山药毕业设计

1、 毕 业 设 计（论文）题 目：蕲山药多糖的纯化及 化学结构分析 学 院专 业学 号学生姓名指导教师 2011 年 4 月 20 日学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 年 月 日 学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保障、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关学位论文管理部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权省级优秀学士学位论文评选机构将本学位论文

2、的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密 ，在_年解密后适用本授权书。2、不保密 。（请在以上相应方框内打“”）作者签名： 年 月 日 导师签名： 年 月 日 摘要目录1.前言1.1山药研究概况1.1.1山药功能研究现状1.1.2山药化学成分研究现状1.2山药多糖提取、分离纯化及结构鉴定研究进展1.2.1山药多糖的提取、纯化1.2.2山药多糖的分离、结构测定1.3论文研究意义和主要研究内容1.3.1选题依据及研究意义1.3.2论文的特色和创新之处1.3.3研究的主要内容2.蕲山药多糖的提取工艺研究2.1实验材料2.1

3、.1材料2.1.2仪器2.1.3试剂2.2实验方法2.2.1多糖提取方法2.2.2正交实验的设计2.2.3多糖供试品液的制备2.2.4标准曲线制作及总多糖含量测定2.3实验结果及讨论2.3.1提取条件的正交实验优化结果2.3.2 实验小结3.蕲山药多糖的分离纯化工艺研究3.1实验材料3.1.1材料3.1.2仪器3.1.3试剂3.2实验方法3.2.1重结晶纯化法3.2.2Sevage法3.2.3多糖脱色3.2.4小分子物质的去除3.3实验结果与讨论3.3.1纯化条件的实验最佳结果3.3.2 实验小结4.山药多糖的成分及其化学结构分析4.1实验材料4.1.1材料4.1.2仪器4.1.3试剂4.2实

4、验方法4.2.1山药多糖的IR光谱分析4.2.2山药多糖的气象色谱分析4.3 结果与讨论4.3.1山药多糖的红外光谱4.3.2山药多糖的气象色谱4.3.3实验小结5.结论与展望5.1全文总结5.2存在问题5.3展望致谢参考文献附录1.前言1.1山药研究概况山药是传统药食同源食物，为薯蓣科植物薯蓣（Dioscorea opposita Thunb）的地下块茎。山药既是一味重要中药，又是一种常见蔬菜，因其卓越的药用保健功效和糯香可口的风味品质而深得世人的喜爱。山药性温味甘，温补而不骤，微香而不燥，不仅是健脾补气的良药，也是传统的保健食品。我国栽培山药历史悠久，我国栽培山药历史悠久，自夏、商起就开始

5、种植，明清以来逐渐形成道地药材。目前河南、鄂东南等地区已经建立了多处规范化种植园区，山药生产正朝着现代化、规模化的方向发展。山药的功能及有效成分等研究引起医药及食品行业科研人员的高度关注，有关研究综述如下。1.1.1山药功能研究现状1、降血糖作用黄绍华等报道，山药多糖可通过抑制-淀粉酶从而阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少糖分的摄取，降低血糖和血脂含量水平值。胡国强等研究证明山药多糖对四氧嘧啶模型糖尿病大鼠的血糖有明显降低作用，且同时能升高C肽含量，证明山药多糖对糖尿病的治疗作用与增加胰岛素分泌、改善受损的胰岛口细胞功能有关。2、山药抗衰老作用詹彤等研究了山药多糖对D-半乳糖O12mgg所

6、致小鼠代谢性衰老模型的各项指标的研究中发现山药多糖具有良好的抗衰老作用。 另外有研究表明以给20山药或熟地、菊花、山药、牛膝四药合剂水煎剂浸泡并阴干的新鲜桑叶喂饲家蚕，结果表明4药合剂能显著延长家蚕寿命，而单味山药虽能延长家蚕龄期，但效果不显著。3、调节免疫作用Guohua Zhao研究证明山药多糖可以促进伴刀豆凝集素A造成的胸腺依赖性淋巴细胞增殖，多糖在O-6部位的甘露糖残基对免疫活性表达非常重要。赵国华以荷瘤小鼠为实验模型，证明山药多糖RDPS-I可显著增强荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性、小鼠脾脏细胞产生L-2的能力及腹腔巨噬细胞产生TNF-的能力。4、体外抗氧化活性何书英等报道

