食品生物技术导论答案最终

1、食品生物技术绪论名词解释1 食品生物技术 食品生物技术(food biotechnology)：是现代生物技术在食品领域中的应用，是指以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其它学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料2 基因工程基因工程：通过一系列技术操作过程，获得人们预先设计好的生物，该生物所具有的特性往往是自然界不存在的。是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切，拼接，重组形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中得以高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。3 细胞工程细胞工程(cell engineering)：在细胞水

2、平研究、开发、利用各类细胞的工程。是人们利用现代细胞分子生物学的研究成果，根据需求设计改变细胞的遗传基础。4 蛋白质工程蛋白质工程(protein engineering)：通过对Pr化学、Pr晶体学和动力学的研究，获得有关Pr理化特性和分子特性的信息，以此为基础有目的设计改造编码蛋白的基因，通过基因工程技术获得可以表达Pr的转基因生物系统，该生物系统可以是转基因微生物、转基因植物、转基因动物，或细胞系统。最终产出改造过的Pr5 酶工程酶工程(enzyme engineering)：利用酶催化作用进行物质转化的技术，是酶学理论、基因工程、蛋白质工程、发酵工程相结合而形成的一门新技术6 发酵工程

3、发酵工程是将微生物学、生物化学和化学工程等学科基本原理有机结合，是建立在基因工程技术基础上的一门应用技术性学科。7 生物工程下游技术生物工程下游技术(biotechnique downstream processing)：将发酵工程、 酶工程、蛋白质工程和细胞工程生产的生物原料，经过提取、分离、纯化、加工等步骤，最终形成产品的技术二 问答题1 食品生物技术研究内容包括哪些？内容：基因工程、细胞工程、蛋白质工程、酶工程、发酵工程、生物工程下游技术、现代分子检测技术2 食品生物技术在食品工业发展的地位如何?地位食品生物技术研究内容已涉及到食品工业的方方面面，从原料到加工无处不存在食品生物技术的痕迹

4、。利用基因工程技术以根据人类的需要人为地设计新型的食品及食品原料，基因工程还可以为发酵工程提供更优良的工株，促进食品发酵工业的发展。（1）基因工程将处在21世纪食品工业的核心位置；（2）发酵技术很早被人们用于生产食品，食品发酵工程在食品工业中占有举足轻重的作用；（3）食品与酶的关系密切，食品生产离不开酶处理，蛋白质工程和酶工程在食品工业中所占比重将会更大；（4）生物工程下游技术作为现代食品工业不可缺少的部分将对食品工业的发展起到推动作用。3 叙述一下你对生物技术食品的安全性，特别是转基因食品的安全性有何看法?转基因食品中外源基因对人健康的潜在危险；转基因作物新基因对食物链其它环节的不良后果；转

5、基因植物对生物多样性的影响。第二章一、名词解释1 基因工程基因工程：通过一系列技术操作过程，获得人们预先设计好的生物，该生物所具有的特性往往是自然界不存在的。是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切，拼接，重组形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中得以高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。2 基因工程载体基因工程载体(vector or carrier)：在细胞内具有自我复制能力的、运载目的基因进入宿主细胞的运载体。3 限制性内切酶限制性内切酶 (restriction enzyme: RE)：在特定部位限制性地切割DNA分子的酶。通过该酶作用，生物基因

6、被切成许多独立小片段，从中分离出目的基因，进一步克隆、鉴定它们。有三种限制性内切酶!4 黏性末端有些限制性内切酶切割DNA后产生5磷酸基团突出的末端和3羟基突出的末端，统称为黏性末端。5 平末端一些在切割两条链两端平整 (平末端)的DNA分子，这些末端叫平末端(blunt end)。6 DNA连接酶能将两段DNA拼接起来的酶称DNA连接酶(ligase)7 高拷贝数质粒与低拷贝数质粒。有些质粒在每个宿主细胞中有10-100个拷贝，称高拷贝数质粒；一些质粒在每个细胞中有1-4个拷贝，称低拷贝数质粒。8 窄宿主范围质粒与广宿主范围质粒。有些质粒的复制起始点特异强，只能在一种特定宿主细胞中复制，称窄

7、宿主范围质粒；有些质粒的复制起始点特异性弱，可在许多种细菌细胞中复制，称广宿主范围质粒。 9 穿梭载体酵母质粒载体既可在大肠杆菌中复制与扩增，又可在酵母系统中复制与扩增，又称为穿梭载体(shuttle vector)。10 Ti质粒Ti质粒是天然的优质基因工程载体，通过感染植物(特别是双子叶植物)伤口，诱发伤口组织形成冠瘿瘤(crown gall tumour) ，并在冠瘿瘤内合成精氨酸衍生物即冠瘿碱(opines) 章鱼碱(octopine)和胭脂碱(nopaline) 。11 Ri质粒土壤发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) 也能侵染大多数双子叶植物，并在伤口处引

8、起植物细胞迅速扩增，形成大量根毛，这些根毛是由病菌中的Ri质粒(Root-inducing plasmid)引起的。12 黏性质粒载体黏性质粒载体(cosrmid vector)，也称柯斯质粒，指含有抗性基因、单一克隆位点及DNA cos位点的细菌质粒。13 外源基因插入到载体内的非自身的DNA片段称为外源基因(foreign gene)。14 目的基因(objective gene) 目的基因(objective gene)，又叫靶基因( target gene) ，是指根据基因工程的目的和设计所需要的某些DNA分子的片段，含有一种或几种遗传信息的全套密码(code)。15 人工接头人工接头

