973计划项目结题总结报告

1、973 计划项目结题总结报告篇一： 973 课题的结题总结报告国家重点基础发展规划项目课题结题总结报告项目编号： G1998010200项目名称：农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究 首席科学家：贾继增 张启发课题编号： G1998010207课题名称：水稻抗病基因克隆课题负责人：翟文学子课题负责人：翟文学 彭开蔓(王石平)承 担 单 位：中国科学院遗传所，华中农业大学电子信箱： wxzhai,XX 年 9 月 30 日一、计划任务完成情况本课题的预期目标是分离克隆 2 个水稻抗病基因。我们已经按计划开展了研究工作，分别对水稻抗白叶枯病基因Xa3、 Xa4、 xa5、 xa13

2、、 Xa25(t) 和 Xa26 以及抗稻瘟病相关 基因进行了克隆研究。目前已克隆并证实了 Xa26 基因；已克隆 Xa4 和 xa5 基因，即将证实其功能；精细定位了Xa3、xa13 和 Xa25(t) 基因；获得了 3 个抗稻瘟病相关基因。基本达到预期研究目标。具体工作与取得的进展如下 :1. 精细定位了水稻抗白叶枯病基因 Xa4 和 Xa26我们利用 F2 大群体，分别对水稻抗白叶枯病基因 Xa4和 Xa26 进行了遗传分析和精细遗传定位。这两个基因都位于第 11 号染色体的长臂末端并紧密连锁。 涉及 Xa4 基因 ( Sunet al., XX, Theor. Appl. Genet.

3、 106:683-687 )和 Xa26基因 (Yang et al., XX, Theor. Appl. Genet. 106:1467-1472 ) 遗传分析的工作已发表。2. 分离克隆了水稻抗白叶枯病基因 Xa26我们采用图位克隆法从水稻品种明恢63 中分离克隆了Xa26 基因(专利申请号： 02139212.9 ) 。序列分析发现这该基因编码LRR受体激酶类蛋白质。研究还发现，无论是在苗期还是成株期携带 Xa26基因的转基因水稻的抗谱比Xa26基因的供体水稻品种(明恢63 )的抗谱显著增宽，抗性明显增强，说明遗传背景可能影响抗病主效基因的作用。分离克隆Xa26 基因的工作正在发表印刷之

4、中( Sun et al., XX, PlantJ., in press ) 。另外，研究还发现携带抗白叶枯病基因 Xa3的近等基因系 IRBB3 和携带抗白叶枯病基因 Xa22(t) 的云南地方稻品种扎昌龙也携带 Xa26 基因。因为 Xa3 和 Xa22(t)基因也被他人定位于第 11 号染色体长臂末端，推测 Xa26、Xa3 和 Xa22(t) 是同一个基因，这部分验证工作正在进行之 中。3. 分离克隆了水稻抗白叶枯病基因 Xa4我们采用图位克隆法从水稻近等基因系 IRBB4 中分离克隆了 Xa4 基因(专利申请号： 02139257.9 ) 。序列分析发现这该基因也编码 LRR受体激酶

5、类蛋白质。Xa4和Xa26属于同 一个基因家族的不同成员。抗性分析发现发现籼稻品种特青和 93-11 与 IRBB4 的抗谱相同，序列分析发现特青和 93-11也携带 Xa4 基因。转基因初步实验结果显示遗传背景可能也影响 Xa4 基因的抗性。目前，这部分工作正在完善之中。4. 分析了 Xa4 和 Xa26 所属基因家族的进化Xa4 和 Xa26 基因所属家族(命名： Xa26 基因家族)包括10个成员。我们对水稻品种明恢63和特青包含Xa26基因家族的大约 100 kb 区段进行了测序，对比公共数据库中的水稻品种日本晴和 93-11 的同源区段的序列，分析了抗病基因的进化模式。涉及这部分工作