7、，山药水溶性多糖能降低维生素C-NADPH及Fe2+-半胱胺酸诱发的微粒体过氧化脂质的含量，并对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧自由基及Fenton反应体系产生的羟自由基有清除作用。此外山药多糖还具有抗肿瘤作用、降血脂、抗氧化和抗突变等多方面功能。1.1.2山药化学成分研究现状1、山药基本成分现代药理学研究表明：山药具有多种人体所需要的营养成分,发展前景十分广阔,不仅是一味常用的不可缺少的药品,也日益成为一种强身健体、延年益寿的保健品。山药含淀粉约16%，还含有粘液质、糖蛋白、胆碱、多酚氧化酚、维生素C、甘露聚糖和植酸、3，4基苯乙胺、多巴胺、山药碱、皂甙、赖氨酸及精氨酸等多种氨基酸、蛋白质

8、、淀粉酶、尿囊素、铁及锰等多种微量元素等。2、山药的活性成分国内外对山药功能性成份的报道很多，目前研究的最多的山药中最主要药用成分为山药多糖，其含量约为2.152.92，据报道多糖可分为酸性多糖与中性多糖两类，由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，国外有报道称山药多糖中还含有一定量的甘露聚糖。姜军等通过DEAE-52，Sephadex G-100分离纯化山药多糖，获得1种中性多糖及2种酸性多糖。并通过GC-MS确定中性糖由葡萄糖和甘露糖组成，酸性多糖1是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖组成。酸性糖2是由阿拉伯糖、木糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖组成。此外还有一些研究学者对山药中的皂苷、尿囊素、氨基

9、酸以及醇提物的研究也有一定的报道。1.2山药多糖提取、分离纯化及结构鉴定研究进展1.2.1山药多糖的提取、纯化孟庆华等研究了水浸提法提取怀山药多糖、三氯乙酸法除蛋白及乙醇分离多糖的纯化条件，正交实验结果表明，浸提最佳工艺条件为浸提温度100，加水量 1:30，浸提时间2h，浸提2次，加入浓缩液7.5体积的3三氯乙酸溶液除去蛋白质的效果最好，再向浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇溶液可以较好地分离怀山药多糖。1.2.2山药多糖的分离、结构测定乔善义等以水煮醇沉法提取山药多糖，将醇沉部分用水溶解，水溶液用1CTAB溶液沉淀，上清液以乙醇沉淀，所得沉淀经冷冻干燥得到中性多糖部分SUP；CTAB沉淀用4m

10、olL NaCL溶解，适当浓缩后用95乙醇沉淀，沉淀经冷冻干燥得到酸性多糖部位PPT。SUP经Sephadex-G100凝胶层析得纯化多糖S1和S2。全水解产物的分析表明，它们的糖组成均为葡萄糖。HPLC分析显示它们为均一多糖，分子量分别为63000和7400。通过IR、CNMR分析最终确定S1和S2都是a-D-GIc（14）n型葡聚糖。赵国华等将山药水提液脱蛋白、透析、乙醇沉淀物经DEAE-52纤维素及Sephadex G-100色谱纯化得白色粉末状多糖RDPS-1。凝胶色谱分析表明RDPS-1为多糖纯品，定性化学反应表明RDPS-1不含核酸、蛋白质、酚类物质和糖醛酸，是一种非淀粉类中性纯粹

11、多糖，相对分子质量为42200，完全酸水解后纸层析及气相色谱分析确定RDPS-1的糖基组成为葡萄糖、甘露糖和半乳糖，摩尔比为1：0.37：0.11。顾林等对水溶中性多糖的水解产物进行薄层层析,初步认为山药水溶性中性多糖可能由葡萄糖、甘露糖、果三种单糖组成。经过GC-MS精确分析，发现山药水溶中性多糖的单糖的组成为葡萄糖和甘露糖，摩尔比为0.56: 0.44。红外光谱分析实验中，也发现存在甘露糖苷，D-葡萄糖等，进一步验证了多糖的组成。 1.3论文研究意义和主要研究内容1.3.1选题依据及研究意义山药既是一种重要中药，又是一种常见蔬菜，因其卓越的药用保健功效和糯香可口的风味品质而深得世人的喜爱。

12、李时珍在本草纲目中将其功用概括为“益肾气，健脾胃，止泄痢，化痰涎，润皮毛”5个主要方面，其水煎剂有延缓衰老、防治糖尿病、降血糖及抗肝昏迷等作用。近些年，随着生活水平的不断提高，人们的健康保健意识在逐渐增强。多糖作为保健食品的主要成分己悄然兴起。山药中多糖是已经公认的山药主要功能因子之一，山药多糖具有的广泛生物活性已逐渐被人们认知，其独特活性和来源的天然性在保障人体健康应用中具有很大潜力。而且山药产量很高，又含有丰富的碳水化合物和蛋白质，营养成分全面，以干品计算较之谷物也毫不逊色，因而又是国际性的重要粮食作物。进行山药深层次的加工技术的研究、开发高附加值山药新产品显得尤为必要和紧迫。山药自古以来