9、(linker) 是人工合成的具有特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列，将其接在基因片段和载体DNA上，使它们具有新的内切酶位点，用相应的内切酶切割，就可以分别得到互补的黏性末端16 转化与转染转化(transformation) 使重组体DNA分子在热休克(heat shock)的短暂时间内被导入受体。转染 未包装病毒DNA导致基因转移的现象。17 受体细胞受体细胞 也叫宿主细胞，分原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受体细胞(最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(真核受体细胞)。18 DNA体外重组将目的基因与载体连接在一起，称DNA体外重组。19 基因重组(gene r

10、ecombination) 是基因工程的核心，利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因，并将两者连接起来 20 亚克隆(sub-cloning)把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体的过程称亚克隆(sub-cloning)。21 同族酶同族酶 也叫同裂酶(isoschizomer)，指来源于不同机体但具有相同识别和切割序列的酶。22 克隆(cloning) 目的基因与载体连接成重组DNA后，将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到重组子，这就是外源基因的无性繁殖克隆(cloning)。 23 热休克24 体外包装(in vitro package)在体外将重组体D

11、NA放置到噬菌体蛋白质外壳内，再通过正常噬菌体感染过程导入宿主细胞。将重组子噬菌体包装成噬菌体颗粒，使其能够感染细菌，并在宿主菌体内扩增和表达外源基因。25 共转化(co-transformation)将外源基因与报告基因(report gene)共同导入感受态真核细胞的方法，称“共转化”(co-transformation)。26 电转化(electro-transformation)电转化(electro-transformation) 也称高压电穿孔法 (high-voltage electroporation，简称电穿孔法electro-poration) ，向受体细胞施加短暂的高压脉

12、冲电流，使质膜形成纳米大小微孔，DNA直接通过这些微孔，或作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。27 微注射技术(micro-injection)微注射技术(micro-injection) 也称直接显微注射技术(directmicro-injection) ，用微吸管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确插入受体细胞核中，将DNA注射进去。此法常用于转基因动物的基因转移。28 脂质体(liposome，人工膜泡)脂质体(liposome，人工膜泡)作为体内或体外输送载体的方法，一般都需要将DNA或RNA包囊于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合， 通过融合导入细胞。39 重组

13、DNA载体转化法简称载体法，是以载体为媒介的基因转移，即将目的基因连接于某一载体DNA上，然后通过宿主感染受体植物而将外源基因转入植物细胞的方法最常用。30 反义RNA (antisense RNA)反义RNA (antisense RNA) 指有义(sense) DNA链转录成的、与特异靶RNA互补结合并能抑制靶RNA表达的一段序列。31 反义基因(antisense gene)转录产生反义RNA的基因称之为反义基因(antisense gene)。二简答题1 基因工程基本过程基因工程基本过程：利用重组DNA技术，经体外“cut”和“splice”等方法，改造和重组生物基因，再导入受体细胞中

14、增殖、表达，产出人类需要的基因产物。2 基因工程主要内容基因工程主要内容：切、接、贴和检查、修复等。基因工程操作4步骤由供体分离出目的基因or人工合成目的基因并制备运载体(质粒、病毒或噬菌体) ；目的基因经DNA连接酶接入运载体重组体；将重组体引入宿主细胞；筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体。3 型限制性内切酶命名原则：型限制性内切酶命名原则：有机体属名第一个字母(大写、斜体)和种名前两个字母(小写、斜体)构成基本名称，株系数字通常省略；若酶存在于一种特殊菌株中，在基本名称后面加上菌株名称符号；罗马数字表示从同一个细菌中分离出来的不同限制性内切酶。4 型限制性内切酶作用特点与主要用途特点

15、：位点特异性酶，识别双链DNA分子中特异序列，在特异部位水解双链DNA中每一条链上的磷酸二酯键，造成双链缺口，切断DNA分子。 识别位点为4、5、6、8个或更多碱基对缺口DNA序列大多呈回文结构(正、反读一样)。主要用途：在特异位点将DNA切成片段；建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱；构建基因文库； 切出相同的黏性末端，以便重组DNA。5 DNA连接酶用途用途：连接带匹配黏端的DNA分子；使平端双链DNA分子互相连接或使合成的接头相连接6 大肠杆菌DNA聚合酶有哪些酶活性？说明该酶的主要用途大肠杆菌DNA聚合酶有三种酶活性：53 DNA聚合酶活性；35外切核酸酶活性；53外切核酸酶活性。用途

16、：用切口平移方法标记DNA (可作杂交探针)；用其53外切核酸酶活性降解寡核苷酸作为合成cDNA第二链的引物；对DNA分子3突出末端标记，用于DNA序列分析。7 Klenow片段有几种酶活性？说明其主要用途。Klenow片段有53聚合酶活性和35外切酶活性，无53外切酶活性。主要用途：补平限制性内切酶切割DNA产生的3凹端；用32PdNTP补平3凹端，末端标记DNA片段；对带3突出端DNA末端标记；cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；在体外诱变中，从单链模板合成双链DNA；应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序。 8 试述 T4噬菌体DNA聚合酶作用特点与主要用途特点：相对分子质量11400

