓝色，即为终点。同时做空白实验。3结果计算W（Ca）= c×（V2-V1）×40.08×100 m× 10 ×1000 100式中 w（Ca）-样品中钙的含量，% c-EDTA二钠标准溶液浓度，mol/L V2样品实验消耗EDTA的体积，mL， V1空白实验消耗EDTA的体积，mL， 40.08-Ca的摩尔质量，g/mol m- 试样质量，g 10/100-假设从1

50、00mL试样分解液中取10mL进行测试五、注意事项用盐酸溶解碳酸钙时要用表面皿盖好烧杯后再加盐酸，以防喷溅。六、思考题EDTA络合滴定法测定钙时为什么要调节pH值12？ 果胶含量的测定 一、实验原理 将果胶溶解与水，加碱皂化，再加醋酸酸性条件下与氯化钙反应，生成果胶酸钙，然后将此果胶酸钙沉淀溶解于氢氧化钠，以EDTA标准液滴定其中的钙，按钙的含量换算成果胶的含量。钙与指示剂EDTA(H2Y2-)反应如下： Ca2+ +HI2- - CaI-+H+ 指示剂（蓝色） 紫红色 CaI- +H2Y2- CaY2- +HI2-+H+ 紫红色 紫色二、试剂和器材0.1mol/L NaOH1mol/L 醋酸溶液钙指示剂0.5%铬黑T指示剂0.02mol/L EDTA标准溶液球型冷凝管、容量瓶、吸管、滴定管、烧杯、称量瓶。实验材料：苹果三、实验步骤1样品制备 取苹果3-4个，用水洗净，并用干毛巾抹干，除去果柄、种子、果核，在研钵中捣碎或用粉碎机绞碎，充分混合。称取此样品100g（准确至小数点后两位），放入500mL锥形瓶中，加水300mL，连接冷却器，在石棉网上加入煮沸1h，然后移入500mL容量瓶中，冷却后，以水稀释至刻度，充分摇匀。在80水浴中加热后过滤，用干漏斗铺上脱脂棉（尽量铺厚些）过滤，用此滤液测定果胶。2. 测定吸取制备的样品溶液25mL于400mL烧杯中，加