13、就是药食同源的保键食品，而多糖是山药的主要功能成分，多糖及其衍生物因其特殊的功能键能抗炎、抗凝血、抗辐射、降血脂，作为生物效应调节剂而成为近年来天然药物的研究热点之一。论文研究对于提高加工企业生产山药利润，促进农民增收，推动农业可持续发展具有重要的意义。同时论文研究借助于先进的仪器分析方法，研究多糖的高级结构，对于进一步明确多糖的生物学功能、指导医药新品药理研究均具有重要的意义。但几乎所有有关山药多糖的讲究都是关于其他山药的，迄今未见蕲山药多糖研究的报告。本实验拟在淮山药多糖研究较成熟的基础上，采用地方特色的蕲山药作为实验材料，进行多糖的提取纯化及化学结构研究，为蕲山药的食用、药用提供理论、实

14、践依据以及一定的数据支持。1.3.2论文的特色和创新之处医圣李时珍的故里湖北省蕲春县具有悠久的山药种植历史, 蕲山药是以蕲春县为主的鄂东山区大面积种植的优良地方山药。据本草纲目记载:蕲山药，“甘，温平无毒”；有“益肾气，健脾胃，止泻痢，化痰涎，润皮毛”之功效。蕲山药以其枝肥个大，肉质细腻，淀粉丰富, 色白多汁,食味香甜, 清爽可口, 而有别于它处，历为鄂东名产。迄今未见蕲山药多糖研究的报告，本实验拟在淮山药多糖研究较成熟的基础上，采用地方特色的蕲山药作为实验材料。且蕲山药经削皮切碎后均用液氮进行冷冻处理。1.3.3研究的主要内容本论文的研究内容主要有以下几个方面：1、参考实验室其他同学实验数据

15、共同确定蕲山药多糖提取的最佳工艺，最大限度地获得多糖，建立山药多糖分离纯化的体系。山药多糖提取实验主要包括提取温度，提取PH、提取时间和液固比、乙醇体积以及提取次数的选择，针对这几个提取条件分别做单因素实验，考察它们对提取率的影响。并通过正交实验获得蕲山药多糖最佳的提取条。2、确定山药多糖的纯化方法，对使用Sevage法及重结晶法的不同去除蛋白质的效果以及多糖损失的比较中获得最佳的去除蛋白质的方法。3、在其他同学利用气相色谱法测得多糖成分的基础上，利用红外光谱对多糖的构型进行了检测分析研究。2.蕲山药多糖的提取工艺研究山药是常用中药，具有补脾养谓、生津益肺和补肾涩精之功效，山药多耱是山药主要活

16、性成分，本章对山药水溶性多糖的提取工艺进行初步研究。山药多糖的提取多根据多糖是极性大分子化合物，易溶于水，不溶于乙醇的性质而常用水做提取溶剂，即所谓的相似相容原理。一般工艺是原料经水提、离心、醇沉、干燥得粗多糖，这也是目前最为常用的方法。2.1实验材料2.1.1材料山药为鄂东南地区特产新鲜蕲山药。2.1.2仪器BCD-215KAW海尔冰箱 青岛海尔股份有限公司便携式酸度计pH B-5型 杭州奥立龙仪器有限公司DK-S24电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司离心机4K15 北京博万力行仪器有限公司FA2104N电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司SE2001F电子天平 奥豪斯仪器（上海）有

17、限公司WG-43鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司移液枪 上海求精生化试剂仪器有限公司紫外分光光度计2.1.3试剂液氮；无水乙醇（分析纯）；纯水；98% 浓硫酸(分析纯)、Tris饱和苯酚(分析纯)；无水葡萄糖(分析纯)。2.2实验方法2.2.1多糖提取方法将蕲山药削皮切片，先用液氮装置进行处理，后置于冰箱备用。称取一定量的冷冻块状蕲山药，加入适量纯水调节pH后在一定的温度的热水浴种浸提。其间不断搅拌，静置冷却后离心（5000r/min,15min），收集上清液，浸提重复两次。减压或烘干（60）浓缩，在浓缩后的上清液中加入一定体积的乙醇溶液，不断搅拌，有大量沉淀生成。在冰箱4静置约2小时，离