17、0，功能与Klenow片段相似。有53聚合酶活性及35外切核酸酶活性，35外切酶活性。对单链DNA作用比对双链DNA更强，外切核酸酶活性比Klenow片段强200倍。用途：补平或标记限制性内切酶消化DNA产生的3凹端对带有3 突出端的DNA分子末端标记；标记用作探针的DNA片段；将双链 DNA末端转化成为平端；延伸结合于单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物。9 耐热DNA聚合酶的主要用途（1）DNA测序；（2）PCR对DNA片段进行体外扩增。10 末端转移酶的主要用途用途：给载体或cDNA加上互补同聚尾；DNA片段3末端放射同位素标记。11 碱性磷酸酶的主要用途（1）除DNA和RNA的5-磷酸基

18、，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用 -32P ATP末端标记后进行序列分析；（2）去除载体DNA的5磷酸基，防止自我环化，降低成本，提高重组DNA检出率。12 S1核酸酶主要用途除DNA片段的单链突出端，使之成为平端，利于某些情况下片段间连接；去除cDNA合成时形成的发夹结构；施行S1核酸酶保护试验，分析转录产物；成熟mRNA与基因组DNA杂交后，S1核酸酶水解可确定内含子在基因组DNA中定位；修整、渐进性删除突变末端。 13 逆转录酶有几种活性逆转录酶有三种活性：RNA指导的DNA合成反应；DNA指导的DNA合成反应； RNA的水解反应。 14 理想的基因工程载体应具备的特征有哪些？常见基

19、因载体有哪些？特征：在宿主细胞内独立、稳定地自我复制。外源DNA插入其DNA之后，仍保持稳定复制能力和遗传特性。易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。在DNA序列中有限制性内切酶单一酶切位点位于DNA复制非必需区，在这些位点上插入外源DNA不影响载体自身DNA复制。有能直接观察的表形特征(报告基因)，插入外源DNA后，这些特征可作为重组DNA选择标记。常见的基因载体：细菌质粒载体、农杆菌质粒载体、噬菌体载体、柯氏质粒载体和病毒载体等。15 如何命名质粒？质粒命名 用小写“p”代表质粒，用一些英文缩写或数字描述这个质粒。pBR322：BR研究出该质粒的研究者Bolivar和Rogigerus，322

20、与研究者有关的数字编号。16酿酒酵母表达系统的优缺点酿酒酵母表达系统的优缺点：酵母是生产外源蛋白的最佳表达盒(expression box)包括有效的启动子序列(诱导型或组成型)、目的蛋白cDNA和转录终止序列。注意产生蛋白是胞内表达还是向外分泌。用酿酒酵母表达系统应考虑：选择启动子和终止子；表达盒稳定性；外源蛋白累积部位；产量高低。17 Ti质粒载体转化法优点Ti质粒载体转化法优点：寄主范围广，可浸染多种双子叶及少数单子叶植物(约93科331属643种双子叶植物对Ti质粒敏感)；操作简单，不需特殊组织培养技术；转化频率和重复性高。目的基因能较完整地转入受体细胞，整合到染色体上，并以孟德尔方式

21、遗传和表达。18 常用的噬菌体载体有哪些？各有什么特点？· 噬菌体：噬菌体是温和噬菌体，注入的DNA整合到大肠杆菌染色体中，与染色体一起复制，在某种营养或环境胁迫条件下，整合的噬菌体DNA被切割出来，进入裂解循环。噬菌体是一种线状双链分子，其中大约20kb对于整合/切割过程极为关键，称整合/切割(I/E)区域。构建核基因文库来时，将这20kb DNA片段去掉，强迫重组噬菌体进入裂解循环。· M13载体：M13载体是一种细丝状的特异性大肠杆菌噬菌体单链噬菌体载体。可插入外源DNA而不影响噬菌体增殖。M13感染细菌后呈双链复制型(RF)DNA。允许包装大于病毒单位长度的外源DN

22、A；感染细菌后复制环状DNA经包装形成噬菌体颗粒，分泌到细胞外而不溶菌。这些特性便于分离单链DNA，且在产生大量的单链DNA中，含有外源DNA序列。可用于DNA序列分析、制备杂交探针、定点突变等。19 获得目的基因的方法有哪些？鸟枪法 (shot gun) ；物理化学法（密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法）；化学合成法；酶促逆转录合成法；PCR扩增法 20 目的基因如何测序？DNA序列分析指测定某段DNA分子或片段的核苷酸(A、T、G、C)顺序。测序常用于转化子的序列分析，可最直接、最客观反映转化子中有无目的基因。DNA测序方法：化学降解法、 酶促法(双脱氧终止法)、自动测序法及PCR法等。

23、21连接目的基因与载体的方法有哪些？亚克隆、 黏性末端连接、平端连接、人工接头连接、同聚物加尾连接等。22举例说明重组DNA导入受体细胞的方法。转化(transformation) 转染(transfection)：微注射技术(microinjection)：电转化法(electrotranformation)；微弹技术(microneblast technique)：脂质体介导法(liposome mediated gene transfer);其它方法：23 什么是报告基因？常用的报告基因有哪些？报告基因:是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说是一个表达产物非常容易被鉴定的基因。常

