甲状腺乳头状癌miR―34b基因表达和其启动子区甲基化临床意义探究

1、甲状腺乳头状癌mir34b基因表达和其启动子区甲基化临床意义探究【摘要】目的：探讨mir-34b基因表达及其启动子 区甲基化（msp）在甲状腺乳头状癌（ptc）中的临床意义。 方法：收集2008年10月-2013年1月本院治疗的42例甲状 腺乳头状癌患者癌组织标本（实验组）和42例甲状腺腺瘤 患者瘤旁组织标本（对照组），检测两组mir-34bmrna表达 （实时定量pcr法）及mir-34b基因启动子区甲基化（甲基 化特异性pcr法），并对结果进行分析。结果：实验组mir-34b mrna相对平均表达量（0. 84±0. 04）, mir-34b基因启动子 甲基化阳性率71.4%,与

2、对照组比较，差异有统计学意义 （p0. 05）；而存在淋巴结转移甲基化率（88. 5%）显著高于 不存在淋巴结转移（43.8%）,差异有统计学意义（p2 cm共 23例；tnm分期结果：i期20例，ii期7例，iii期12例， iv期3例；发生包膜浸润14例，未发生包膜浸润28例；存 在淋巴结转移26例，无淋巴结转移16例。对照组中男17 例，女25例；年龄2473岁，平均（48.3±6.4）岁，w50 岁21例，50岁以上21例；所有标本均经组织病理学检查明 确诊断，所有标本在离体10 min内完成取材，置于液氮内 放入-80 °c冰箱内进行保存。本实验患者均签署知情同意

3、书。1.2实验方法1. 2. 1实验试剂及仪器 美国invitrogen公司生产的 trizol试剂盒及abi 7900ht pcr仪，日本tak-ara公司生 产的逆转录试剂盒，上海吉玛公司生产rt-pcr试剂盒，由 上海英骏生物工程公司所合成的pcr引物序列，美国zymo research 生物科技公司销售的 ez dna methylationtm -gold kit试剂盒。美国赛默飞世尔科技公司生产的forma88000超 低温冰箱，德国艾本德公司生产的centr辻uge 5810r高速 离心机，powerpac hc电泳仪（美国bio-rad公司），美国 thermo公司制造的nan

4、0dr0p 1000紫外分光光度计，凝胶成 像仪及凝胶数字成像系统（美国uvp公司）。1.2.2提取组织rna液氮研磨法：研磨新鲜组织成粉末 状，滴加trizol试剂进行混合，参照trizol试剂盒说明书 对组织总rna进行提取。成功提取后用紫外分光光度计（光 密度值260/280）对rna纯度进行检测，总rna在1.82.0 之间，保存于-80匸超低温冰箱中备用。1.2.3 检测 mir-34b mrna 表达 rt-pcr 法:参照 mirnas rt-pcr试剂盒以及逆转录试剂盒中所附说明书进行操作， cdna通过试剂盒内的通用逆转录引物进行合成。反应体系： primer.脱氧核糖核昔三

5、磷酸mixture及rna均为1 ul, dd h20为7 ul；反应条件：42 °c中作用60 min后72 °c 中作用10 mino以cdna为模板扩增pcr ,反应体系:10.0 ul pcr mix, 0.4 ul mir-34b 引物，2.0 u l c dna, 0.2 u l taq dna 多聚酶，7.4 n l dd h20；反应条件：95 °c 内 3 min预变性；95 i中作用12 s, 60 °c中作用60 s,共循 环40次。内参照为b-肌动蛋白mrna。1.2.4检测甲基化特异性pcr法检测：酚氯仿抽提法提 取 msp 组

6、织 dnao ez dna methylationtm -gold kit 试剂盒 修饰及纯化甲基化基因组dna。甲基化条件：15 min 95 °c, 30 s 95 °c, 30 s 54 °c, 40 s 72 °c,循环 35 次；非甲 基化条件：15 min 95 °c, 30 s 95 °c, 30 s 58 °c, 40 s 72 °c,循环35次。紫外线下观察分析pcr凝胶电泳情况(1% 琼脂糖)。甲基化引物序列片段长度为128 bp,上游 5-attcgtttcgtttcgcgttcgtttc-3 ,下 游5-ctaaaactaactctctcgaccccg-3。1.3观察指标 参照文献4应用2-aact法计算 mir-34b mrna的相对平均表达量，分析甲基化与