6、的论文正在撰写之中。5. 鉴定并精细定位了一个水稻抗白叶枯病新基因Xa25(t)在杂交水稻恢复系明恢63 中鉴定了一个新的抗白叶枯病显性基因 Xa25(t) 。该基因在苗期和成株期都能特异性的抗白叶枯病菌生理小种PXO339通过分析携带 Xa25(t)基因的重组自交系群体，将该基因定位于水稻第 12 号染色体的着丝粒区。在该着丝粒区段已经定位了多个水稻抗稻瘟病基因，推测 Xa25(t) 基因与抗稻瘟病基因紧密连锁或等位。涉及 Xa25(t) 基因 的研 究工作 已 发表 ( Chen et al., XX, Phytopathology 92:750-754) 。6. 构建了水稻全生育期平衡化

7、cDNA文库利用水稻品种明恢 63,构建了全生育期平衡化cDNA文库。该文库由水稻不同生长时期和不同生理状态下的 15 种不同组织的 cDNA 组成，包括白叶枯病菌和稻瘟病菌接种诱导后的组织。该文库包含大约 62,000 个克隆，平均插入片段为 1.4 kb ( Chu et al., XX, Chinese Science Bulletin48:229-235 )。对该文库中的大约 4万个cDNA克隆进行了测序， 获得两万多个非重复EST 序列。利用该文库我们建立了高效 cDNA芯片(包括 cDNA array 和 cDNA microarray ) 分析体系。7. 发展了一种新的EST聚类

8、方法我们发展了一种新的计算机分析方法，用于分析大规模EST 测序中所产生的大量数据，以获得高质量、非重复表达序列。该方法在聚类过程中采用 MEGABLAST具对一致序列 进行序列同源比较，并用 phrap程序对每一 EST簇进行拼接 检验。这一聚类策略能降低测序错误带来的影响，有效识别基因家族成员， 并避免选择性剪接的干扰。 与 NCB(I NationalCenter for Biotechnology Information ) 的 UniGene clustering 方法相比， ESTClustering 的聚类结果可以更好 地反映表达序列的多样性。涉及这部分工作的论文已经发表(张利达

9、等，XX,遗传学报30:147-153 )。8. 克隆获得了一批水稻抗性基因同源序列利用植物 NBSLRR类抗性基因的高度保守区设计PCR引物从水稻基因组中扩增同源序列， 经克隆测序确定后获得了 23 个不同的 NBS 片段(称为抗性基因同源序列，简记为RS)o将这些RS序列在窄叶青 / 京系 17 的重组自交系( RIL )构建的分子图谱上定位，定位结果表明它们分布在1， 3， 4， 7， 8， 9， 10 和11染色体。其中10个RS位于已知R基因所在的染色体区间。这些 RS 标记可以作为图位克隆同一位点上相应抗病基因的起点。有关结果已发表( Zheng et al ， XX,CIENCE

10、IN CHINA (Series C), 44(3): 253-262) 。9构建了含Xa4、 xa5 和 xa13 三个抗性基因的 IRBB56基因组BAC文库利用含 Xa4、 xa5 和 xa13 三个水稻白叶枯病抗性基因的累加系 IRBB56 构建了一个水稻细菌人工染色体文库。该文库包含 55296 个克隆，平均插入片段为132 kb 。按水稻基因组为 450 Mb 计，该文库覆盖14 倍基因组，筛选出任一水稻基因或序列的概率为 99.99 。用均匀分布的 3 个叶绿体基因和 4 个线粒体基因克隆作探针筛选文库，结果显示该文库中含细胞器基因组DNA同源序列的克隆数小于 1。用分布于水稻

11、3 条不同染色体、分别与Xa4、xa5和xa13连锁的DNAfe记筛选文库，分别检测出 11-106 个阳性克隆，为克隆这些基因打下了基础。该文库对水稻基因组的高度覆盖率和较大的插入片段，非常适合于物理作图和基因的分离和克隆 (王文明等，XX， 遗传学报 ,28(2) ： 120 128； Wang et al., XX, Molecular Geneticsand Genomics, 265: 118-125) 。本研究中建立的提取高质量水稻基因组DNM法和高效转化方法被成功地用于中国超级杂交稻测序 (Science, XX,296: 79-92)。10、克隆了一个 NBS-LRR类抗性基因