24、用的：GUS基因、NPT II基因、CAT基因、NOS基因、LUC和GFP基因24如何筛选与鉴定重组体鉴定· 报告基因的检测法（2）目的基因分子杂交检测方法筛选：在利用载体间接转化外源基因或直接转化处理之后，大部分受体细胞是没有被转化的，这就需要采用特定的方法将转化细胞与未转化细胞区分开来。为了淘汰未转化的细胞，人们试验了各种不同的基因作为转化的报告基因(reporter gene) ，包括一些显性的选择标记基因，以及可用特定方法检测其蛋白质产物的基因。其中GUS基因和NPT II基因能耐受氨基末端融合、检测简单，是目前应用最多的报告基因。在植物基因工程中双子叶植物如番茄、辣椒、马铃

25、薯的转化及部分单子叶植物的转化用NPT II基因所抗的卡那霉素 (kanamycin)来筛选。25 什么是基因探针？制备基因探针的方法有哪些？基因探针(probe)是一段与目的基因互补的核酸序列：DNA或RNA，用来待测样品DNA或RNA进行核酸分子杂交，可判断两者的同源程度。制备方法：（1）缺口平移法（2）随机引物标记法（3）生物素标记法（标记方法可分为参入法、末端标记法和光化学法）（4）酶标记法（5）半抗原标记法 26 简述反义基因技术的基本概念、原理及其特点，并举例反义基因技术在食品产业中的应用。概念：转录产生反义RNA的基因称之为反义基因(antisense gene)原理：把一段DN

26、A序列以反义方向插入到合适的启动子和终止子之间，然后把此基因构建体转化到受体细胞中去(常用农杆菌转化) ，通过选择培养获得转化生物体的技术。反义基因转录生成的mRNA可抑制同源性内源基因的表达，该法可获得特定基因表达受阻而其它不相关基因的表达不受影响的转基因植株。特点：反义RNA可以高度专一地调节某一特定基因的表达，不影响其它基因的表达。转到植物中的反义RNA作用类似遗传缺陷型，表现为显性。避免了二倍体内等位基因的显隐性干扰。 反义基因整合到植物的基因组中可独立表达和稳定遗传，后代符合孟德尔遗传规律。 反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋白质结构，省去对基因产物的研究工作。 反义基因不改变目的

27、基因结构，应用更加安全应用：（1）改造食品微生物-改良微生物菌种；改良乳酸菌遗传特性（抗药基因、风味物质基因 、产酶基因 、耐氧相关基因 、产细菌素基因 ）；酶制剂的生产；（2）改善食品原料的品质-改良动物食品性状；改造植物食品原料（提高植物食品氨基酸含量、增加食品的甜味 、改造油料作物 、改良植物食品蛋白质品质、改善园艺产品采后品质）；（3）改进食品生产工艺-利用DNA重组技术改进果糖和乙醇生产方法；改良啤酒大麦的加工工艺；改良种子贮藏蛋白的烘烤特性；改善牛乳加工特性；（4）生产食品添加剂及功能性食品-生产氨基酸 ；生产黄原胶 ；超氧化物歧化酶(SOD)的基因工程；生产保健食品有效成分27

28、简述利用生物技术的方法如何调控乙烯的生物合成。乙烯在果实成熟过程中具有重要意义。近十余年来分子生物学研究为乙烯合成的控制提供了新途径，采用基因工程手段控制乙烯生成已取得了显著的效果 ，如导入反义ACC合成酶基因；导入反义ACC氧化酶基因；导入正义细菌ACC脱氨酶基因；导入正义噬菌体SAM水解酶基因。28 简述你对基因工程两面性的理解（提示：从造福人类和危害人类两方面）第三章名词解释：1 细胞的全能性 植物细胞全能性（totipotency）：已分化的植物细胞在合适的条件下具有潜在的发育成完整植株或个体的能力2 细胞培养 细胞培养包括微生物的培养，动物培养和植物培养。通过细胞培养可以得到大量的细

29、胞或其代谢物。是生物技术中最核心最基础的技术3 细胞融合细胞融合：一定条件下将两个或多个细胞融于一个细胞过程，又称细胞杂交。4 共栖现象只有一种微生物得益，如细菌产生酶来分解抗生素，使其同伴能够生长。5广义植物细胞培养广义植物细胞培养 将离体单个游离细胞在人工控制的环境里无菌培养，以获得再生的完整植株或生产有经济价值的生物产品的一种技术。6 固定化细胞培养固定化细胞培养(immobilization culture) 把细胞固定在惰性材料如琼脂、藻酸盐、聚丙烯酰胺、纤维或膜上面或里面，细胞不运动，营养液可在细胞间流动。7 原代培养原代培养(primary culture)：从供体取得组织细胞后

