第二章基因工程重组DNA导入受体细胞

1、第三部分第三部分 重组重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞一、受体细胞一、受体细胞二、选择受体细胞的基本原则二、选择受体细胞的基本原则三、重组三、重组DNADNA导入受体细胞的方法导入受体细胞的方法1 1、转化概念、转化概念转化转化 ：DNA DNA 重组分子在体外构建完成后，必须导入重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组重组 DNA DNA 分子的转化（分子的转化（TransformationTransfo

2、rmation）。）。重组重组DNA DNA 人工导入受体细胞有许多方法，包括人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转化、转染、接合转染、接合以及其它物理手段，如受体细胞的电穿孔以及其它物理手段，如受体细胞的电穿孔和显微注射等，这些导入方法在和显微注射等，这些导入方法在 DNA DNA 重组技术中统重组技术中统称为转化操作。称为转化操作。一、重组一、重组DNADNA转化转化感受态：感受态：受体细胞最易接受外源受体细胞最易接受外源 DNA DNA 片段而实现转片段而实现转化的一种特殊生理状态。处于感受态的受体细菌，其化的一种特殊生理状态。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状

3、态的千倍以上，吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的遗传特性、遗传特性、菌龄、生理培养条件菌龄、生理培养条件等诸多因素的影响。等诸多因素的影响。2 2、细菌转化的步骤：、细菌转化的步骤：感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某受因子，其功能是与细胞表面受体结合

4、，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的膜上的 DNA DNA 结合蛋白和核酸酶等。结合蛋白和核酸酶等。转化因子的结合。受体菌细胞膜上的转化因子的结合。受体菌细胞膜上的DNADNA结合蛋结合蛋白可与转化因子的双链白可与转化因子的双链DNADNA结构特异性结合，单链结构特异性结合，单链DNADNA或或RNARNA双链双链RNARNA以及以及DNA/RNADNA/RNA杂合双链都不能结杂合双链都不能结合在膜上。合在膜上。转化因子的吸收。双链转化因子的吸收。双

5、链 DNA DNA 分子与结合蛋白分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中。另一条链则被吸收到受体菌中。整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链 DNA DNA 与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链合物前体结构，它能有效地保护单链DNADNA免受各免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体体DNADNA处。处。转化因子单链转化因子单链DNADNA的整合

6、。供体单链的整合。供体单链DNADNA片段通片段通过同源重组，置换受体染色体过同源重组，置换受体染色体DNADNA的同源区域，的同源区域，形成异源杂合双链形成异源杂合双链 DNADNA结构。结构。二、受体细胞二、受体细胞受体细胞受体细胞(receptor cell)：又称为宿主细胞又称为宿主细胞 (host cell)，是指能摄取外源，是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞并使其稳定维持的细胞感受态感受态(competence)：是指细菌吸收外源是指细菌吸收外源DNA的的生理状态。生理状态。感受态细胞感受态细胞(competence cell)：是指具有接受外是指具有接受外源源DNA能力的细

7、胞。能力的细胞。1 1、原核生物细胞的优点、原核生物细胞的优点大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源胞壁，便于外源DNADNA的进入。的进入。没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNADNA没有固定结合的蛋白质，没有固定结合的蛋白质，这为外源这为外源DNADNA与裸露的染色体与裸露的染色体DNADNA重组减少了麻烦重组减少了麻烦基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。对引入的外源基因进行遗传分析。原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致

8、性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。期短，重复实验快。原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也多是无特异性空间结构的多肽链。多是无特异性空间结构的多肽链。原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。链的糖基化或磷酸化等修饰作用。原核生物细胞内

9、源性蛋白酶易降解空间构象不正原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。2 2、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：3、被用作受体菌的原核生物：大肠杆菌、枯草杆、被用作受体菌的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。菌、蓝细菌等。大肠杆菌受体细胞大肠杆菌受体细胞大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载是基因

10、工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。体受体系统。优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素可导致人体热原反应。可导致人体热原反应。枯草杆菌受体细胞枯草杆菌受体细胞枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。优点：优点：枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加

11、工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。程菌。枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。遗传学背景清楚等优点。应用：已成功的用于表达人的应用：已成功的用于表达人的干扰素、白

