蛋白质多重标记

1、阅读研讨阅读研讨 分析化学专业：医学检验阅读文献阅读文献 Multiple Labeling of ProteinsDesign of 3-(4-Carboxybenzoyl)-2-quinolinecarboxaldehyde as a Reagent for Ultrasensitive Determination of Primary Amines by Capillary Electrophoresis Using Laser Fluorescence DetectionK inetics and apparent activation energy of the reaction o

2、f thefluorogenic reagent 5-furoylquinoline-3-carboxaldehyde withovalbumin目录contents 1 2 3 4 论文主题论文主题研究内容如何支持主题研究内容如何支持主题 层次和逻辑层次和逻辑 研究方法研究方法 5分析实验数据分析实验数据6存在不足存在不足论文论文主题主题 TOPICNO.1论文主题毛细电泳法测定的蛋白质往往都需要荧光标记,实验发现多重标记的荧光蛋白电泳谱带较天然蛋白的电泳谱带而言明显变宽。 NO.1论文主题本文通过观察比较区带电泳法测得天然绿色荧光蛋白和FQ标记的绿色荧光蛋白的谱带，证明多重荧光标记导致谱带

3、变宽并分析其原因。研究内容支持主题 NO.2研究内容如何支持主题?文中提出大多数标记蛋白无法区分结合在赖氨酸残基上N末端的胺和组胺，实验通过跟踪绿色荧光蛋白和FQ的反应，发现在10min反应下，标记分子和有多个标记物附着，即多重标记，导致谱带展宽。层次逻辑 NO.3层次层次& &逻辑逻辑开头开头- - 摘要：介绍了文章的基本内容摘要：介绍了文章的基本内容介绍了实验研究的背景知识介绍了实验研究的背景知识（如毛细管电泳，荧光标记以及它们可能出如毛细管电泳，荧光标记以及它们可能出现的误差）现的误差）引出论文的关键词和大概内容引出论文的关键词和大概内容叙述实验的过程与数据叙述实验的过程

4、与数据对数据进行分析和讨论对数据进行分析和讨论例举本文得到的肯定，增强文章的说服例举本文得到的肯定，增强文章的说服力力NO.3层次层次& &逻辑逻辑 文章脉络清晰，逻辑清楚。文章脉络清晰，逻辑清楚。 研究 方法NO.4研究方法 荧光标记通常用于提高毛细管电泳蛋白质分析的灵敏度。然而，与天然蛋白质的吸收检测法比较，柱前标签经常导致不良的电泳分辨率。普遍认为，这一峰展宽来自多个蛋白质标记。大多数标签反应依赖于攻击伯胺的试剂。这些试剂不能有效区分结合在赖氨酸残基上的N末端胺和其他区胺。标签通常可能会去完成一个产生复杂混合物的标记反应，使得蛋白质的构象变化，然后异构反应产物有不同的迁移

5、率，在电泳过程中蛋白质能带增宽。NO.4研究方法 为证明文章所述，通过控制变量来进行试验。NO.4研究方法 1、用5 mM硼酸盐和 3.7 * 10 -5 M溶解的GFP、1.5mm氰化钠加入100 nmol干FQ配成10微升，分别进行三组然后室温孵化1、5、10分钟。2、立即稀释4个数量级，以熄灭这个反应。3、在加上无处理GFP共四种溶液通过氩离子激光然后通过带有硼酸缓冲液未涂覆的毛细管的毛细管带电泳分析。4、进行分析图谱证明本文观点 分析实验数据NO.5分析实验数据运用FQ标记的蛋白，通过不同反应时间（分别为 1min，5min，10min ）的光谱图可知，1min时，分出五个峰，其他时间

6、峰聚集在一起，没有分析意义。在一分钟的光谱图中，还检测发现检测物流动性与标记物数量呈线性负相关。NO.5分析实验数据综上，得到两点结论 :一、物质敷浴的时间是导致峰变宽的一个因素，此次实验中一分钟时最佳敷浴时间。二、标记物的数量会影响蛋白质数量的检测，是导致峰带变宽又一因素 存在不足NO.6存在不足1、没有给出有效解决荧光标记蛋白的多重附着导致峰展宽的办法。2、用了单一的FQ染色而没有对其他标记物进行考虑和探究。 基本原理 迁移时间：迁移时间：HPCEHPCE具有电化学的特性和色谱分析的特性具有电化学的特性和色谱分析的特性有关色谱理论均适用有关色谱理论均适用EtLEdeoeoVLLtappdV

7、 V ：外加电压；：外加电压； L L：毛细管总长度；：毛细管总长度；appapp：表观淌度；：表观淌度； L Ld d：毛细管有效长度；：毛细管有效长度； 分离效率（理论塔板数分离效率（理论塔板数N N）在空心在空心HPCEHPCE中，仅存在中，仅存在纵向扩散纵向扩散DNapp2E评价峰展宽（柱效）评价峰展宽（柱效）衡量衡量CECE系统性能系统性能N N与与E E成正比，成正比，E E越大，柱效越高越大，柱效越高由于溶质在较高的电压下，以较快的速度通过柱子，由于溶质在较高的电压下，以较快的速度通过柱子，纵向扩散小（百万）纵向扩散小（百万）MM，D D ，NNHPCEHPCE适合于分离分析生物

8、大分子适合于分离分析生物大分子（扩散系数小）（扩散系数小） 电泳淌度电泳淌度ep （electrophoretic mobility，迁移率）：迁移率）： 单位电场下离子的电泳速度单位电场下离子的电泳速度EepeprEQep6rQEep6ep表述物质电泳特性的参数，与粒子表述物质电泳特性的参数，与粒子电荷、大小、介质粘度等有关电荷、大小、介质粘度等有关 分离度分离度影响分离度的主要因素；工作电压；毛细管影响分离度的主要因素；工作电压；毛细管有效长度与总长度比有效长度与总长度比L Ld d/L/L；表观淌度差。；表观淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：分离度可按谱图直接由下式计算：eoBAdB

9、ADLLR,E2411212)(2WWttR 反应条件 FQ: FQ用来做什么？检测蛋白质时大多需要衍生FQ是一种用于标记蛋白质的化学物质文献针对FQ对荧光蛋白（GFP）的标记进行研究 FQ如何标记GFP？ FQ 与氨基酸的反应实际是与伯胺的反应 一个蛋白质分子中存在伯胺基团有哪些？ 蛋白质中除N端伯胺外还存在大量赖氨酸残基 从而使标记反应可能发生 赖氨酸的-氨基 一个N端的伯胺 +20个赖氨酸残基对于GFP来说238个 氨基酸 FQ如何标记GFP？如果标记GFP中所有的伯胺基团？理论上可行而且如果能同时快速标记所有就不会存在展宽严重问题但实际这实际非常复杂在赖氨酸上百个的蛋白质中这种方法难度太大无法做到 只标记一个或几个伯胺基团？产物会非常多N个标记位点会产生2n-1种标记产物在电泳时 自然泳动速度