细胞凋亡及检测方法PPT课件

1、一、概述一、概述 细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis)：由体内外因素触发细胞内预存的死亡：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡（又称为程序性细胞程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡（又称为程序性细胞死亡）死亡） 1972年由年由Kerr等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。固定的变化形式的。“凋亡凋亡”一词来自希腊语，一词来自希腊语，apo意为意为“分分离离”，ptosis指花瓣或树叶的脱落，指花瓣或树叶的脱落，“凋亡凋亡”是由这两个词组是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡类似秋天花瓣或树叶的凋落一

2、样合而成，意指细胞凋亡类似秋天花瓣或树叶的凋落一样第1页/共93页研究简史研究简史 半个世纪前半个世纪前:人们就观察到生理自发退化死亡现象人们就观察到生理自发退化死亡现象. 1965年年:发育生物学家发育生物学家Lockshin和和Williams首先提出了首先提出了PCD（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程 1972年年:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念等首次提出了细胞凋亡的概念 1977年年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。胞发育过程中的凋亡现象。 1980年年:Wyl

3、lie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括核固缩和包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等降解成寡核苷酸片段等 1989年年: 0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中证明了信号传递物质对程中证明了信号传递物质对PCD的调控作用。的调控作用。 1991年年:Ellis首先发现了线虫首先发现了线虫(C.elegans)体内体内Ced-3、4两个基因与两个基因与PCD的发生密切相关，随后逐渐发现了多种的发生密切相关

4、，随后逐渐发现了多种参与参与PCD的正相调节基因和负相调节基因的正相调节基因和负相调节基因第2页/共93页19701975198019851990199520002005020004000600080001000012000Thirty years on apoptosispublications第3页/共93页细胞死亡的形式细胞死亡的形式 坏死坏死：活体组织细胞的死亡活体组织细胞的死亡 凋亡凋亡第4页/共93页细胞凋亡与坏死的比较细胞凋亡与坏死的比较坏死 凋亡 性质诱导因素生化特点形态变化DNA电泳炎症反应凋亡小体基因调控病理性、非特异性 强烈刺激，随机发生被动过程，无新蛋白合成细胞肿胀、细

5、胞结构全面溶解、破坏弥散性降解，电泳呈均一DNA片状 溶酶体破裂，局部炎症反应无无 生理性或病理性，特异性较弱刺激，非随机发生主动过程，有新蛋白合成胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩DNA片段化（180-200bp）电泳呈梯状条带溶酶体相对完整，局部无炎反应 有有第5页/共93页坏死第6页/共93页坏死炎细胞浸润第7页/共93页凋亡第8页/共93页第9页/共93页细胞凋亡的生理病理意义细胞凋亡的生理病理意义 确保正常发育、生长：清除多余的、失去确保正常发育、生长：清除多余的、失去功能价值的细胞（指趾间组织细胞）功能价值的细胞（指趾间组织细胞） 维持内环境稳定：清除受损突变细胞，自维持内环境稳

6、定：清除受损突变细胞，自身反应细胞，衰老细胞身反应细胞，衰老细胞 发挥积极的防御功能：病毒感染细胞凋亡，发挥积极的防御功能：病毒感染细胞凋亡，阻止病毒复制阻止病毒复制第10页/共93页二、细胞凋亡的过程二、细胞凋亡的过程 细胞凋亡的大致过程：细胞凋亡的大致过程： 凋亡信号转导凋亡信号转导 凋亡基因激活凋亡基因激活 细胞凋亡的执行细胞凋亡的执行 凋亡细胞的清除凋亡细胞的清除第11页/共93页凋亡的四个阶段：凋亡的四个阶段： 凋亡诱导因素+ 受体cAMPCa2+神经酰胺神经酰胺死亡信号凋亡基因激活DNase激活激活Caspase激活激活巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞第12页/共93页凋亡过程凋亡过程受体

7、cAMPCa2+神经酰胺神经酰胺凋亡相关基因激活信号转导细胞膜细胞膜细胞核细胞核凋亡诱导因素凋亡诱导因素+DNase激活激活Caspases激活激活死亡信号死亡信号第13页/共93页凋亡过程凋亡过程DNase激活Caspases激活凋亡细胞的凋亡细胞的清除清除凋亡执行凋亡执行第14页/共93页三、凋亡时细胞的主要变化三、凋亡时细胞的主要变化（一）细胞凋亡的形态学改变 细胞凋亡的特征是细胞首先变圆,随即与邻周细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,核染色质密度增高呈半月形,并凝聚在核膜周边,核仁裂解,进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜包裹、内涵物不外泄的凋亡小体，被