30、在体外进行的首次培养。原代培养的组织由多种细胞成分组成，较复杂。8传代 传代(subculture)：细胞由原培养瓶内分离稀释后转到新培养瓶的过程。9 细胞系进行一次分离再培养，称传一代，初次培养的首次传代成功后，即成细胞系，一般可传30-50代。10 血清 血清(serum) 天然培养基中最有效和最常用的培养成分。含许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。11 融合过程 细胞融合过程：细胞+促融因子凝集细胞间质膜粘连细胞融合培养、核融合杂种细胞。12 融合子 融合子：来自两融合亲本的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代，又称融合重组子。13 细胞拆合细胞拆合：从活细胞中

31、分离出细胞器及其组分，然后在体外将不同细胞来源的细胞器及其组分重新装配，使其成为有生物活性的细胞或细胞器。问答题：1细胞工程的基本原理细胞培养基础：已分化的植物细胞在合适的条件下具有潜在的发育成完整植株或个体的能力细胞全能性（totipotency）。2简述细胞工程基本操作的三种技术及其具体方法。（1）无菌操作技术-无菌室定期消毒；实验前后消毒。进无菌室前换鞋、更衣、戴帽，操作时双手戴无菌手套。所有操作在超净台上进行。实验用生物材料彻底消毒与除菌。实验用一切器械、器皿和药品灭菌或除菌。（2）细胞培养技术-取材和除菌。淋巴细胞直接抽取；植物材料取材后，动物材料取材前表面清洗消毒；特定酶处理得分散

32、细胞。生物材料接种于培养基中后放入培养室或培养箱中培养，至一定生物量时收获或传代。 （3）细胞融合技术-制备原生质体。除去M及植物细胞细胞壁。动物细胞无壁。诱导细胞融合。两亲本原生质体悬浮液调至一定细胞密度；按1:1比例混合，用物理、化学或生物法促进融合。筛选杂合细胞。将混合液移到特定筛选培养基上使杂合细胞长出，未融合细胞不生长。得具有双亲遗传特性的杂合细胞。 3简述细胞融合的过程（1）备原生质体。除去M及植物细胞细胞壁。动物细胞无壁。（2）诱导细胞融合。两亲本原生质体悬浮液调至一定细胞密度；按1:1比例混合，用物理、化学或生物法促进融合。（3）筛选杂合细胞。将混合液移到特定筛选培养基上使杂合

33、细胞长出，未融合细胞不生长。得具有双亲遗传特性的杂合细胞。 4简述微生物细胞的培养方法及其优缺点。(1)固体培养(solid-state culture) 在固体培养基表面上培养。用于菌种分离纯化、种子保藏和制备。4可藏36月。优点：简单，适于小规模培养；缺点：大规模生产潜力小，不均匀，不便于监控。(2)液体培养 (liquid-state culture)菌体在培养液中处于悬浮状态，导入培养液空气中的氧通过气-液界面传质进入液相，扩散到细胞内部。优点：液体培养易获得混合均匀的菌体悬浮液，便于监控，易放大至工业规模。液体培养基本上服了固体培养的缺点，为大量培养微生物的一个重要方法(3)连续培养

34、(continuous culture)M培养至指数生长期后期以恒速连续通入培养基与无菌空气并立即搅匀，同时以溢流方式以同样速度不断流出培养物。使容器中培养物达到动态平衡，其中M可长期保持在指数期和恒定的生长速率上，形成连续生长优点：可以不断提供具有一定生理状态的，始终以最高生长速度生长的微生物细胞。缺点：染菌；收率和产物浓度比分批培养低，不利下游操作；营养物质利用率低，生产成本高；对设备要求较高，需复杂检测和控制系统；菌种退化造成减产。(4)中间补料培养(fed-bath culture)又称为半连续培养(semicontinuous culture)、流加培养、补料分批培养等。在发酵工业中

35、广泛采用，如生产次级代谢产物、细胞高密度培养。中间补料培养 根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长优点：可消除底物抑制；实现高密度培养，细胞密度可达150g干细胞/L；延长次代谢产物的生产时间；稀释有毒代谢产物；降低染菌和避免遗传不稳定性。(5)同步培养(synchrorious culture)同步培养 使培养中细胞同时分裂，即同步生长。群体行为和个体行为取得一致，就可以利用研究群体的方法来研究个体。优点：不影响细胞代谢，细胞生命活动正常。 (6)混合培养(mixed culture)优点：利于生物转化5简述微生物细胞液体分批培养

36、的四个阶段。分批培养M的四个阶段：（1）延迟期 -少数菌种接种到新鲜培养基上去以后，一般不立即进行繁殖。因此，在开始一段时间内，细胞数目几乎不增加，这段时间就成为延迟期。延迟期的出现被认为是细胞到新环境中，需要新和成必需的酶、辅酶或某些代谢中间产物，以及适应新的物理环境而出现的调整代谢的时期。（2）指数期-细胞经过延迟期后适应了新的环境，生理状态也较为活跃，细胞开始迅速繁殖，细胞数目呈几何指数增加，细胞数目的对数值呈直线上升。（3）稳定期-细胞经过对数期大量繁殖后，一方面，培养集中的物质渐趋耗尽；另一方面，代谢产物逐渐增加，致使细胞繁殖的速度逐渐降低，新生的细胞数与死亡的细胞数大致相等。这时，