12、细胞介素乙型干扰素、白细胞介素乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPIVPI抗原等。抗原等。蓝细菌（蓝藻）蓝细菌（蓝藻）蓝藻蓝藻又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(a(缺乏叶绿素缺乏叶绿素b)b)和藻胆素，具有光合系统和藻胆素，具有光合系统(PS)(PS) 和光合系统和光合系统(PS)(PS)、能进行光合作用，但它又、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具

13、微生物和植蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：物的优点，具体表现在：基因组为原核型，除了裸露的染色体基因组为原核型，除了裸露的染色体DNADNA外，不外，不含叶绿体含叶绿体DNADNA和线粒体和线粒体DNADNA，遗传背景简单，便于，遗传背景简单，便于基因操作和外源基因操作和外源DNADNA的检测。的检测。细胞壁属细胞壁属G G- -，主要由肽聚糖组成，便于外源，主要由肽聚糖组成，便于外源DNADNA的转化。的转化。营光合自养生长，培养条件简单，只需光、营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需、无机盐、水和适宜的温度就

14、能满足生长需要。要。多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。供了极好的条件。蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。锦上添花的效果。4 4、真核生物细胞、真核生物细胞真菌受体细胞真菌受体细胞真菌是低等的真核生物，其基因结构、表真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都具达调控机制以及蛋白质的

15、加工与分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。比拟的优点。酵母菌酵母菌酵母菌作为外源真核基因表达系统的优点酵母菌作为外源真核基因表达系统的优点酵母菌是结构最为简单的真核生物之一酵母菌是结构最为简单的真核生物之一, ,其基因表达其基因表达调控机理比较清楚调控机理比较清楚, ,遗传操作相对较为简单。遗传操作相对较为简单。具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌

16、属( (如酿酒酵母如酿酒酵母) )在仪器工业中有着几百年的应用历史，在仪器工业中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统。属于安全型基因工程受体系统。培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工等。的提取和加工等。动物细胞动物细胞常用的动物受体细胞有常用的动物受体细胞有HelaHela细胞、猴肾细胞和细胞、猴肾细胞和中国仓鼠巢细胞中国仓鼠巢细胞(CHO)(CHO)等。等。哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：能识别和除去外

17、源真核基因中的内含子，剪接能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的加工成成熟的RNARNA。真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰饰, ,产物具有较好的蛋白质免疫原性产物具有较好的蛋白质免疫原性, ,约为酵母细约为酵母细胞胞16-2016-20倍。倍。易被重组易被重组DNADNA质粒转染质粒转染, ,具有遗传稳定性和可重具有遗传稳定性和可重复性。复性。经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。中，便于提纯和加工，成本低。缺点是缺点是: :组织培养技术要求高，如培养和筛选组织

18、培养技术要求高，如培养和筛选一个高度扩增的转化子一个高度扩增的转化子CHOCHO细胞，通常需要数月细胞，通常需要数月之久之久, ,难度较大。难度较大。目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。因治疗等。常用的动物受体细胞有小鼠常用的动物受体细胞有小鼠L L细胞、细胞、HeleHele细胞细胞猴肾细胞

19、和中国仓鼠卵巢细胞猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(CHO)等。以动物等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点植物受体细胞植物受体细胞优点：全能性，优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。定遗传的植株或品系。 缺点：缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组胞壁，不利于摄取重组DNADNA分

20、子。分子。现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。式植物。 5 5、选择受体细胞的基本原则、选择受体细胞的基本原则便于重组便于重组DNADNA分子的导入。分子的导入。便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。于对重组体进行筛选。遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外

21、源基因的表达效率。对动物密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。培养基中进行培养。 受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。安全性高，安全性高，无致病性，不会对外界环境造无致病性，不会对外界环境造成生物污染成生物污染。一般选用致病缺陷

22、型的细胞。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞。或营养缺陷型细胞作为受体细胞。能使重组能使重组DNADNA分子稳定存在于细胞中。从受体细分子稳定存在于细胞中。从受体细胞的角度出发，通常的做法是对其作适当的修饰胞的角度出发，通常的做法是对其作适当的修饰改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就可以避免其对重组体细胞就可以避免其对重组DNADNA分子的降解破坏分子的降解破坏作用。作用。受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基具有较好的转译后加工机制