12、家族用水稻抗白叶枯病基因 Xa4 的近等基因系和基因累加系对克隆的NBS-LR胴源序列RS13进行RFLP分析，发现序列RS13来自 Xa4 基因位点（Wanget al, XX, Chinese ScienceBulletin, 45（19）: 1779-1782 ）。利用克隆的抗病同源序列RS13作为探针，从水稻IR64的BAC文库中筛选到4个阳性 克隆，其中一个克隆14E19能够覆盖其余3个克隆。对14E19 进行了全序列测定和分析，获得了 73kb的全长DNA序列， 基因预测显示其上有 4个编码NBS-LRR的基因，分别命名为 NL-A Do同时，对近等基因系IRBB56同一基因组位珞

13、的 BAC 克隆106P13进行分析，发现其上有10个NL同源拷贝，其中有4个同14E19上的NL一样，说明 NL是一个至少有10 个成员 （分别命名为NL-A NL-J ） 的基因家族。 搜索日本晴、93-11 、广陆矮 4 号的序列，发现三者也有多个高度同源的序列。对NL基因进行RT-PCRO cDNA$筛选分析，发现NL-B 能够在含抗白叶枯病基因 Xa4 水稻品系 IRBB4 中特异表达， 说明 NL-B 参与了白叶枯病抗性反应。把这些同源拷贝作为新的抗病基因进行研究，转基因实验正在证实这些同源拷贝 的功能。11、定位克隆了隐性抗白叶枯病基因 xa5 的候选基因本研究利用RFLR CA

14、PS等标记方法对xa5近等基因系 IR24和IRBB5构建的F2群体共5000个单株进行群体连锁分 析， 构建了 xa5 的精细遗传图谱。 在此基础上我们用 与 xa5 基因紧密连锁的标记筛查含有 xa5 的水稻累加系 IRBB56 的BAC文库，构建了包含xa5基因位点的精细物理图谱 (Zhong et al, Chinese Science Bulletin, in press) 。将 xa5 限定在 12kb 的片段上，在此区间发现唯一一个候选基因，与已知抗病基因具有不同的结构。该基因与显性等位基因编码 的氨基酸序列有差异。目前功能互补实验已获得转基因植株。12 开展了抗白叶枯病基因Xa

15、3 和 xa13 的精细定位与图位克隆本研究利用IR24与含Xa3基因的近等基因系IRBB3组合构建了约XX 单株的F2 定位群体，并利用国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组计划所公布的第 11 染色体长臂上的序列设计由一系列SSLP和CAPSfe记，对Xa3进行精细定位，将Xa3基因定位于 CAPSfe记Y3和SSRfe记RM144间， 距Y3约0.25cM,距RM144约1.0cM。目前，我们又利用日 本晴和IRBB3组合构建了约5000单株的F2群体，对Xa3基 因作进一步精细定位。利用 xa13 的近等基因系构建了包含 4000 单株的 F2 群 体，将 xa13 基因界定在第 8 染

16、色体 80Kb 的区间。对这个区间进行DNA1序和基因预测，发现了可能的候选基因，正对这些候选基因进行共分离分析和功能互补分析，有望获得突破。13 、分离克隆了抗稻瘟病相关基因本研究利用 cDNA-AFLP和组池分离分析(BSA)相结合的 方法来检测稻瘟病抗池和感池中特异表达的基因。在大约XX2 个检测到的位点中，一共获得了 12 个差异表达的条带 (DEBs), 8个来自抗池，4个来自感池。利用水稻的DH群体对它们进行遗传定位结果表明其中的 5 个 DEBs， R1, R8, S9, S16和S17被定位在第一染色体的一个抗稻瘟病的QTL所在的区间。 序列分析和等位分析发现R1 和 S16，

17、 R8 和 S9 分别来自二对等位基因位点，而且R1(S16) ， S17 和 R8(S9)分别位于第一染色体上三个紧密相连的BAC/PAC克隆中，这更进一步证实了 R1(S16) ， S17 和 R8(S9) 在第一染色体上 QTL 包含区间中的紧密连锁关系。逆向 Northern Blotting 和定量 RT-PCR分析表明 R1(S16), S17和R8(S9)在接种稻 瘟病菌后的表达水平都是上调的，这暗示它们都参与了稻瘟 病抗性反应过程。有关结果已投送国际学术刊物。二、研究水平与创新性本研究是在基因的水平上发掘水稻的抗病种质，重点是克隆符合“基因对基因”假说的，以过敏性抗病反应为基础