18、心（6000r/min,20min），收集沉淀，干燥（40）得粗多糖。2.2.2正交实验的设计以总糖含量为考察指标，用正交实验法优选蕲山药多糖最佳提取工艺。本实验选取水浴温度、PH值、料液比和加入乙醇后乙醇的体积分数为影响因素，设置4个水平，实验安排见表2-1。表2-l 因素水平表水平实验因素提取温度料液比乙醇：浓缩液（体积比）pH1601:81:17.02701:101:27.53801:121:38.04901:151:48.551001:201:59.02.2.3多糖供试品液的制备称取1.51.7g块状蕲山药共25组，按照L25(56)正交表(表3)中各条件分别提取、过滤，上清液定容至1

19、000mL，摇匀，待测。2.2.4标准曲线制作及总多糖含量测定1、测定方法的选择山药所含糖类物质从结构上说既有均多糖、杂多糖，也有蛋白复合多糖。总糖测定常用方法主要有DNS法、蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法。DNS法：利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系，用比色法测定还原糖含量的。蒽酮硫酸法与苯酚硫酸法：利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系，用比色法测定糖含量。苯酚-

20、硫酸法是常用测定多糖含量方法，可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单、灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上，蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物，所以用该法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。因此，蒽酮-硫酸法测定结果偏高于苯酚-硫酸法。故苯酚-硫酸法测定总多糖含量更为合理准确。2、苯酚-硫酸法原理经水提醇沉淀得粗多糖，多糖在硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，在490rim处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。标准曲线的制备1、对照品溶液的制备。精密称取105干燥至恒质量的

21、无水葡萄糖对照品250mg，置250 mL量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻度，摇匀，即得1 mg/mL葡萄糖溶液。2、多糖梯度浓度的制备。取一定量葡萄糖液加适量水，按照表2浓度梯度配制，待测。3、向9支试管加入5%苯酚溶液 1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸（98%）5 mL，摇匀，放置10min，置 40水浴中保温 18 min，取出后迅速冷却至室温，以一号管为空白对照，可见光分光光度法，在490nm的波长处测定吸光度。已吸光度为纵坐标-浓度为横坐标制作标准曲线。山药总糖的测定1、将提取的多糖溶解，定容至250ml，再吸取10ml定容至100ml。2、向稀释后的总糖提取液试管加入5%苯酚溶液1mL

22、，摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，摇匀，放置10min，置 40水浴中保温18 min，取出后迅速冷却至室温，同样以一号管为空白对照，可见光分光光度法，在490nm的波长处测定吸光度，做两组。3、总多糖的测定。按照“标准曲线的绘制”项下的方法测定吸光度值，按下式计算样品中总多糖的质量分数。×100C×V×DW×106总多糖含量()= 式中C为测得的样品溶液的葡萄糖质量(mgmL)，D为样品溶液的稀释倍数，V为测定液总量(mL)，W为山药样品的质量(g)。2.3实验结果及讨论2.3.1提取条件的正交实验优化结果a) 根据实验所得葡糖糖标注曲线如表2-2及图2-

23、1。表2-2 葡萄糖标准曲线 管号葡糖糖液/ml水/ml水/ml最终浓度/ml吸光度值（490nm）10.000.503.5ml0.0000.000 20.050.450.01250.096 30.100.400.02500.147 40.150.350.03750.301 50.200.300.05000.354 60.250.250.06250.413 70.300.200.07500.521 80.350.150.08750.682 90.400.100.10000.731 图2-1 葡萄糖标准曲线图b) 按照标准曲线制备项下的方法测得的总多糖含量实验结果及方差分析见表2-3和图2-2。

24、表2-3 L25（56）正交优选设计及结果 因素试验号a.提取温度b.料液比c.乙醇：浓缩液（体积比）d.pH蕲山药多糖提取率（%）1601:81:17.01.21 2601:101:27.52.02 3601:121:38.01.85 4601:151:48.51.76 5601:201:59.01.85 6701:81:28.00.99 7701:101:38.51.03 8701:121:49.02.76 9701:151:57.01.09 10701:201:17.53.08 11801:81:39.00.82 12801:101:47.03.36 13801:121:57.51.14

25、 14801:151:18.00.71 15801:201:28.50.80 16901:81:47.52.52 17901:101:58.03.25 18901:121:18.53.09 19901:151:29.03.02 20901:201:37.02.92 211001:81:58.54.11 221001:101:19.01.19 231001:121:27.02.73 241001:151:37.50.94 251001:201:48.02.15 K11.7403 1.9322 1.8567 2.2630 K21.7883 2.1700 1.9104 1.9398 K31.3668