8、吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬,或自然脱落而离开生物。不引起炎症反应和次级损伤。第15页/共93页空泡化固缩出芽边集凋亡小体 形态学特征形态学特征第16页/共93页染色质边集染色质边集第17页/共93页第18页/共93页 嗜酸性小体嗜酸性小体( (凋亡凋亡) )嗜酸性变及嗜酸性小体嗜酸性变及嗜酸性小体肝细胞体积缩小，胞浆浓缩红肝细胞体积缩小，胞浆浓缩红染，呈嗜酸性变；或胞浆进一染，呈嗜酸性变；或胞浆进一步浓缩，细胞变圆，核碎裂，步浓缩，细胞变圆，核碎裂，呈嗜酸性小体状呈嗜酸性小体状第19页/共93页（二）细胞凋亡的生化改（二）细胞凋亡的生化改变变1. DNA片段化：形成片段化：形成180-20

9、0bp或整数倍的或整数倍的片段，在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的片段，在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的“梯状梯状”条带，是判断凋亡发生的客观指条带，是判断凋亡发生的客观指标之一。标之一。第20页/共93页凋亡后凋亡后DNA Ladder的的 agarose 电泳检测电泳检测第21页/共93页2. 内源性核酸内切酶激活及其作用：内源性内源性核酸内切酶激活及其作用：内源性核酸内切酶在核小体连接部切断核酸内切酶在核小体连接部切断DNA双链。双链。 凋亡诱导因素细胞内信号转导 无活性内源性核酸内切酶 活性内源性核酸内切酶核小体连接部切断DNA双链电泳呈特征性的“梯状”条带Ca+Mg+激活Zn+抑制第22页

10、/共93页3. Caspase的激活及其作的激活及其作用用Caspase（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶）：（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶）：一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用、其活一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用、其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶，又称死亡蛋白酶性中心富含半胱氨酸的蛋白酶，又称死亡蛋白酶主要作用：主要作用： 灭活细胞凋亡抑制物（灭活细胞凋亡抑制物（Bcl-2） 水解蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡水解蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡小体小体 水解级联反应相关活性蛋白，使之获得或丧水解级联反应相关活性蛋白，使之获得或丧失某种生物学功能失某种生物学功能 第23页/共93

11、页Caspase的作用的作用第24页/共93页目前被鉴定的哺乳动物目前被鉴定的哺乳动物Caspase第25页/共93页Caspase 的特点1.含有高度保守的QACXG(X为R、Q或G）五肽序列；2. 以半胱氨酸作为裂解底物的亲核基团；3. 以天门冬氨酸为特异性底物（羧基端肽键断裂）；4. 通常以无活性的酶原形式存在，须通过水解其氨基端一段序列激活；5. 活化后水解底物，通过级联放大诱发凋亡；6. 抑制剂，防止caspase酶原被偶然激活而对正常细胞造成伤害；第26页/共93页3.Caspase触发凋亡途径 细胞外途径：细胞表面死亡受体途径 细胞内途径：线粒体引发途径 内质网介导的凋亡通路第2

12、7页/共93页细胞外途径 细胞死亡信号蛋白结合细胞表面相应受体，死亡受体与配体结合，导致死亡结构域聚集，使死亡受体分子活化； Caspase-8活化：Caspase酶原在局部聚集，FADD与procaspase-8的DED结合形成信号复合物， procaspase-8水解活化形成有活性的caspase-8； 细胞凋亡： 激活的caspase-8激活下游的caspase引起细胞凋亡第28页/共93页细胞内途径 是哺乳动物细胞程序性死亡的主要途径； 过程：凋亡刺激死亡促进因子，包括细胞色素C、凋亡诱导因子、促死亡蛋白、Caspase酶原释放Caspase活化细胞凋亡第29页/共93页内质网介导的凋