18、 的水稻抗病基因。已克隆的多种植物的抗病基因在序列结构 上分为五种类型，而迄今正式见诸于报导的克隆的水稻抗病 基因只有 4 个， 即抗白叶病基因 Xa21 和 Xa1， 抗稻瘟病基因 Pib 和 Pi-ta 。它们分属于二种不同的结构类型。这对于全面深入了解水稻抗病基因的本质还是远远不够的，而且也不能满足育种上对抗病基因的需求，而这二个方面正是本研究重点解决的科学问题。本研究特色在于应用水稻基因组研究的遗传作图和物理作图的综合技术以及在基因组测序基础上发展起来的基因预测方法，充分利用水稻基因组较小的特征，从多种途径发现抗病和感病的水稻材料的遗传差异，克隆水稻的抗病基因。本课题克隆Xa26 和

19、Xa4 等显性抗病基因补充和发展了植物抗病基因的研究结果，而且克隆的几个抗病基因均有重要的实用价值，研究结果将促进水稻抗病分子育种的发展。虽然近年来抗病基因研究取得许多突破，但是我们也发现已克隆的植物抗病基因多为显性基因，隐性抗病基因的研究进展不大。隐性抗病基因的研究成为目前植物抗病研究的新问题。为此我们在本课题后期启动了水稻隐性抗病基因xa5 和 xa13 的克隆， 这一研究具有很高的创新性。 目前已将xa5 限定在 12kb 的片段上， 在此区间发现并分离出一个编码转录因子的候选基因，与已知抗病基因具有不同的结构。该基因一旦证实，将成为植物抗病基因研究的重要突破。对隐性抗病基因进行克隆和研

20、究，有助于全面解析植物的抗病机制以及抗病新思路的提出。篇二： 973 项目结题报告篇一： 973 课题结题报告973 课题结题报告课题名称：大豆重要新基因的发掘与有效利用研究课题编号： tg1998010206负责人：喻德跃承担单位：南京农业大学、中国农科院品资所、吉林省农科院协作单位：中国科学院遗传发育所XX 年 10 月 15 日一、计划任务完成情况（一）计划任务 本课题的任务：发掘大豆抗花叶病毒、抗食叶性害虫、产量有关性状、育性恢复系等新基因，明确遗传规律，并进行标记和定位。具体指标如下：1、抗大豆花叶病（s m V ）基因方面：（1） 标记到 2 3 个抗性基因 , 纳入遗传图谱;（

21、2）育成抗性品系1 2个，作为育种新种质。2、抗食叶性害虫基因方面：（1）标记到1 2个抗性主基因，纳入遗传图谱；（2） 育成抗性品系1 2个，作为育种新种质。3、产量有关性状基因方面：1）标记到 3 4 个产量有关性状的基因位点 , 纳入遗传图谱 ;（ 2 ） 育成具 2-4 种特异性状的优良共同遗传背景家系 （ 类 似近等基因系 ）, 用于聚合重组。4、质核互作雄性不育恢复基因方面筛选与恢复基因紧密连锁的分子标记10cm,对恢复基因进行定位。 5 、发表 sci 引用论文五篇以上。（二）完成情况本课题鉴定出一批新的基因资源，包括：抗smv（ 133份） 、感 smv（ 122 份） 、抗食

22、叶性害虫（ 9 份） 、感食叶性抗虫（ 10 份） 、产量性状（ 8 份） 、恢复系（ 10 份） ，建立了重组近交家系群体（ ril ） 8 个。定位了 9 个新基因，获得分子标记 10 个，培育一批有育种价值的中间材料。共计发表论文 25 篇， 其中 sci 收录 6 篇， 国际特邀报告5 篇 , 专著 1 部 ,培养研究生11 人。总体上超额完成了任务目标。（三）主要进展1、资源鉴定与群体培育（1）抗大豆花叶病毒（smv）方面鉴于国内大豆 smv 株系鉴别寄主体系的混乱，在已经使用过的 25 个鉴别寄主中选拔出 8 个代表性寄主组成一套新的鉴别体系。 在长江中下游地区广泛采集病样 （近