23、等，便于真核目的基因的高效表达。因的高效表达。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。6 6、受体细胞应具备的条件、受体细胞应具备的条件野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株通常应从以下几个方面加以考虑：通常应从以下几个方面加以考

24、虑：从安全性考虑，应具备以下条件：从安全性考虑，应具备以下条件：不适合在人体内生存不适合在人体内生存不适合在非培养条件下生存不适合在非培养条件下生存在非培养条件下，其在非培养条件下，其DNADNA容易解体容易解体它的它的DNADNA不易转移不易转移它的质粒只在这一宿主由复制它的质粒只在这一宿主由复制便于检测便于检测 从遗传性考虑：从遗传性考虑：重组缺陷型重组缺陷型recArecA，用于基因扩增或高效表达的用于基因扩增或高效表达的受体细胞（受体细胞（recArecA- -）限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免对外源对外源DNADNA的除解。外切酶和内切

25、酶活性缺陷的除解。外切酶和内切酶活性缺陷（recBrecB- -，recCrecC- -，hsdRhsdR- -） 与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选择标记互补的表型）载体选择标记互补的表型）具有较高的转化效率具有较高的转化效率 限制缺陷型限制缺陷型这是导致外源重组这是导致外源重组DNADNA转化或转导效率低下的主要转化或转导效率低下的主要原因之一。原因之一。应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞，以提高外源，以提高外源DNADNA分子的转化或转导效率。分子的转化或转导效率。进一步使修饰系统也发生

26、缺陷，则受体菌细胞既进一步使修饰系统也发生缺陷，则受体菌细胞既不能修饰，也不能限制外源不能修饰，也不能限制外源DNADNA分子，更便于重组分子，更便于重组DNADNA分子的多种基因操作。分子的多种基因操作。大肠杆菌的限制系统主要由大肠杆菌的限制系统主要由 hsdRhsdR 基因编码，因基因编码，因此具有此具有 hsdRhsdR- - 遗传表型的大肠杆菌各株均丧失了遗传表型的大肠杆菌各株均丧失了降解外源降解外源DNADNA的能力，同时大大增加了外源的能力，同时大大增加了外源 DNADNA的的可转化性。可转化性。重组缺陷型重组缺陷型进入野生型细胞的外源进入野生型细胞的外源DNADNA分子能自发地与

27、染色体分子能自发地与染色体DNADNA发生的体内同源重组反应由发生的体内同源重组反应由recrec基因家族的编码产物所控基因家族的编码产物所控制。制。RecARecA蛋白能促进蛋白能促进DNADNA分子之间的同源联会和分子之间的同源联会和DNADNA单链单链交换，交换，recArecA基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频率降低至率降低至10106 6。大肠杆菌的大肠杆菌的 recBrecB、recCrecC 和和 recDrecD 基因分别编码不同基因分别编码不同分子量的多肽链，三者构成一个在同源重组中的统一功分子量的多肽链，三者构成一个在同源重组中的统

28、一功能单位能单位RecBCDRecBCD蛋白（核酸酶蛋白（核酸酶V V），它具有依赖于），它具有依赖于ATPATP的双链的双链DNADNA外切酶和单链外切酶和单链 DNADNA内切酶双重活性。内切酶双重活性。recBrecB、recCrecC和和recDrecD基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型基因型为基因型为recArecA- -、recBrecB- -或或recCrecC- -等，有些大肠杆菌突变体等，有些大肠杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。菌株则将

29、三个基因同时失活。 转化亲和型转化亲和型可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其转化效率。还可以选择能够诱而提高其转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态细胞的菌株作为受体菌细导形成感受态细胞的菌株作为受体菌细胞。胞。遗传互补型遗传互补型遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。方能使转化细胞的筛选成为可能。遗传性状。方能使转化细胞的筛选成为可能。如在大肠杆菌