13、亡通路 内质网钙离子内环境紊乱及过量内质网蛋白积累激活Caspase-12； 同时胞质中的Caspase-7移入内质网，进一步激活 Caspase-12； 激活的Caspase-12可进一步剪切Caspase-3，细胞凋亡第30页/共93页第31页/共93页第32页/共93页（三）细胞凋亡的调控（三）细胞凋亡的调控1. 细胞凋亡的相关因素细胞凋亡的相关因素（1） 诱导性因素诱导性因素激素和生长因子失衡：缺乏（激素和生长因子失衡：缺乏（IL-2，淋巴细胞凋亡），淋巴细胞凋亡）或过多（糖皮质激素或过多（糖皮质激素，淋巴细胞凋亡），淋巴细胞凋亡） 理化因素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药理化因

14、素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等物等 免疫性因素：如，免疫性因素：如，CTL分泌粒酶分泌粒酶靶细胞凋亡靶细胞凋亡微生物因素：细菌、病毒及毒素。（微生物因素：细菌、病毒及毒素。（HIV） 第33页/共93页（2 2）抑制性因素）抑制性因素 细胞因子：细胞因子：IL-2、神经营养因子、神经营养因子 激素：激素：ACTH、睾丸酮、雌激素等、睾丸酮、雌激素等 二价金属阳离子：二价金属阳离子：Zn2+ 药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性氨基酸制剂、中性氨基酸 病毒：病毒：EB病毒、牛痘病毒病毒、牛痘病毒CrmA第34页/共93页2. 细胞凋亡信号转细胞

15、凋亡信号转导导 凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片片段化及细胞结构蛋白降解的中间环节。段化及细胞结构蛋白降解的中间环节。凋亡信号转导系统的特点：凋亡信号转导系统的特点：多样性：不同种类细胞有不同系统多样性：不同种类细胞有不同系统耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节耦联，耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节耦联，同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信

16、号转导系统第35页/共93页研究较多的系统：依据：细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升用Ca2+载体A23187人为升高B淋巴细胞Ca2+水平，B淋巴细胞凋亡用Ca2+络合剂降低胞内Ca2+水平，阻止细胞凋亡 激活Ca2+依赖谷氨酰胺转移酶Ca2+ 活化核转录因子1胞内Ca2+信号系统（Ca2+为第二信使）第36页/共93页2cAMP/PKA信号系统（cAMP为第二信使）依据：双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡糖皮质激素使cAMP上升cAMP激活PKA使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝AA）残基磷酸化改变蛋白质功能第37页/共93页3Fas蛋白/Fas配体信号系统Fas蛋白：细胞

17、膜跨膜蛋白Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）细胞凋亡机制：Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）神经鞘磷脂酶活性产生神经酰胺蛋白激酶激活细胞凋亡Fas蛋白+抗Fas、TNF 激活ICE样caspase 降解H1组蛋白染色体松驰DNA暴露内切酶位点通过Ca2+信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡第38页/共93页4神经酰胺信号系统神经酰胺：神经鞘磷脂（SM）在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质。介导细胞凋亡的依据：用天然神经酰胺处理u937白血病细胞，诱导细胞凋亡神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、TNF-、Fas抗原、糖皮质激素 第39页/共93页5二酰甘油/蛋白激酶C（PKC）信号系统二酰甘

18、油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催化下产生的一种第二信使物质。依据：活化的PKC1可诱导u937白血病细胞凋亡抑制PKC活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡PKC激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡（糖皮质激素、T细胞受体激活、IL-2撤除）第40页/共93页6酪氨酸蛋白激酶系统生长因子或细胞因子激活酪氨酸蛋白激酶靶蛋白酪氨酸磷酸化Ras蛋白激活通过Raf-1、MAPKK、MAPK蛋白质磷酸化细胞分化生长因子或细胞因子撤除不能激活酪氨酸蛋白激酶系统细胞凋亡第41页/共93页3. 3. 凋亡相关基因凋亡相关基因抑制凋亡基因：抑制凋亡基因：Bcl-2促进凋亡基因：促进凋亡基因：P53、Ba

19、x、ICE双向调节基因：双向调节基因：c-myc、Bclx第42页/共93页(B细胞淋巴瘤/白血病-2B cell lymphoma / leukemia-2基因的缩写) Bcl-2蛋白：229个氨基酸（人）、236个氨基酸（小鼠）分布：线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜作用：Bcl-2高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡依据：导入Bcl-2基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱导的凋亡淋巴细胞有20%呈Bcl-2阳性时，预后不佳（耐受放射线、抗癌药物）（1）Bcl-2第43页/共93页 直接的抗氧化作用 抑制线粒体释放促凋亡蛋白质（细胞色素C、AIF） 抑制促凋亡调节蛋白Ba