23、300 个样） ，以寄主鉴定为主、结合smv 的组织印迹检测技术和 rt-pcr检测技术，发现自 20 世纪 80 年代至今， smv 群体已经产生根本改变，尚未发现原先鉴定过的株系。根据新鉴别体系的鉴定结果，确定了 10 个新株系（ sc-1 至 sc-10 ） ，其中 sc-8为强毒性株系群。发现： smv 株系群组成复杂，同一株系群在不同地区的流行存在差异，同时不同株系群在同一地区的分布也有所不同。综合1998-XX 年的分析结果，认为：在株系组成上，黄淮地区以sc-3 和 sc-7 为主。长江中下游地区以 sc-9 为主。测定了 106 份大豆品种（品系）对sc-7 、 sc-8 、

24、sc-9三个株系群的抗性反应，筛选出 17 份对三个株系均表现高抗的材料； 18 份能兼抗三个株系中的两个株系的材料。构建了抗 x 感杂交组合衍生的 ril 群体：科丰 1 号 x 南 农 1138-2 ， f7 ： 12 ， 206 个家系 （见表 1 ） 。用东北3号株系（smv3） X355份大豆种质资源进行了 smv抗性鉴定（包括“七五”初鉴抗smv材料40份，“八五”初鉴抗smv材料91份，各地推广品种 100 份，农科院品资所新育成的品系 35 份，美国引进材料 42 份， 韩国引进材料36 份， 泰国 2 份， 日本 1 份） 共筛选出 116 份高抗资源， 117 份中抗材料，

25、 122 份高感资源。（ 2）抗食叶性害虫基因方面综合 1993-XX 年的田间鉴定结果，获得一批高抗食叶性害虫和高感食叶性害虫的大豆种质。 高抗 （hr） 的品种 9份：黄皮小青豆、日本、 larmar 、 pi227687 、矮杆黄、 york 、阜阳170、sp26、早16号，抗（r）的品种15份，表现中间（m）的品种17份，感（s）的品种7份，高感（hs）的品种10份：大浦大粒黄、中豆 19、南农 86-4 、南农 86-4 、江宁中老鼠豆、 监利牛毛黄、 花柒黄毛豆、 沔阳白毛豆、 吴江青豆、pi229358 。合成重组近交家系群体2 个，包括： 先进 2 号（感） x赶泰 -2-2

26、 （抗）已推进到 f7 ： 9 世代，含 162 个家系；和 皖82-178 （感） x 通山薄皮黄豆甲（抗）也推进到 f7 ： 9 代，含 159 个家系 （见表 1） 。（ 3 ）产量性状基因方面获得了与提高产量潜力有关的资源8 份，包括百粒重高（40g）、主茎节数多（30）、短叶柄（ 构建了 ril群体 2 个，包括：南农87-23 x ng94-156（f7 ： 8， 175 个家系） ；波高（ 963069） x ng94-156 （f7 ： 8， 156 个家系） 。 （见表1）4)恢复基因方面获得利于大豆杂种优势应用的恢复系： 10 个。阐明了细胞质不育的遗传模式：以栽培大豆不育

27、系 ya 、保持系 yb 和含有不育细胞质的原始母本167 为基础材料，配制了二个单交组合，四个三交组合，根据后代的育性和分离比例判断遗传模式。试验结果表明： s(rfrf) 基因型 f1 花粉为半不育， f2 可育与半不育分离比例为 1： 1；母本为不育细胞质 s 时，携带 rf 的雌配子有生活力，能传给后代，而携带 rf 的雄配子无生活力，不能传给后代。母本为正常可育细胞质n 时，携带 rf 的雌、雄配子均有生活力，可传给后代。分离比例是单基因遗传模式。因此该不育系属“单基因配子体不育” ，即不育性由不育细胞质基因 s 和一对隐性基因 rfrf 控制，一个显性基因 rf 的存在即可恢复育性

