细胞培养---原代培养---传代培养PPT课件

1、Experiment of Cell EngineeringExperiment of Cell Engineering玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗刷洗浸泡浸酸冲洗第1页/共70页 玻璃器皿的清洗 1 主要包含有： 培养瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，离心管，试管，培养皿等。 第2页/共70页2 清洗步骤： 泡在含有洗洁净的自来水中捞出来用毛刷将实验器具各个面刷洗至少25遍自来水冲洗25遍过一遍一蒸水烘干泡入铬酸过夜 从铬酸中捞出器具，自来水冲洗25遍过三遍一蒸水，三遍三蒸水烘箱内烘干收入柜子备用用前高温灭菌（121，25min） 烘干使用 注意：1、新的玻璃器具先要泡过夜，然后清洗步骤与上面相同

2、。2、移液管用含洗洁精的自来水超声3次，每次半小时。第3页/共70页清洗标准： 玻璃透亮，内外壁水膜均匀、无油迹，无任何残留物质。第4页/共70页 塑料、橡胶类器皿的清洗 1 塑料类器皿主要包括： 孔板、大枪头、瓶盖、滤器、超声管、注射器等。 2 橡胶类器皿主要包括： 乳胶头、橡胶头、胶塞、胶垫等。 第5页/共70页2 清洗步骤： 泡在有洗洁净的自来水中用毛刷或者纱布将各个面刷洗至少25遍自来水冲洗25次以上过一遍一蒸水泡入盐酸过夜从酸中捞出后自来水冲洗25遍过三遍一蒸水，三遍三蒸水烘箱内烘干收入柜子用前高温灭菌（121， 20min） 烘干使用 注意: 乳胶类器材由于常有滑石粉类成分，故应先

3、用流水充分清洗。 第6页/共70页第7页/共70页细胞培养定义u定义： 模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。u优点：1活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控；3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；u缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 第8页/共70页

4、细胞培养的基本概念 传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 第9页/共70页接触抑制接触抑制（Contact inhibition） 细胞相互接触时，将停止增长； 细胞停留在细胞周期的G0期； 转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。第10页/共70页 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“ Hayflick极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20

5、-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。 细胞传代次数细胞传代次数（Passage Number）第11页/共70页 原代培养 （primary culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 细胞系（cell line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖 细胞株（cell strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左

6、右，在培养过程中其特征始终保持。 原代培养与细胞系原代培养与细胞系第12页/共70页原代培养细胞的生命归宿 原代培养期 传代期 衰退期第13页/共70页第14页/共70页 The American Type Culture Collection (ATCC) The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) National Institute of Health (NIH), USA National Cancer Institute (NCI), USA细胞系资源细胞系资源第15页/共70页 有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cel

7、l line 细胞株 cell strain 第16页/共70页培养细胞的特性 培养细胞的生长方式 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞第17页/共70页 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）第18页/共70页 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时第19页/共70页 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等

8、血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）第20页/共70页第21页/共70页第22页/共70页 潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为624小时。第23页/共70页 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。第24页/共70页 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性第25页/共70页第26页/共70页二、细胞培养基本要二、细胞培养基本要

9、求求 常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂第27页/共70页培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒第28页/共70页常用仪器设备常用仪器设备 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管第29页/共70页 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）

10、。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 第30页/共70页 超净台 n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 第31页/共70页滤 器第32页/共70页第33页/共70页 CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：n 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松

11、，以保证通气。n 保持培养箱内空气干净。定期消毒n（90 ，14 h)。n箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。第34页/共70页第35页/共70页自动双重纯水蒸馏器 纯水仪第36页/共70页酶标仪 微孔板震荡器第37页/共70页培养器皿培养器皿第38页/共70页 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干n常用玻璃器皿清洗第39页/共70页 清洁液的配制第40页/共70页第41页/共70页培养基的选择培养基的选择没有一定的标准，有几点建议可供参考： 1.建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查

12、阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 2.其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 3.用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 第42页/共70页血清使用注意事项血清使用注意事项1.血清必须贮存于20 -70，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2.血清解冻步骤(逐步解冻法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室温下

13、全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。3.热灭活（heat-inactivation）是指56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。4.勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质第43页/共70页 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之

14、脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此“微生物“，但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细

15、胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。 血清沉淀物血清沉淀物 第44页/共70页如何避免沉淀物的产生? 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20至37)，实验显示非常容易产生沉淀物。 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。 请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。 若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高

16、，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。第45页/共70页谷氨酰胺谷氨酰胺 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，44下放置7 7天即可分解约50%50%，所以都是在使用前添加 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在44放置2 2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内 使用终浓度为1-4mM1-4mM 一般配制为100100倍浓缩液，即浓度为200mM200mM（29.22g/L29.22g/L） 配制方法为 ：谷氨酰胺2.922g2.922g溶于三蒸水加至100ml100ml即配成200mM20

17、0mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温3030），过滤除菌，分装小瓶，-20-20保存，使用时可向100ml100ml培养液中加入0.5-2ml0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM 1-4mM 第46页/共70页第47页/共70页水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 细胞培养用液的配制第48页/共70页 抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。

18、培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定第49页/共70页完全培养基的组成 基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100单位毫升第50页/共70页培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10） 第51页/共70页第52页/共70页三、细胞培养基本技三、细胞培养基本技术术 细胞原代培养 细胞换液与传代 细胞冻存与复苏第53页/共70页第54页/共70页第55页/共

19、70页换液：全量换液和半量换液换液时机的选择：培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。细胞状态细胞换液细胞换液第56页/共70页第57页/共70页细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代 采用酶消化

20、法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。第58页/共70页贴壁生长细胞传代方法： 1. 吸光培养瓶中的培养液 2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 6. 将后者放入培养箱中培养。第59页/共70页细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。第60页/共70页冻存和复苏的原则：慢

21、冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。第61页/共70页第62页/共70页低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。第63页/共70页

22、细胞冻存方法 1预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml) 3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 4 年后，存活率可达80一90。 DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。第64页/共70页第65页/共70页收到细胞的处理方式 ( (一) ) 1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于70 C， 隔夜后， 移到液氮)。 2. 冷冻细胞解冻程序: 2.1.

23、 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。 第66页/共70页 2.3. 将培养基置于37 C 水槽中回温， 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无菌操作台

24、内。取出冷冻管， 立即放入37 C 水槽中快速解冻， 水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。 2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基， 混合均匀，放入37 C，5 % CO2 培养箱培养。 2.5. 对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除， 待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO 者， 则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶中， 再放入37 C， 5 % CO2 培养箱培养。第67页/共70页收到细胞的处理方式 ( (二) ) 收到T25 flask T25 flask