20、x、Bak的细胞毒作用 抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活 维持细胞钙稳态Bcl-2抗凋亡作用机制：抗凋亡作用机制：第44页/共93页作用：野生型（wtP53）：DNA结合蛋白，诱导细胞凋亡（“分子警察”）突变型（mtP53） ：抑制细胞凋亡野生型P53的作用机制：P53蛋白细胞周期G1期检查染色体DNA损伤（检查点功能）发现DNA损伤剌激CIP的表达阻止细胞进入下一周期，启动DNA修复机制修复失败启动细胞凋亡机制细胞凋亡（2）P53第45页/共93页c-myc: 一种癌基因，它能诱导增殖，也能诱导细胞凋亡，具有双向调节作用。作用机制：c-myc蛋白为重要的转录调节因子，既可介导细胞增殖

21、，也可激活介导细胞凋亡，其作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境（有生长因子增殖，无生长因子凋亡）。Bcl-x：能翻译Bcl-XL和Bcl-Xs两种蛋白，Bcl-XL蛋白抑制细胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促进细胞凋亡（3）c-myc, Bcl-x第46页/共93页三、三、 细胞凋亡的发生机制细胞凋亡的发生机制1、氧化损伤、氧化损伤氧化损伤的后果之一：细胞凋亡氧化损伤的后果之一：细胞凋亡依据：依据：各种氧化剂（各种氧化剂（H2O2）可直接诱导细胞凋亡）可直接诱导细胞凋亡抑制超氧化物歧化酶（抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可诱导细胞凋亡）活性可诱导细胞凋亡抗氧化剂（抗氧化剂（VitE、胡萝卜素等）

22、可阻断有氧化应激、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素（背景的各种凋亡诱导因素（TNF-、电离辐射）引起、电离辐射）引起的细胞凋亡的细胞凋亡第47页/共93页引起DNA损伤，激活P53基因引起DNA损伤，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭辅酶(NAD)，消耗大量ATP攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或产生过氧羟基24碳四烯酸激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶细胞膜损伤，Ca2+内流增多及损伤线粒体，通透性增加膜电位改变活化核转录因子NF-B、AP-1，加速凋亡相关基因表达氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：第48页/共93页2.钙稳态失衡细

23、胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一依据：各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升，并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经退行性疾病）第49页/共93页激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切

24、割DNA钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：第50页/共93页3、线粒体损伤线粒体的改变：线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨膜电位（m）下降，能量代谢水平显著降低线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用依据：抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡在细胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体内膜跨膜电位（m）下降阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡（Bcl-2）第51页/共93页四、四、 细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡不足（一）细胞凋亡不足1. 肿瘤肿瘤 发生机制：细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径，凋发生机制：细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径，凋亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途

25、径，结果导致亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径，结果导致病变组织内肿瘤细胞存活延长，存活大于死亡，肿瘤细胞病变组织内肿瘤细胞存活延长，存活大于死亡，肿瘤细胞数目净增长加大，形成新生物。数目净增长加大，形成新生物。凋亡受抑的依据：凋亡受抑的依据：多种肿瘤组织中多种肿瘤组织中Bcl-2表达显著高于周围组织表达显著高于周围组织许多肿瘤许多肿瘤P53发生突变，突变型发生突变，突变型P53抑制细胞凋亡抑制细胞凋亡第52页/共93页发生机制：从细胞凋亡角度看，自身免疫病发生机制：从细胞凋亡角度看，自身免疫病的发病是由于细胞凋亡不足，未能有效清除的发病是由于细胞凋亡不足，未能有效清除自身免疫性自身免疫