28、。明确了育性的稳定性： 利用人工气候箱，设不同温度和光照长度处理，研究野生型大豆细胞质雄性不育系 oa 和保持系 ob 的育性稳定性。鉴于试材原产于高温短日照的夏大豆区， 本试验以 14 小时光照和昼夜温度30 /20 为对照处理，在 14 小时不变光照条件下，温度处理为35 /25 ， 30 /20 ， 25 /15 ；在昼夜温度固定为30 /20 条件下，光照处理为 15.5 小时， 14 小时， 12.5 小时。在上述所有处理中， 不育系 oa 花粉败育率均保持在99%以上。只有保持系在 15.5 小时光照时， 花粉败育率上升到 14.3%， 这一结果表明，不育系 oa 在温度与光照大幅

29、度变化的情况下，不育性极为稳定。从细胞学方面明确了不育发生的时期：细胞学观察发现该不育系小孢子减数分裂正常，绒毡层亦无明显异常，不育发生的时期是在单核期以后。表 1 本课题培育的 ril 群体2、新基因发掘与分子标记抗大豆花叶病毒（smv）基因方面通过对p （科丰1号）、p （南农 1138-2 ）、12f1 和 f7 ： 11 184 个家系的田间抗性鉴定和遗传分析，发现科丰1号对smv株系群sc-7、sc-8、sc-9的抗性分别由一对显性基因控制，并将rsc-7 、 rsc-8 、 rsc-9 基因定位于 n8d1b+w 连锁群上，与已经定位的三个抗性基因（ rsa 、rn1 、 rn3

30、）位于同一连锁群，成簇排列。此外，筛选到与抗性基因连锁的 scar 标记和 rapd 标记，距 rsa 和 rsc 的距离分别为 16.1 和 9.7cm 。 由于 sc-7 、 sc-8 、 sc-9 是新鉴定的smv株系群，而鉴定的抗性基因位点与已经发现的smv抗性位点位置不同，因而初步认为： rsc-7 、 rsc-8 、 rsc-9 是新的抗 smv 基因。此外，选育出 njr25-8 、 njr32-8 、 njr-44-1 等综合性状优良、抗性好的中间材料。利用高抗 smv3 号株系的大豆品系 95-5383 与感病品种(品系) hb1 ，铁丰 21 ， amsoy， willia

31、ms ，和抗病品种 pi486355 配制杂交组合，对各组合的 f1 、f2 代接种 smv3 号株系进行抗性鉴定，结果表明， 95-5383与各感病品种的杂交组合f1 代表现为感病，抗病为隐性，f2群体分离比例为 1r： 3 (s+n),表明95-5383对smv3号株系的抗性是受一对隐性基因控制。 pi486355x95-5383 的f2 代有感病植株分离， 95-5383 的抗病基因与pi486355 不在同一位点。 利用 bsa 法对 95-5383?hb1 的 99 株 f2 个体进行鉴定，筛选出与 smv 抗病基因紧密连锁的共显性 rapd标记 opn11980/1070 。 ra

32、pd 引物 opn11 在 95-5383 和抗池扩增出 opn11980 片段，在 hb1 和感池扩增出 opn111070 片段，在 f1 同时扩增出 opn11980 和 opn111070。 用该引物分 析 95-5383?hb1 的 f2 个 体 ， 共 显 性 的 rapd 标 记 opn11980/1070 与抗病基因的遗传距离为2.1cm 。从 95-5383 和 hb1 中分别回收opn11980 和 opn111070特异片段，序列分析结果表明 opn11980 和 opn111070 的实际长度分别为986bp和1084bp,同源性为93.4%,主要差别是在两个不同区段插

33、入（缺失） 54bp 和 35bp 的碱基。用克隆的 rapd 片段 opn11980 作探针 （sopn11） 对亲本基因组dna进行 southern 杂交， 结果表明 opn11980 和 opn111070 在大 豆基因组中是以低拷贝形式存在。根据克隆片段opn11980和 opn111070 的序列设计合成了一对scar 引物 scn11 ，scn11在95-5383、hb1和95-5383 X hb1的f2群体扩增结果与 rapd 引物 opn11 完全吻合。用 rapd 引物 opn11 和 rflp 探针 sopn11 分析科丰1?南农 1138-2 重组近交群体（南京农业大学