26、 2.3138 1.5125 1.7895 K42.9598 1.5040 2.5120 2.1587 K52.2245 2.1597 2.2880 1.9287 极差R1.5930 0.8099 0.7755 0.1392 图2-2 极差分析结果图c) 实验结果实验室提取蕲山药各影响因素主次顺序：a（提取温度）b（料液比）c(乙醇：浓缩液)d(pH)。最佳提取条件：提取温度为90，料液比是1:12，乙醇：浓缩液为1:4，pH为7。并且根据确定的最佳提取条件，硫酸-苯酚法测得的总多糖含量为4.27。2.3.2 实验小结1、根据以上图表可知，实验室提取蕲山药各影响因素主次顺序：abcd，因此在影

27、响淮山药多糖提出率的3个因素中，水浴温度对提高山药总多糖含量有显著的影响，料液比及乙醇与浓缩液比对总多糖含量有一定的影响，溶液PH值影响最小；结合各因素的K值，可知总多糖含量的最佳组合是，提取温度为90，料液比是1:12，乙醇：浓缩液为1:4，pH:7。并且根据确定的最佳提取条件，硫酸-苯酚法测得的总多糖含量为4.27。2、在山药提取工艺条件的优选实验中，常将提取次数也作为考察的因素，但由于提取次数越多，实验操作约繁琐，在实际工作中常常考虑的是以较少的资源、时间和人力得到丰富的可供分析的实验数据。查找过去多相关文献后，得知山药多糖的浸提经过两次浸提后，多糖提取率趋于平缓，故本实验提取次数为两次

28、。3、本实验在测定蕲山药中总多糖含量中所采用得是Dubois等提出的苯酚一硫酸比色法，虽然苯酚以被氧化，只要临时配制并不影响实验结果。4、醇沉研究发现当乙醇浓度达到80时多糖沉淀最好，而在沉淀时间的实验中还发现，时间并不是影响其沉淀的因素，因此就选择2h沉淀。3.蕲山药多糖的分离纯化工艺研究从蕲山药的水提取溶液中用乙醇沉淀得到的多糖有时具有较深的颜色（所取山药表面干枯时），里面含有大量的蛋白质和小分子等。多糖是极性很大的大分子化合物，提取时一般要先将原料脱脂、脱色，然后用水、盐或稀碱水在不同温度下提取。提取物浓缩后加沉淀剂(乙醇、丙酮等)离心沉淀，沉淀部分可反复多次离心沉淀，以除去部分水溶性色

29、素等杂质。多糖的分离纯化过程一般包括预处理、分离、纯化和纯度鉴定几个阶段。其中纯化是关键，其效果直接影响后续阶段的研究。目前已报道的纯化植物多糖的方法有高速逆流色谱法、离子交换树脂法、有机膜超滤法、有机溶剂沉淀法、离心沉淀色谱法、酶解法、凝胶层析法、盐析法、季胺盐沉淀法、金属络合物法，以及制备性区域电泳法、制备性高效液相层析、超滤法和亲和层析法等。 通过参考一些山药文献并结合现有实验条件，本实验主要采用重结晶纯化法和Sevage法进行蕲山药多糖的纯化。3.1实验材料3.1.1材料山药为鄂东南地区特产新鲜蕲山药。3.1.2仪器通风柜-1500 武汉世纪珞珈科技有限公司电子万用炉 北京是永光明医疗

30、器械厂JB-3定时双向磁力恒温搅拌器 金坛市精达仪器制造厂鼓风干燥箱；移液枪；离心机；滤纸电子天平；漏斗；胶头滴管；pH试纸；镊子；橡皮手套。3.1.3试剂无水乙醇（AR）；纯水；氯仿；正丁醇；氨水；过氧化氢；聚乙二醇；EDTA(乙二胺四乙酸)；无水碳酸氢钠（AR）；98%浓硫酸(AR)；Tris饱和苯酚；无水葡萄糖。3.2实验方法3.2.1重结晶纯化法采用50%乙醇洗涤和80%乙醇沉淀进行反复重结晶,在提取液中加入无水乙醇100mL使乙醇体积分数达到50%，离心，弃去沉淀,以除去蛋白质和残留的淀粉。清液加入4倍体积无水乙醇，使乙醇体积分数达到80%，沉淀出多糖。经3次重结晶后的山药多糖基本上