26、性T细胞所致。细胞所致。依据：糖皮质激素能诱导淋巴细胞凋亡，为依据：糖皮质激素能诱导淋巴细胞凋亡，为治疗自身免疫病的有效药物之一。治疗自身免疫病的有效药物之一。2.2.自身免疫病自身免疫病第53页/共93页（二）细胞凋亡过度（二）细胞凋亡过度1.1.心血管疾病心血管疾病（1 1）心肌缺血与心肌缺血）心肌缺血与心肌缺血- -再灌注损伤再灌注损伤 心肌缺血与心肌缺血心肌缺血与心肌缺血- -再灌注损伤造成的心肌细胞再灌注损伤造成的心肌细胞损伤不但有坏死，也有细胞凋亡（干预靶点）。损伤不但有坏死，也有细胞凋亡（干预靶点）。特点：特点：缺血早期以细胞凋亡为主，晚期以细胞坏死为主缺血早期以细胞凋亡为主，晚

27、期以细胞坏死为主梗死灶中央通常以坏死为主，周边以细胞凋亡为主梗死灶中央通常以坏死为主，周边以细胞凋亡为主轻度缺血以细胞凋亡为主，重度缺血通常以坏死为主轻度缺血以细胞凋亡为主，重度缺血通常以坏死为主第54页/共93页急性、严重的心肌缺血以坏死为主，慢性、轻急性、严重的心肌缺血以坏死为主，慢性、轻度的心肌缺血以细胞凋亡为主度的心肌缺血以细胞凋亡为主细胞凋亡的机制：细胞凋亡的机制：氧化应激有关（氧化应激有关（SOD可减少细胞凋亡）可减少细胞凋亡）Fas上调通过与上调通过与FasL反应导致细胞凋亡反应导致细胞凋亡与与P53基因激活有关（缺氧可增加基因激活有关（缺氧可增加P53基因的基因的转录）转录）第

28、55页/共93页 心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少可能是心心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少可能是心力衰竭发生发展的原因之一。力衰竭发生发展的原因之一。在压力负荷过重引起的心力衰竭动物模型上观察到在压力负荷过重引起的心力衰竭动物模型上观察到左室心肌肥大的同时，心肌细胞数量减少，经分析是左室心肌肥大的同时，心肌细胞数量减少，经分析是由细胞凋亡造成由细胞凋亡造成心衰病人心肌标本，心肌凋亡指数高达心衰病人心肌标本，心肌凋亡指数高达35.5%，对，对照组为照组为0.2-0.4%诱因：氧化应激、压力或容量负荷过重、神经诱因：氧化应激、压力或容量负荷过重、神经-内分内分泌失调、细胞因子、缺血缺氧。泌失调、细

29、胞因子、缺血缺氧。（2 2）心力衰竭）心力衰竭第56页/共93页 在神经系统疾病中有一类以特定神经元进行性在神经系统疾病中有一类以特定神经元进行性丧失为其病理特征的疾病：阿尔茨海默氏病（丧失为其病理特征的疾病：阿尔茨海默氏病（AD），），帕金森氏病，多发性硬化症帕金森氏病，多发性硬化症举例：阿尔茨海默氏病（举例：阿尔茨海默氏病（AD）与细胞凋亡的关系：）与细胞凋亡的关系：AD患者的尸检发现，海马及基底神经核的胆碱能神患者的尸检发现，海马及基底神经核的胆碱能神经元丧失达经元丧失达30-50%，有时高达，有时高达90%，大脑皮质也有，大脑皮质也有不同程度的神经元丧失，大脑皮质出现广泛萎缩，脑不同程

30、度的神经元丧失，大脑皮质出现广泛萎缩，脑沟变宽，脑回变窄，脑室扩大。沟变宽，脑回变窄，脑室扩大。2. 2. 神经元退行性疾病神经元退行性疾病第57页/共93页诱因：-淀粉样蛋白、钙超载、氧化应激、神经生长因子分泌不足可能机制：致病因素（如：氧自由基）神经元Ca2+内流-淀粉样蛋白合成相关基因激活-淀粉样蛋白神经细胞凋亡第58页/共93页发病机制：发病机制：HIV感染感染CD4+淋巴细胞淋巴细胞CD4+淋巴淋巴细胞显著细胞显著免疫功能缺陷免疫功能缺陷细胞凋亡相关因素：细胞凋亡相关因素：gp120糖蛋白：糖蛋白：gp120糖蛋白糖蛋白+受体受体细胞凋亡细胞凋亡合胞体形成：合胞体形成：HIV感染感染