37、培养基中活细胞数处于相对平衡状态。（4）衰亡期-细胞经过大量繁殖再经过稳定期后，由于培养基中营养成分耗尽，代谢产物大量积累，这时，能够增殖的细胞越来越少以至降到零，而死亡的细胞越来越多。培养基中细胞总数虽然不变，但活细胞数显著下降。6连续培养及其分类以及其存在的问题定义：连续培养(continuous culture)M培养至指数生长期后期以恒速连续通入培养基与无菌空气并立即搅匀，同时以溢流方式以同样速度不断流出培养物。使容器中培养物达到动态平衡，其中M可长期保持在指数期和恒定的生长速率上，形成连续生长分类：恒浊培养(turbidostatic culture)和恒化培养(chemostati

38、c culture)问题：染菌；收率和产物浓度比分批培养低，不利下游操作；营养物质利用率低，生产成本高；对设备要求较高，需复杂检测和控制系统；菌种退化造成减产7中间补料培养及其优点又称为半连续培养(semicontinuous culture)、流加培养、补料分批培养等。在发酵工业中广泛采用，如生产次级代谢产物、细胞高密度培养。中间补料培养 根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长优点：可消除底物抑制；实现高密度培养，细胞密度可达150g干细胞/L；延长次代谢产物的生产时间；稀释有毒代谢产物；降低染菌和避免遗传不稳定性。8同步培养及其

39、获得方法同步培养 使培养中细胞同时分裂，即同步生长。群体行为和个体行为取得一致，就可以利用研究群体的方法来研究个体。获得同步培养的方法：选择法 根据处于不同生长阶段的细胞的性质差异，将其分离出来培养。诱导法 控制环境条件，使细胞生长处于相同阶段，从而得到同步培养。9植物细胞培养的方法培养方法 -（1）单细胞培养（2）原生质体培养（3）固体培养（4）液体培养摇瓶及大规模悬浮培养10植物悬浮细胞培养的必备条件注意事项及其方法悬浮细胞培养体系必备条件：悬浮培养物分散性好、细胞团小；细胞形状和大小大致相同；生长迅速。悬浮细胞倍增时间为23d甚至更短。可直接用悬浮细胞进行原生质体分离、杂交、次生代谢物生

40、产等。建立悬浮细胞系注意事项： 合适外植体；疏松易碎愈伤组织；合适培养基；培养液除菌；暗或弱光悬浮培养；悬浮细胞继代与选择，保留小细胞团，直到得到均一的悬浮系为止。 植物细胞悬浮培养方法(1)分批培养(2)半连续培养(3)连续培养11固定化细胞培养及其特点固定化细胞培养(immobilization culture) 把细胞固定在惰性材料如琼脂、藻酸盐、聚丙烯酰胺、纤维或膜上面或里面，细胞不运动，营养液可在细胞间流动。特点：消除或极大地减弱流质流动引起的切变力。固定化细胞生长缓慢导致次生代谢物产量增高。细胞间接触紧密，所处理化环境与悬浮培养不同。便于操作。便于次生代谢物收集。12常见固定化细胞

41、培养系统及其特点(1)平床培养系统特点：设备简单，比悬浮培养体系能更有效的合成次生物质。占地面积较大，累积次生代谢产物较多的滴液区所占比例不高，而且在密闭的体系中氧气的供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌空气的设备。(2)立柱培养系统特点：滴液区所占的比例大大提高，次生物质的合成大为增加，占地面积大为减小。13简述褐藻酸钙固定植物细胞的技术路线。植物细胞海藻酸钠混合尼龙网氯化钙溶液浸浴2%海藻酸钠固定的细胞团14动物细胞培养及其分类动物细胞培养： 离散的动物活细胞在体外人工无菌生长增殖，整个过程中细胞不分化，不形成组织。培养细胞分类 ： 悬浮型和贴附型。悬浮型，呈悬浮状态生长的细胞；贴附

42、型，贴附于支持物生长的细胞。15动物细胞培养的一般程序动物细胞培养的一般程序 组织切碎酶处理得单个细胞培养扩大培养。16比较动物和微生物细胞培养的方法17简述动物细胞培养的方法及其特点培养方法 （1）悬浮培养(非贴壁依赖性细胞培养)；（2）贴壁依赖性细胞培养，细胞附着在带有适量电荷的固体或半固体表面上进行培养的方法。(1)悬浮培养主要用于非贴壁依赖性细胞培养。动物细胞没有细胞壁保护，不能耐受剧烈搅拌和通气等条件。小规模悬浮培养：转瓶和滚瓶培养方式大规模悬浮培养：发酵罐悬浮培养缺点 细胞密度低且易发生变异，有潜在致癌危险，此法病毒易失去病毒标记而降低免疫力。大多数动物细胞属贴壁依赖性细胞，不能悬

43、浮培养! (2)贴壁培养主要用于非淋巴组织等贴壁依赖性细胞的培养。贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。细胞贴壁步骤 贴壁因子吸附于培养表面细胞与表面接触细胞贴壁于培养表面贴壁细胞在培养表面上扩展。贴壁依赖性细胞附于带适量正电的固、半固体表面圆形细胞迅速铺展有丝分裂并很快进入对数生长期数天铺满生长表面致密细胞单层。(3)固定化培养既适于贴壁依赖性细胞，又适于非贴壁依赖性细胞的包埋培养。细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染力强。细胞种类不同，固定化培养方式也不同。贴壁依赖性细胞通常用胶原包埋培养；非贴壁依赣性细胞则常采用海藻酸钙包埋培养。常用细胞固定化方法主要有吸附、共价贴附、离子共价交联、包埋和微