31、可满足山药结构测定实验的要求。水提醇沉、重结晶纯化法的技术路线见图3-11.52.0g块状蕲山药研磨，调pH=7 用12倍体积纯水浸提2h，两次 多糖上清液 烘干（60）浓缩，3h 多糖浓缩液 加入乙醇至终浓度为80 6000rmin,20min,离心 上清液 可溶性粗多糖加入乙醇至终浓度为50 8000rmin,20min,离心 沉淀 上清液加入乙醇至终浓度为80 6000rmin,20min离心上清液 多糖沉淀 50乙醇洗涤，80乙醇沉淀 重复3次多糖 图3-1 重结晶法纯化多糖技术路线图3.2.2 Sevage法通常在进行多糖的分离纯化之前，必须对其脱蛋白。脱蛋白一般选择那些使蛋白质沉淀

32、而使多糖不沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必须处理时间短，温度低，避免多糖降解，所以一般采用Sevage法在避免降解上有较好效果。该法是将提取液与Sevage试剂氯仿：正丁醇=5：l（VV）5：13:1混合，震荡搅拌30min,离心两次（8000rmin,10min），变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处。Sevage法纯化多糖技术路线见图3-2可溶性粗多糖浓缩液 加入15的Sevage试剂 混合液搅拌30min 8000rmin,10min,离心两次 沉淀 混合浊夜 过滤，分离 多糖清夜 有机试剂 加入乙醇至终浓度为80 6000rmin,20min离心 多糖图3-2

33、 Sevage法纯化多糖技术路线3.2.3 多糖脱色一般多糖的脱色方法有活性炭法、树脂法以及双氧水漂白法。根据实验室条件衡量前两种方法对多糖的脱色均不方便，本实验采用双氧水漂白法对山药多糖进行脱色研究。双氧水是一种氧化脱色剂，浓度不宜过高且须在低温下进行，否则会引起多糖的降解。过氧化氢先弱酸一样，在碱性介质中离解为过氧化氢负离子，过氧化氢负离子又是一种亲和试剂，具有引发过氧化氢形成游离基的作用。具体步骤有，将除到蛋白质的溶液上清用氨水调pH至8.0，搅拌均匀后，缓慢加入10mL3过氧化氢溶液，60水浴加热30min，后用醋酸调节pH至7.0，减压或烘干浓缩后得到的除色素的多糖溶液。3.2.4小

34、分子物质的去除小分子的去除有很多方法，如采用透析法、柱层析法、多次反复沉淀法等，但是各有优缺点，如柱层析法会加大体积,多次反复沉淀法在之前的纯化过程有用到。本步骤去除小分子物质采用透析法，即将去完蛋白后的多糖液浓缩后放入透析袋中流水透析48h。透析袋预处理和保存多种，无非是激活透析袋。我们采用的是： 1、剪成适当长度（10-20cm）的小段透析袋，因为膜上含有痕量硫的化合物、金属离子和酶。 2、为防止被透析的分子失活透析袋最好在2(W/V)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。 3、用干净的镊子或者带上 橡皮手套取出，并用纯水煮沸，漂洗后，即可使用。 4、再用

35、1mmol/L EDTA(pH8.0)中煮沸10分钟。 5、冷却后，加上封盖存放 于4，透析袋始终浸没在溶液 内，取用透析袋时必须戴手套。 图3-3 透析装置 6、将透析袋的一端用夹子夹住，空腔里灌进要透析的溶液，再用夹子夹住另一端，仔细检查，不漏即可进行透析(如图3-3、3-4所示)。图3-4透析置装本实验选用截留分子量为8000Dal以上的透析袋去除小分子。2h换一次纯水，透析48h。利用聚乙二醇的吸水性浓缩透析袋内的液体，然后加体积一定的乙醇至终浓度为80，静置10h。使除杂后的山药多糖充分沉淀，置真空干燥箱中40或恒温水浴锅、烘箱中60干燥后备用。3.3 实验结果与讨论3.3.1纯化条

36、件的实验最佳结果1、本实验所采用重结晶纯化法和Sevage法的两种纯化方法，经苯酚-硫酸法测定纯化后多糖的糖含量，并对结果对比分析后说明：Sevage法纯化蕲山药多糖更有效见表3-1。表3-1不同方法纯化多糖梯度表方法多糖纯度1 重结晶法47.77%2 Sevage法59.25%2、用Sevage法脱蛋白后利用苯酚-硫酸法测定纯化后多糖的糖含量，结果见表3-2。表3-2 Sevage试剂脱蛋白梯度表管号提取液：Sevage试剂(VV)多糖纯度15：158.17%24：158.83%33：1 59.25%实验表明，将提取液与Sevage试剂氯仿：正丁醇=5：l（VV）5：13：1混合时，3：1的