31、合胞体形成合胞体形成细胞凋亡细胞凋亡Fas基因表达上调：基因表达上调：HIV感染感染Fas基因表达上调基因表达上调Fas+ FasL细胞凋亡细胞凋亡3. 病毒感染病毒感染_获得性人类免疫缺陷病（获得性人类免疫缺陷病（AIDS）第59页/共93页T细胞激活：细胞激活：HIV感染感染CD4+细胞激活细胞激活生长生长因子缺乏因子缺乏细胞凋亡细胞凋亡细胞因子：细胞因子：HIV感染感染TNFTNF + TNFR-1细胞凋亡细胞凋亡tat蛋白：蛋白：HIV感染感染产生产生tat蛋白蛋白CD4+淋巴细淋巴细胞胞诱导产生氧自由基和诱导产生氧自由基和Fas基因表达上调基因表达上调Fas+ FasL细胞凋亡细胞凋

32、亡HIV慢性感染慢性感染CD4+（HIV-）淋巴细胞攻击）淋巴细胞攻击CD4+（HIV+）淋巴细胞）淋巴细胞细胞凋亡细胞凋亡第60页/共93页动脉粥样硬化：内皮凋亡过度，平滑肌细胞凋亡不足动脉粥样硬化：内皮凋亡过度，平滑肌细胞凋亡不足依据：依据：内皮细胞凋亡过度：内皮细胞凋亡过度：LDL升高、血小板激活、升高、血小板激活、Ag、高血压可引起内皮细、高血压可引起内皮细胞凋亡胞凋亡检测粥样硬化的冠状动脉，病变部位内皮细胞凋亡达检测粥样硬化的冠状动脉，病变部位内皮细胞凋亡达34%，远高于对照，远高于对照8%平滑肌细胞凋亡不足：平滑肌细胞凋亡增多，但仅为增平滑肌细胞凋亡不足：平滑肌细胞凋亡增多，但仅为

33、增殖细胞的殖细胞的75%，细胞凋亡相对不足。，细胞凋亡相对不足。（三）细胞凋亡不足与过度并存（三）细胞凋亡不足与过度并存第61页/共93页五、细胞凋亡检测五、细胞凋亡检测 形态学观察方法 DNA凝胶电泳 酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 流式细胞仪定量分析 Western blot检测第62页/共93页（一）形态学观察方法（一）形态学观察方法 1.HE染色：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象第63页/共93页第64页/共93页2.丫啶橙（丫啶橙（AO) 染色染色AO透过胞膜完整的细胞，崁入细胞核DNA，发绿色荧光；活细胞核呈绿色荧光；凋亡细胞染色增

34、强，核染色质呈黄绿色或橘红色，浓聚在核膜内侧（核固缩），可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体；坏死细胞：核染色质橘红色第65页/共93页第66页/共93页3. 台盼蓝染色台盼蓝染色如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死细胞。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞；区分坏死细胞第67页/共93页4. 透射电镜观察透射电镜观察可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体及凋亡小体被临近吞噬细胞吞噬现象。第68页/共93页第69页/共93页（二）（二）DNA凝胶电泳凝胶电泳 检测原理：细

35、胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180200bpDNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 第70页/共93页结果判断结果判断 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。 第71页/共93页（三）酶联免疫吸附法（三）酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断

36、组成，可由ELISA法检测。 第72页/共93页检测步骤检测步骤 将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 在微定量板上吸附组蛋白体； 加上清液使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合； 加辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合； 加酶的底物，测光吸收值。 第73页/共93页特点特点 该法敏感性高； 应用广泛； 操作简单； 不能精确定量第74页/共93页（四）流式细胞仪定量分析（四）流式细胞仪定量分析 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常

37、细胞、坏死细胞和凋亡细胞。 第75页/共93页1. PI单染色法单染色法第76页/共93页第77页/共93页2. TUNEL 法法 即原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique, ISEL)； 原理：利用TdT（末端DNA转移酶）将标记的dUPT连接到3-OH端形成新的DNA； 特点：敏感度高，操作简单，应用广泛； 也可以进行形态学观察 第78页/共93页第79页/共93页3. PI-Annexin V双标法双标法 原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测； 磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS具有高度的结合力； 将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞染色。第80页/共93页第81页/共93页结果判断结果判断 正常活细胞Annexin V 、PI均低染； 凋亡细胞Anne