44、胶囊化等(4)大规模培养法(large-size culture)包括空心纤维法、微载体法、微囊法18简述细胞融合的方法及其原理和应用方法（1）生物学法（2）化学促融法（3）电融合法 原理：细胞的全能性应用：动物植物微生物19微生物原生质体的制备及其步骤原生质体制备步骤：M培养到对数生长期用细胞壁降解酶在42轻轻振荡处理45 min±原生质体原生质体形成率=原生质体数÷未经酶处理的总菌数。融合(PEG)：混合A、B株原生质体悬液离心去上清液(4000g) 沉淀高渗溶液40%PEG 滴管轻轻吹打使细胞分散均匀水浴保温稀释涂布于高渗再生平板保温培养检查重组菌株融合率=融合子&#

45、247;两亲本原生质体再生菌落的总数(1)取材与除菌常用外植体：种子、根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。除菌：外植体肥皂水洗清水洗2-3次70%酒精 3%次氯酸纳无菌水漂洗数次无菌滤纸吸干。(2)酶解 植物细胞壁：纤维素、半纤维素、木质素及果胶等。复合酶如EA3-867和Onozuka R-1O；蜗牛酶。酶解：除菌叶片去表皮切块放入酶反应液轻摇数次反应液变绿后终止反应(3)分离 200-400目过滤、低速离心或比重漂浮法获原生质体。 (4)洗涤 以新渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤2-4次。(5)鉴定 低渗溶液；荧光增白剂染色（残留细胞壁发荧光）。原生质体活力：台盼

46、蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定光合作用、呼吸作用等。20比较植物和微生物融合子鉴别分析的方法微生物：直接法：营养缺陷型标记高渗再生基本培养基；抗药性标记含药物平板培养基；形态特征或色素标记色素、形态特征。间接法：融合液高渗再生完全培养基上亲本细胞和融合子再生成菌落影印法复制到选择培养基上检出融合子。表型延迟的遗传标记宜用该法植物：(1)杂合细胞的显微观察 显微镜下直接识别杂合细胞：细胞大小、颜色发现杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再生培养基培养。(2)互补法筛选杂合细胞 遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。(3)采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 染色体核型分析

47、、染色体显带分析、同功酶分析、核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)和随机扩增多态性 DNA (RAPD)分析，以确定是否结合了双亲本的遗传信息。 (4)根据融合处理后再生植株的形态特征进行鉴别已在种内、种间、属间乃至科间细胞融合得到了近200例再生株。最突出的成就当属番茄与马铃薯的属间细胞融合。已经获得的番茄、马铃薯杂交株，基本像马铃薯那样的蔓生，能开花，并长出2-11cm的果实。成熟时果实黄色，具番茄气味，但高度不育。 21简述动植物细胞工程的内容及主要技术动物细胞工程：一方面深入探索、改造生物遗传特性，另一方面大量培养细胞或动物本身，以期收获细胞或其代谢产物以及可供利用的动

48、物。动物细胞工程主要技术：组织培养、细胞融合、细胞拆合、染色体或染色体组转移等。植物细胞工程 ：以植物细胞为基本单位在离体条件下进行培养、繁殖或人为地精细操作，使细胞的一些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良品种或生产生物产品的目的的一种技术。植物细胞工程内容 原生质体培养技术、植物细胞杂交技术、植物单倍体培养技术等。与食品工业密切相关的是细胞培养、细胞融合。22简述动植物细胞工程在食品中的应用动物细胞工程的应用 (1)生产疫苗（TMD疫苗）(2)生产干扰素(3)生产单克隆抗体(4)在其它基因重组产品生产上的应用植物细胞工程在食品工业的应用(1)利用植物细胞工程生产香料(2)利用植物细

49、胞工程生产调料(3)利用植物细胞培养技术生产食品添加剂(4)利用植物细胞培养技术生产天然食品(5)利用植物细胞培养技术生产植物药23固定化细胞与固定化酶相比的优点？固定化细胞与固定化酶相比有如下优点：不需破碎细胞而直接利用胞内酶，制备成本低；酶在细胞内较稳定，细胞固定化后酶活力损失少；尤其是M细胞内的多酶系统，用固定化细胞技术更易实现。24完整细胞固定化的方法及其在食品工业中的作用完整细胞固定化方法：吸附法、包埋法、交联法和共价法。按照细胞固定化方式分：无载体固定化、有载体固定化（吸附法固定化、在聚合物载体内的包埋）及生长细胞的固定化。作用：固定化细胞在抗生素生产中的应用、果葡糖浆的生产、利用