34、 / 中国科学院遗传发育所联合构建） ，将 opn11 和 sopn11 定位于 f 连锁群的抗病基因簇上。由于 95-5383?pi486355 的 f2 代接种后有感病植株分离且抗病基因位于 f 连锁群上与rsv1 不等位，表明可能定位的是新的抗病基因。此外，用 opn11 分析了 68份抗性资源，其中有25份扩增出 opn11980 ， 表明这些品种可能携带与95-5383 相同的抗性基因，而其它扩增出 opn11980/1070 和篇二： 973 课题的结题总结报告- 农业国家重点基础发展规划项目课题结题总结报告 项目编号： g1998010200项目名称：农作物资源核心种质构建、重要

35、新基因发掘与有效利用研究 首席科学家：贾继增 张启发课题编号： g1998010207课题名称：水稻抗病基因克隆课题负责人：翟文学子课题负责人：翟文学 彭开蔓(王石平)承 担 单 位：中国科学院遗传所，华中农业大学电子信箱： wxzhai,XX 年 9 月 30 日一、计划任务完成情况本课题的预期目标是分离克隆 2 个水稻抗病基因。我们已经按计划开展了研究工作，分别对水稻抗白叶枯病基因xa3、 xa4、 xa5、 xa13、 xa25(t) 和 xa26 以及抗稻瘟病相关基因进行了克隆研究。目前已克隆并证实了 xa26 基因；已克隆 xa4 和 xa5 基因，即将证实其功能；精细定位了 xa3

36、 、xa13 和 xa25(t) 基因；获得了 3 个抗稻瘟病相关基因。基本达到预期研究目标。 具体工作与取得的进展如下 :1. 精细定位了水稻抗白叶枯病基因 xa4 和 xa26和 xa26 进行了遗传分析和精细遗传定位。这两个基因都位于第 11 号染色体的长臂末端并紧密连锁。 涉及 xa4 基因 ( sun et al., XX,theor. appl. genet. 106:683-687 ) 和 xa26 基因 ( yang et al., XX, theor. appl. genet. 106:1467-1472 )遗传 分析的工作已发表。2. 分离克隆了水稻抗白叶枯病基因 xa26

37、我们采用图位克隆法从水稻品种明恢63 中分离克隆了xa26 基因(专利申请号： 02139212.9 ) 。序列分析发现这该基因编码 lrr 受体激酶类蛋白质。研究还发现，无论是在苗期还是成株期携带 xa26 基因的转基因水稻的抗谱比 xa26 基因的供体水稻品种(明恢63 )的抗谱显著增宽，抗性明显增强，说明遗传背景可能影响抗病主效基因的作用。分离克隆xa26 基因的工作正在发表印刷之中( sun et al., XX, plantj., in press ) 。另外，研究还发现携带抗白叶枯病基因 xa3的近等基因系 irbb3 和携带抗白叶枯病基因 xa22(t) 的云南地方稻品种扎昌龙也

38、携带 xa26 基因。因为 xa3 和 xa22(t)基因也被他人定位于第 11 号染色体长臂末端，推测 xa26 、xa3 和 xa22(t) 是同一个基因，这部分验证工作正在进行之中。3. 分离克隆了水稻抗白叶枯病基因 xa4我们采用图位克隆法从水稻近等基因系 irbb4 中分离克隆了 xa4 基因(专利申请号： 02139257.9 ) 。序列分析发现这该基因也编码 lrr 受体激酶类蛋白质。 xa4 和 xa26 属于同一个基因家族的不同成员。抗性分析发现发现籼稻品种特青和 93-11 与 irbb4 的抗谱相同，序列分析发现特青和 93-11也携带 xa4 基因。转基因初步实验结果显

39、示遗传背景可能也影响 xa4 基因的抗性。目前，这部分工作正在完善之中。4. 分析了 xa4 和 xa26 所属基因家族的进化xa4 和 xa26 基因所属家族(命名： xa26 基因家族)包括 10 个成员。我们对水稻品种明恢63 和特青包含xa26 基因家族的大约 100 kb 区段进行了测序，对比公共数据库中的水稻品种日本晴和 93-11 的同源区段的序列，分析了抗病基因的进化模式。涉及这部分工作的论文正在撰写之中。 5.鉴定并精细定位了一个水稻抗白叶枯病新基因 xa25(t)在杂交水稻恢复系明恢63 中鉴定了一个新的抗白叶枯病显性基因 xa25(t) 。该基因在苗期和成株期都能特异性的