30、系统中，重组质粒载体上多含有如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有AMPAMP抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这种抗生素敏感。当重组种抗生素敏感。当重组DNADNA分子转入受体细胞后分子转入受体细胞后载体上的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特载体上的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特征，据此可以区分转化子与非转化子。征，据此可以区分转化子与非转化子。如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征可以直接筛选到外源基因表达的转的遗传特征可以直接筛选到外源基因表达的转化细胞。化细胞。 感染寄生缺陷型感染寄生

31、缺陷型相当多的细菌对其它生物尤其是人和牲畜具有相当多的细菌对其它生物尤其是人和牲畜具有 感染和寄生效应，重组感染和寄生效应，重组 DNA DNA 分子导入这些细分子导入这些细 菌受体中后，极有可能随着受体菌的感染寄生菌受体中后，极有可能随着受体菌的感染寄生 作用，进入生物体内，并广泛围传播，作用，进入生物体内，并广泛围传播，如果外源基因对人体和牲畜有害，则会导致一如果外源基因对人体和牲畜有害，则会导致一 场灾难，因此从安全的角度上考虑，受体细胞场灾难，因此从安全的角度上考虑，受体细胞 不能具有感染寄生性，当然，利用基因工程手不能具有感染寄生性，当然，利用基因工程手 段制造生物武器不在此例。段制

32、造生物武器不在此例。三、重组三、重组DNADNA导入受体细胞的方法导入受体细胞的方法转化转化(transformation):指感受态的大肠杆菌细胞捕指感受态的大肠杆菌细胞捕获质粒获质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒或以它为载体构建的重组质粒DNA分分子的过程。子的过程。转化子转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质经转化获得外源遗传物质的细胞。的细胞。转染转染(transfection):指感受态的大肠杆菌细胞捕获噬指感受态的大肠杆菌细胞捕获噬菌体或以它为载体构建的重组菌体或以它为载体构建的重组DNA分子的过程分子的过程转导转导(transduction):指病毒转移真核

33、细胞指病毒转移真核细胞DNA的过的过程或噬菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。程或噬菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。基因导入受体细胞方法基因导入受体细胞方法根据转移基因方法特性可分为：根据转移基因方法特性可分为：转化转化(transformation)(transformation)转导转导(transduction)(transduction)转染转染( (transfectiontransfection) )微注射技术微注射技术(microinjection)(microinjection)电转化法电转化法( (electroporationelectroporation) )基因

34、枪技术基因枪技术( (geneblastergeneblaster) )脂质体介导法脂质体介导法(liposome mediated transfer)(liposome mediated transfer)根据转移基因载体与受体的特性可分为：根据转移基因载体与受体的特性可分为：质粒载体导入受体细胞的方法：质粒载体导入受体细胞的方法：CaCl2、电转化、电转化法等。法等。噬菌体转染细胞的方法：噬菌体转染细胞的方法：体外包装感染法等。体外包装感染法等。DNA导入酵母菌的方法：导入酵母菌的方法：原生质体转化、电穿孔原生质体转化、电穿孔转化法等。转化法等。DNA导入植物细胞的方法：导入植物细胞的方法

35、：Ti质粒叶盘法、电穿质粒叶盘法、电穿孔转化法、基因枪法等。孔转化法、基因枪法等。DNA导入昆虫细胞的方法：导入昆虫细胞的方法：杆状病毒感染法等。杆状病毒感染法等。DNA导入哺乳动物细胞的方法：导入哺乳动物细胞的方法：磷酸钙共沉淀法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔转化法、脂质体介导法、基因枪法等电穿孔转化法、脂质体介导法、基因枪法等1、氯化钙转化法、氯化钙转化法大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞难。在基因工程研究和应用中，转化受

36、体菌细胞的正是根据人们需要构建的外源重组质粒的正是根据人们需要构建的外源重组质粒DNADNA分子分子而非来自供体菌的游离而非来自供体菌的游离DNADNA片段片段( (转化因子转化因子) )。因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性的方法之一是的方法之一是CaCa2+2+诱导的大肠杆菌转化法。诱导的大肠杆菌转化法。19701970年年M.MandelM.Mandel和和A.HigeA.H