37、混合比脱蛋白的效果最好。3.3.2 实验小结1、有报道，由于大部分游离蛋白在复合酶酶解提取的过程中已经被蛋白酶所消耗，所以经过3次Sevage法脱蛋白，蛋白基本上被除去，剩下还有部分可能是很多糖结合在一起的糖蛋白。Sevage法脱蛋白的次数越多则必然会导致多糖的损失越多，因此进行3次Sevage法脱蛋白就可以了。经过试验研究表明，在用Sevage法脱蛋白的时候只要搅拌均匀，时间充分（30min），蛋白质每次变性够充分，确实只需脱蛋白三次即可。且用Sevage试剂脱蛋白的次数不影响山药多糖结构的红外测定，见图4-4、4-5和4-8。2、采用50%乙醇洗涤和80%乙醇沉淀进行反复重结晶纯化多糖时，

38、起初单纯地重复此过程时得到的多糖含糖量很少，在用50%乙醇洗涤后的上清液和沉淀中均得到多糖，而且用红外测得两者的结构相差不大(见图4-2、4-3)。经反复实验研究后，发现在用50%乙醇对多糖进行洗涤时要不断搅拌让多糖充分溶解后才能弃去沉底，同样在用80%乙醇沉淀多糖时需在冰箱内静置2个小时后再离心得到多糖。3、加入有机试剂后震荡搅拌，为了使得蛋白质充分变性一般不断搅拌30min。由于变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处，需离心两次。在分离有机溶剂与多糖溶液时，一般采用滤纸、漏斗装置进行过滤（溶有山药有机物的氯仿、正丁醇混合液不会滤过滤纸），在必要时利用胶头滴管吸取上层无机溶液，即多

39、糖溶液。4、小分子物质的去除采用透析法，这样做不会增加反应液的量，而且如果选用适当截留量的透析袋可以有效去除小分子物质，本实验采用截留量为8000的透析袋透析2h换一次纯水（晚上一般10h换一次），透析48h。5、在利用磁力恒温搅拌器进行搅拌时需注意：磁石的转速不宜过大，否则溶液有漩涡透析袋下沉，磁石容易打到透析袋。透析袋的放置方向很重要，如图3-3所示将透析袋横向放置，由于两个塑料夹子的浮力使得透析袋保持比较稳定的状态，即不容易下沉而碰到磁石。4.山药多糖的成分及其化学结构分析糖的结构分析，主要任务就是测定糖链的一级结构，这包括糖链的糖基组成，单糖的连接次序、异头构型、取代基情况、以及糖链与

40、非糖链的连接等等。而目前用于多糖高级结构分析的方法主要是物理方法，诸如X射线纤维衍射、核磁共振等。目前能有效分析多糖的一级结构的方法有化学方法、物理方法等。化学方法是最古老且最经典的，有甲基化分析、Smith降解、过碘酸氧化、三氧化铬氧化法、部分酸水解等：物理方法主要有红外光谱、核磁共振波谱、气相色谱、质谱、气质联用、快原子轰击质谱、毛细管电泳等。在多糖一级结构的分析中仅靠一种技术是不可能的，常用的测定方法一般是化学法和波谱法相结合。波谱法中最为常用的是红外光谱和核磁共振，本实验主要采用红外光谱进行测量，并参考其他同学气相色谱法的测量结果进行分析。红外光谱图上每一个吸收峰，都相应于分子中原子或

41、宫能团振动的情况。糖类的官能团通过红外光谱图可以清楚地识别出来，对多糖的结构分析起了重要作用。可以应用它来识别吡喃糖和呋喃糖，确定糖的构型；定量分析等。红外光谱法的特点：(1)适用的样品范围最广，气体、液体、固体、悬浊体、弹性体等样品，不管是纯样品或混合样品，有机物或无机物，皆可进行红外测定，并给出相应的结构信息，其他的谱学方法，对样品的形态、种类等有较大的局限性。(2)提供结构成分的信息很丰富。由于所有的有机化合物红外光谱图皆有较多的吸收峰，在一张谱图上可同时提供出峰的位置、形状、强度等一组信息，享有“有机化合物的指纹谱”之称。(3)与其他结构分析仪器相比，如质谱、核磁等，它的仪器价格便宜，

42、使用维护方便。(4)它的不足之处是：提供的结构信息虽然丰富，但是对谱图的理论解释、许多峰的来源和结构的准确推测比较困难。红外光谱用于糖链结构分析是一种简单快速且用样微量的方法，但它给出的信息有限，故而只能是初步分析。红外光谱的波段分为近、中、远红外三部分，有机结构分析应用最多的是中红外4004000cm-1范围。10400cm-1为远红外区，主要用于元素有机物的分析；400015000cm-1为近红外区，主要用于天然有机物的定量分析。本实验采用中红外进行测定。虽然多糖的结构测定是比较困难的，但解剖多糖的低级和空间结构，对于明确多的生物学功能具有重要的意义。4.1实验材料4.1.1材料提纯后的蕲