40、抗白叶枯病菌生理小种 pxo339 。通过分析携带 xa25(t) 基因的重组自交系群体，将该基因定位于水稻第 12 号染色体的着丝粒区。在该着丝粒区段已经定位了多个水稻抗稻瘟病基因，推测 xa25(t) 基因与抗稻瘟病基因紧密连锁或等位。涉 及 xa25(t) 基因 的研 究工作 已 发表 ( chen et al., XX, phytopathology 92:750-7546. 构建了水稻全生育期平衡化 cdna 文库利用水稻品种明恢63，构建了全生育期平衡化cdna 文库。该文库由水稻不同生长时期和不同生理状态下的 15 种不同组织的 cdna 组成，包括白叶枯病菌和稻瘟病菌接种诱导后

41、的组织。该文库包含大约 62,000 个克隆，平均插入片段为 1.4 kb ( chu et al., XX, chinese science bulletin48:229-235 )。对该文库中的大约 4万个 cdna 克隆进行了测序， 获得两万多个非重复est 序列。利用该文库我们建立了高效 cdna 芯片(包括cdna array 和 cdna microarray )分析体系。7. 发展了一种新的 est 聚类方法我们发展了一种新的计算机分析方法，用于分析大规模est 测序中所产生的大量数据，以获得高质量、非重复表达序列。该方法在聚类过程中采用 megablast 工具对一致序列进行序

42、列同源比较，并用 phrap 程序对每一est 簇进行拼接检验。这一聚类策略能降低测序错误带来的影响，有效识别基因家族成员， 并避免选择性剪接的干扰。 与 ncbi( nationalcenter for biotechnology information ) 的 unigene clustering 方法相比， estclustering 的聚类结果可以更好地反映表达序列的多样性。涉及这部分工作的论文已经发表（张利达等，XX,遗传学报30:147-153 ）。8. 克隆获得了一批水稻抗性基因同源序列利用植物 nbs lrr 类抗性基因的高度保守区设计 pcr引物从水稻基因组中扩增同源序列，经

43、克隆测序确定后获得了 23 个不同的 nbs 片段（称为抗性基因同源序列，简记为 rs ） 。将这些 rs 序列在窄叶青 / 京系 17 的重组自交系（ ril ）构建的分子图谱上定位，定位结果表明它们分布在1， 3， 4， 7， 8， 9， 10 和 11 染色体。其中 10 个 rs 位于已知 r 基因所在的染色体区间。这些 rs 标 记可以作为图位克隆同一位点上相应抗病基因的起点。有关结果已发表（ zheng et al ， XX,cience in china （series c）, 44（3）: 253-262） 。9构建了含xa4、 xa5 和 xa13 三个抗性基因的 irbb5

44、6基因组 bac 文库利用含 xa4、 xa5 和 xa13 三个水稻白叶枯病抗性基因的累加系 irbb56 构建了一个水稻细菌人工染色体文库。该文库包含 55296 个克隆，平均插入片段为 132 kb 。按水稻基因组为 450 mb 计，该文库覆盖14 倍基因组，筛选出任一水稻基因或序列的概率为 99.99 。用均匀分布的 3 个叶绿体基因和 4 个线粒体基因克隆作探针筛选文库，结果显示该文库中含细胞器基因组dna 同源序列的克隆数小于1 。用分布于水稻 3条不同染色体、 分别与 xa4、xa5 和 xa13 连锁的 dna标记筛选文库，分别检测出11-106 个阳性克隆，为克隆这些基因打下了基础。该文库对水稻基因组的高度覆盖率和较大的插入片段，非常适合于物理作图和基因的分离和克隆(王文明等，XX， 遗传学报 , 28(2) ： 120 128； wang et al.,XX, molecular genetics and genomics, 265: 118-125) 。本研究中建立