37、ige发现发现, ,大肠杆菌大肠杆菌经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后, ,便能吸收便能吸收噬菌体噬菌体DNADNA。19721972年美国斯坦年美国斯坦福大学福大学 S.CohenS.Cohen报道报道, ,经氯化钙处理大肠经氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒杆菌细胞也能摄取质粒DNADNA。CaCa2+2+诱导转化原理：诱导转化原理：在在00的的CaclCacl2 2低渗溶液中，细菌细胞发生膨低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时胀，同时CaclCacl2 2使细胞膜磷脂层形成液晶结构使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离促使细胞外

38、膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。开来，诱导大肠杆菌形成感受态。CaCa2+2+能与加入的能与加入的DNADNA分子结合，形成抗分子结合，形成抗DNADNA酶酶( (DNaseDNase) )的羟基的羟基- -磷酸钙复合物，并黏附在细菌磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当细胞膜的外表面上。当4242热刺激短暂处理细热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为并随之出现许多间隙，为DNADNA分子提供了进入分子提供了进入细胞的通道。细胞的通道。 MgMg2+2+对对DNADNA分子有很大

39、的稳定性作用，因此利用分子有很大的稳定性作用，因此利用MgclMgcl2 2与与CaclCacl2 2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNADNA的转化效率。如利用二甲基亚砜的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)和二和二硫苏糖醇硫苏糖醇(DDT)(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高频等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化效率可提高感受态细胞的形成，转化效率可提高10010010001000倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，但该法要求条件高，对外界污染物极为

40、敏感，通常很少采用。通常很少采用。 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化转化如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋质粒质粒DNA可得可得51071109个转化子。个转化子。大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备：的制备：100ml菌体培养至菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体。离心收集菌体。 用用10 ml 冰冷的冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离溶液悬浮菌体，离心收集菌体。心收集菌体。用用1 ml 冰冷的冰冷的75 mM C

41、aCl2溶液悬浮菌体。溶液悬浮菌体。 冰浴放置冰浴放置12 - 24小时，备用小时，备用 。取取100 ml感受态细胞，加入相当于感受态细胞，加入相当于50 ng载体的载体的重组重组DNADNA连接液，混匀。连接液，混匀。冰浴放置半小时。冰浴放置半小时。 在在4242保温保温1.5 分钟（热脉冲）。分钟（热脉冲）。 快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 2 分钟。分钟。 加入加入1 ml 新鲜培养基，新鲜培养基，于于37培养培养 1 小小时（扩增）。时（扩增）。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。 获得合格的感受态细胞，要注意以下几

42、点：获得合格的感受态细胞，要注意以下几点：用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在一般在A600A600为为0.40.4左右为好。左右为好。制备受体细胞的整个过程要在制备受体细胞的整个过程要在0 044进行，并尽进行，并尽量避免污染。如果用抗生素筛选转化子，作为对照量避免污染。如果用抗生素筛选转化子，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。的受体菌应该在此培养基上不生长。为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液，如为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液，如FSBFSB溶液。溶液。CaCl2CaCl2法制备感受态细胞转化法制备感受态细胞转化DNADNA

43、时，低温的主要时，低温的主要目的是目的是: :（1 1）抑制细胞的旺盛生理代谢。）抑制细胞的旺盛生理代谢。（2 2）有助于）有助于DNA-Ca2+DNA-Ca2+吸附于细胞表面。吸附于细胞表面。（3 3）防止）防止DNAaseDNAase降解降解DNADNA。热休克温度是热休克温度是4242。目的是使细胞摄入吸附于其。目的是使细胞摄入吸附于其表面的表面的DNADNA。转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化子的出现，因此须设以下几种对照处理：化子的出现，因此须设以下几种对照处理：DNADNA对照处理。转化处理液中用对照处理。转化处理液中用0.2ml

44、0.2ml无菌水代替无菌水代替0.2m10.2m1感受态细胞，检验感受态细胞，检验DNADNA溶液是否染菌。溶液是否染菌。感受态细胞对照处理。转化处理液中用感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1mlNTE0.1mlNTE缓冲液缓冲液(500mM (500mM NaClNaCl，10mM 10mM Tris-HClTris-HCl，1mMEDTA1mMEDTApH8.0)pH8.0)代替代替0.1m1DNA0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染溶液，检验感受态细胞是否染菌。菌。感受态细胞有效性对照处理。在感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml0.2ml感受态细感受态细胞中加入胞中加入0.1