50、固定化酵母进行啤酒的后发酵生产、固定化细胞应用于柠檬酸的生产25固定化细胞的分类及其特点无载体固定化、有载体固定化及生长细胞的固定化无载体固定化 固定化靠细胞自身絮凝作用实现；有时添加少量助凝剂促进细胞絮凝。优点：细胞密度高，絮凝条件温和，不损害细胞；缺点：机械强度极差，不能承受压缩或强的剪切作用，传递阻力大。有载体固定化 用于细胞固定化的载体可预先制备吸附固定化，也可在固定的同时制成包埋及微胶囊包埋技术。吸附法固定化 细胞的吸附固定化，可用无机载体或有机载体。优点：简单、满足细胞生理条件；缺点：吸附容量小，结合强度低。在聚合物载体内包埋 生长细胞的固定化预先培养细胞与聚合介质混合滴入凝固液中

51、轻轻搅动均匀分布有少量细胞的凝胶颗粒营养介质中培育被包埋的细胞生长至细胞密度增加1-2个数量级固定化生长细胞第五章名词解释：1 蛋白质工程蛋白质工程(protein engineering)：用生物技术改造Pr分子结构或编码Pr的基因，以获得更适合人类需要的Pr产品的技术。 2 内含子：introns 一个基因中的非编码DNA片段，阻断基因线性表达的序列3 外显子：真核细胞的基因在表达过程中能编码蛋白质的核苷酸序列4 结构域:在二级结构和三级结构间，还有一个结构层次，即结构域(domain).由a螺旋、b折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维空间结构实体。是Pr分子中一种基本的结构单位

52、。有些小分子只包含一个结构域，大部分Pr分子由若干个结构域构成。5 嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体，亦指染色体异常类型之一。有时也有同一器官出现不同性状的生物体的意思。6 ORF开放阅读框是基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止子打断。ORF的识别是证明一个新的DNA序列为特定的蛋白质编码基因的部分或全部的先决条件。6 盒式突变:盒式突变技术是1985年由Wells提出的一种基因修饰技术，它可经过一次修饰，在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，从而可以对蛋白质分子中某些重要氨基酸进行“饱和性”分析，大大缩短了误试分析的时间，加快了蛋白质工程研究的

53、速度7随机诱变:在突变位置上随机地引入一种突变。人们 通常用将基因克隆到质粒上，旁边有两个仔细选择紧密相连的限制性酶切位点，双酶解后产生一个3凹陷的末端和一个5凹陷末端：与克隆基因相邻的末端是3凹陷，而另一末端是5凹陷。简答题1 试述蛋白质的功能酶：催化生化反应；运动：肌肉收缩、精子移动、染色体移动；调节蛋白：DNA表达，生长分化，多细胞生物中细胞间的运动；抗体蛋白：抗细菌、病毒与真菌；神经细胞膜蛋白离子通道：神经冲动形成和传导；紫色硫细菌类囊体(膜蛋白)：能量转换光能化能血红蛋白：结合和释放氧；人体毛发和指甲(角蛋白);血栓：血纤蛋白单体聚合。2. 简述蛋白质工程的基本步骤。步骤：(1)分离

54、纯化、结晶目的蛋白，作X晶体衍射、核磁共振等，得到尽可能多的Pr空间结构信息。(2)详细研究目的蛋白功能，确定功能域。(3)分析Pr一级结构、空间结构和功能间的相互关系，找出关键基团和结构。(4)依关键基团和结构，提出改造方案，用基因工程实施。(5)测定改造后Pr的功能，确定改造效果。重复步骤(4)、(5) ，直至获得理想结果3 叙述蛋白质工程的改造策略与方法 策略：(1)疏水性AA出现在Pr的活性中心区域(2)定点突变时注意保守AA残基(3)保留潜在的N糖基化位点(Asn- X-Ser /Thr- X- Pro) 中的Asn、Ser或Thr(4)含内含子?的序列，可删除某一外显子?或外显子组

55、合，因单个外显子通常编码独立折叠的结构域?，删去该结构域可能不影响Pr其余部分的正确折叠(5)构建两个同源Pr的嵌合体?时，尽量使接合部位处在有相同或相近功能的AA序列中；两个非同源Pr组成嵌合体，应使接合部分尽量位于所预测结构边缘。 (6)目的蛋白三维结构未知时，在目的序列中随机插入六聚体接头鉴定功能性结构域。插入接头后，在原Pr序列中加两个AA，对Pr整体功能的破坏轻。 (7)缺失突变时，避免直接用天然的限制性酶切位点删除。以免破坏正确的ORF？，或得到的缺失突变体边界不能落在适当的位置，使Pr不能正确折叠。 改造方法按改造的规模和程度分：初级改造 个别AA的改变和一整段AA序列的删除、置

56、换或插入；高级改造 Pr分子剪裁，如结构域的拼接；从头设计合成新型Pr (难!)。 4 叙述M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术定点突变(1982，佐勒和史密斯)：环状噬菌体M13 DNA可以以单链形式在宿主细胞外存活，繁殖时进入细胞中，把单链DNA变成双链后进行DNA复制。复制出的单链DNA被包装成噬菌体释放到细胞外。单链M13 DNA可在体外复制成双链DNA。佐勒和史密斯：将拟改Pr目的基因重组到M13DNA单链中，以此为模板人工合成一段寡聚核苷酸(含拟改变碱基)作引物，在体外合成双链DNA。将杂合双链DNA转入大肠杆菌，复制出的M13双链DNA中一半含有已突变的目的基因(图5-2)。用DNA杂交或核苷酸序列分析筛选含突变目的基因的M13噬菌体，提取DNA，用限制性内