43、山药多糖。4.1.2仪器WG-43电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司Tensor红外分光光度（含压片机等） 布鲁克光谱仪器公司FA2104N电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司4.1.3试剂鼠李糖 中国药品生物制品检定所D-木糖 中国药品生物制品检定所葡萄糖（分析纯）；无水乙醇（分析纯）；丙酮；溴化钾（用前经160烘6h，贮存于干燥器内备用）。4.2实验方法4.2.1山药多糖的IR光谱分析1、样品的一般制备及特殊制样法气体样品的分析，早期的文献介绍采用不同规格的气体池。但是实际应用不多，因为对气体及易挥发液体等小分子样品的分析，采用气相色谱及质谱法更为方便。液体样品，可选用不同规格和不

44、同材料的液体池进行分析。池的厚度在0.01-lmm之间，池材料由对红外透过率很高的KBr，NaCl等材料组成。固体样品的红外光谱分析通常采用压片法。将样品与一定量的KBr粉同时研磨成m级的细粉，采用专用的压片设备，压制成透明度好的薄片，即可进行分析。本实验主要采用固体样品进行红外光谱分析。(1) 压片法：一般红外测定用的锭片为直径13mm、厚度约1mm左右的小片。取约12mg试样在玛瑙研钵或振动球磨机中磨细后加100200mg已干燥磨细的溴化钾粉末，充分混合并研磨，使平均颗粒尺寸为2左右即可，不必再细。将研磨好的混合物均匀地放入模具的顶模与底模之间，然后把模具放入压力机中，在10T/cm2左右

45、的压力下12分钟即可得到透明或均匀半透明的锭片，压力不宜太高，否则会损坏模具。溴化钾对钢制模具表面的腐蚀性很大，模具用过后必须及时清洗干净，然后保存在干燥环境中。对于难研磨样品，可先将其溶于几滴挥发性溶剂中再与溴化钾粉末混合成糊状，然后研磨至溶剂挥发完全，也可在红外灯下赶走残留的溶剂，注意必须将溶剂完全赶尽。(2) 糊状法：糊状法是由研细的固体粉末和少量氟化煤油或矿物油（如液体石蜡）调合而成。氟化煤油在40001300cm-1区域是红外透明的，液体石蜡适用于130050cm-1范围，氟化煤油和石蜡油的光谱也可由差谱方法或在参比光路上补偿除去。2、操作方法称取30mg的山药多糖与干燥的KBr进行

46、压片，在4004000 cm-1之间扫描。4.2.2山药多糖的气象色谱分析（此方法由其他同学完成）4.3 结果与讨论4.3.1 山药多糖的红外光谱红外光谱图上每一个吸收峰，都相应于分子中原子或宫能团振动的情况，糖类的官能团通过红外光谱图可以清楚地识别出来。图4-1多糖重结晶纯化组-上清糊状法 （注：以下未标明都是采用压片法）图4-2多糖重结晶纯化组-上清图4-3多糖重结晶纯化组-沉淀图4-4粗多糖组图4-5脱蛋白一次组（氯仿：正丁醇=4：1）图4-6脱蛋白一次（氯仿：正丁醇=3：1）图4-7脱蛋白两次（氯仿：正丁醇=5：1）图4-8脱蛋白两次（氯仿：正丁醇=4：1）图4-9脱蛋白两次（氯仿：正

47、丁醇=3：1）多糖84-10脱两次多糖104-11脱两次+脱色去蛋白多糖14-11去蛋白多糖图4-12去蛋白多糖图4-13无水乙醇图4-13葡萄糖图4-14木糖图4-15鼠李糖以上图列出了不同纯化方法得到的蕲山药多糖的红外光谱分析图，根据系列图列出的糖类部分官能团特征吸收化学位移及个文献上的相关有机波谱分析，对这些张谱图进行分析比较发现：用Sevage试剂脱蛋白的次数不影响山药多糖结构的红外测定，见图4-4、4-5和4-8。山药水溶性多糖的红外光谱的特征吸收峰及归属如下（将图4-11,4-12主要特征峰列出来）:3859.65,3745.24,3734.64 cm-1处有强吸收，表示有-OH的OH键的伸缩振动2926.43，2961.40 cm-1表示糖类的CH的伸缩振动特征吸收峰2360.67,2341.11 cm-1应该属于乙醇的结构（图4-13）1749.16,1717