45、ml0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质已知容易转化这种感受态细胞的质粒粒DNADNA。 2、PEG介导的细菌原生质体转化介导的细菌原生质体转化革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组质粒或重组DNA分子分子 。酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转原生质体法进行转化化。PEGPEG是乙二醇的多聚物是乙二醇的多聚物, , 存在不

46、同分子量的多聚体存在不同分子量的多聚体, ,它可改变各类细胞的膜结构它可改变各类细胞的膜结构, , 使两细胞相互接触部使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组, ,此时相互此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能接触的两细胞的胞质沟通成为可能, ,从而造成细胞之从而造成细胞之间发生融合。间发生融合。细菌原生质体细菌原生质体的制备：的制备：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在为例：细菌需生长在高渗培养基高渗培养基中（如中（如34%的蔗糖的蔗糖溶液），并加入溶液），并加入甘氨酸甘氨

47、酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有中。与原生质体接触的所有器皿应保持器皿应保持无水无去污剂无水无去污剂。 细菌原生质体细菌原生质体的转化：的转化：取取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（的原生质体悬浮液（10108 8-10-109 9个原生质个原生质体），加入体），加入10 - 20 m ml DNA重组连接液，同时加重组连接液，同时加入含有入含有PEG1000和和Ca2+的等渗溶液，混匀。的等渗溶液，混匀。 细菌原生质体细菌原生质体的

48、再生的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。酸和微量元素。3 3、电转化、电转化电转化又称电穿孔法电转化又称电穿孔法(electroporation):是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上形成纳米大小的微孔，上形成纳米大小的微孔，DNADNA直接通过这些微孔或直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中，这种方法称

49、为电穿孔法。过质膜进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。最早用于将最早用于将DNADNA导入真核细胞导入真核细胞, ,1988年年,Dower等人成等人成功应用于大肠杆菌的转化。功应用于大肠杆菌的转化。基本原理是利用高压电基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道可逆的瞬间通道, ,从而促进外源从而促进外源DNADNA的有效吸收。的有效吸收。 将待转化的质粒或将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用

50、下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每这些参数，每g DNA可以得到可以得到1091010转转化子。化子。电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将电压增高或电脉冲时间延长

51、时，转化效率将会有所提高，但同时导致受体细胞存活率的会有所提高，但同时导致受体细胞存活率的降低，转化效率的提高也因此被抵消。降低，转化效率的提高也因此被抵消。用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备容易得多当细菌生长到对数中期后予的制备容易得多当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用低细胞悬浮液的离子强度，并用1010甘油重悬甘油重悬细胞，使其细胞浓度为细胞，使其细胞浓度为3 3l0l01010个个m1m1。分装，。分装，在干冰上速冻后置于在干冰上速冻后置于

52、 -70 -70 贮存。这样，每贮存。这样，每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6 6个个月以上。月以上。 电穿孔转化须在低温下电穿孔转化须在低温下(0-4)(0-4)进行，转化效进行，转化效率要比在室温下操作提高约率要比在室温下操作提高约100100倍。倍。 4 4、接合转化：、接合转化：接合（接合（ConjugationConjugation）：）：指通过细菌细胞之间指通过细菌细胞之间的直接接触导致的直接接触导致 DNA DNA 从一个细胞转移至另一从一个细胞转移至另一个细胞的过程。个细胞的过程。这个过程是由结合型质粒完成这个过程是由结合型质粒完成的，

53、它通常具有促进供体细胞与受体细胞有效的，它通常具有促进供体细胞与受体细胞有效接触的接合功能以及诱导接触的接合功能以及诱导 DNADNA分子传递的转移分子传递的转移功能，两者均由接合型质粒上的有关基因编码功能，两者均由接合型质粒上的有关基因编码是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNADNA转化方式适用于那些难以采用转化方式适用于那些难以采用CaCa2+2+诱导转化诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌。法或电穿孔法转化的受体菌。 非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体系所须的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿系所须

54、的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移。但如果宿主细胞中存在另外主细胞间自我转移。但如果宿主细胞中存在另外一种溶合性的接合型质粒（即辅助质粒）非接合一种溶合性的接合型质粒（即辅助质粒）非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用 接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移，因此难以作为基因工程载体使用。目前转移，因此难以作为基因工程

55、载体使用。目前常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的，接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的，故重组质粒故重组质粒DNADNA分子也不能直接接进行接合转分子也不能直接接进行接合转化。而只能通过其迁移作用来完成。化。而只能通过其迁移作用来完成。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。接合转化作用

56、，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到整个接合转化过程涉及到3 3种有关的细菌菌株种有关的细菌菌株即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNADNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，因此称为三亲本杂交接合转化法。助菌，因此称为三亲本杂交接合转化法。5 5、重组、重组噬菌体噬菌体DNADNA分子转导大肠杆菌分子转导大肠杆菌 转染：转染：将重组将重组噬菌体噬菌体DNADNA分子直接导入受体分子直接导入受体细胞中的过程，称为转染。细胞中的过程，称为转染。 将重组将重组噬菌体噬菌体DNADNA分子导入大肠杆菌受

57、体细分子导入大肠杆菌受体细胞的常规方法是转导操作。胞的常规方法是转导操作。转导转导(transduction)(transduction)：指通过指通过噬菌体噬菌体( (病毒病毒) )颗粒感染宿主细胞的途径把外源颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNADNA分子转移分子转移到受体细胞内的过程。到受体细胞内的过程。 具有感染能力的具有感染能力的噬菌体颗粒除含有噬菌体颗粒除含有噬菌噬菌体体DNADNA分子外，还包括外被蛋白。分子外，还包括外被蛋白。以噬菌体颗粒感染受体细胞，首先必须对重以噬菌体颗粒感染受体细胞，首先必须对重组组噬菌体噬菌体DNADNA分子进行体外包装分子进行体外包装 。体外包装，是指在体

58、外模拟体外包装，是指在体外模拟噬菌体噬菌体DNADNA分子分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组过程，将重组噬菌体噬菌体DNADNA分子包装为成熟的分子包装为成熟的具有感染能力的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。噬菌体颗粒的技术。 基本原理：基本原理：根据根据噬菌体噬菌体DNADNA体内包装的途径体内包装的途径分别获得缺失分别获得缺失D D包装蛋白的包装蛋白的噬菌体突变株和噬菌体突变株和缺失缺失E E包装蛋白的包装蛋白的噬菌体突变株。这两种突噬菌体突变株。这两种突变株均不能单独地包装变株均不能单独地包装噬菌体噬菌体DNADNA，但将它，但将它

59、们分别感染大肠杆菌，从中提取缺失们分别感染大肠杆菌，从中提取缺失D D蛋白的蛋白的包装物（含包装物（含E E蛋白蛋白) )和缺失和缺失E E蛋白的包装物蛋白的包装物( (含含D D蛋白蛋白) )，两者混合后就能包装，两者混合后就能包装噬菌体噬菌体DNADNA。 噬菌体噬菌体DNADNA体外包装的主要过程体外包装的主要过程 制备包装物。制备包装物。 须培养两种溶原菌须培养两种溶原菌 诱导溶菌生长诱导溶菌生长 收集和贮存包装物。收集和贮存包装物。 体外包装。体外包装。 制备制备噬菌体噬菌体DNADNA混合液。混合液。 第一次包装。包装物刚融化时，细胞发生破裂，释放出第一次包装。包装物刚融化时，细胞

60、发生破裂，释放出包装物可立即用于包装。包装物可立即用于包装。 第二次包装。进行第二次包装，可提高包装效率第二次包装。进行第二次包装，可提高包装效率2 25 5倍倍，加入蛋白酶可降低包装反应液的黏度，便于包装反应，加入蛋白酶可降低包装反应液的黏度，便于包装反应的进行。的进行。 去除细胞屑。第二次包装后，在反应液中加入去除细胞屑。第二次包装后，在反应液中加入SMSM溶液溶液 （噬菌体稀释缓冲液：（噬菌体稀释缓冲液：100 mmol/L NaCl,100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L 10 mmol/L MgSOMgSO4 4, , 50 mmol/L Tris-HCL pH7.5)