牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定

1、牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定摘要：牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原 体，该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病，给世界养牛 业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪 便中分离得到一株病毒能使mdbk细胞产生细胞病变，经rt-pcr检测 及扩增产物测序进一步证实，该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒， tcid50测定该病毒的滴度为107. 15tcid50/mlo该病毒株的分离鉴定 为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。关键词：牛病毒性腹泻-粘膜病病毒；分离；鉴定中图分类号：s852. 65+3文献标识号:a文章编

2、号:1001-4942 (2013) 02-0041-04牛病毒性腹泻-黏膜病 (bovine viral diarrhea-mucosal disease, bvd-md)是rh牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, bvdv)感染而引起的一种重要传染病，临床上以发热、腹泻、 黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染与免疫耐受、免疫抑制、怀 孕母牛流产、产死胎和畸型胎以及致死性黏膜病为主耍特征1, 2。 该病呈世界性分布，广泛存在于美国、澳大利亚、英国、新西兰、匈 牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度等国家3 o bvdv不仅可感染牛， 也能感染绵羊、山羊、猪、鹿

3、和其它反刍动物。1946年美国人olafson 等首次发现并分离出bvdv, 1983年我国李佑民等首次从流产胎儿的 脾脏中分离到bvdvo bvdv属于黄病毒科(flaviviridae),瘟病毒属 (pestivirus),与猪瘟病毒(classical swine fever virus, csfv) 和绵羊边界病毒(border disease vims, bdv)同属，存在抗原相 关性，在血清学上存在着交叉反应，而且能够突破彳首主特异性发生交 叉感染4。根据bvdv病毒基因组5,端非翻译区 ntr)序列比 较,把bvdv分为牛病毒性腹泻病毒i型(bvdv- i )和牛病毒性腹泻 病毒

4、i型(bvdv-ii) 5, 6o根据bvdv可否使体外培养的传代上皮细胞发生病变效应，可分为两个生物型(biotype)：致细胞病变型 (cytopathic, cp)和非致细胞病变型(noncytopathic, ncp) 7。两种生物型的病毒虽然与宿主细胞的作用不同，但bvdv只有一种血 清型。bvdv感染情况复杂，持续性感染个体症状隐蔽。动物带毒率 高，特别是bvdv严重影响感染动物的繁殖，因此给全球畜牧业造成 了巨大的经济损失8。因而被世界动物卫生组织(0ie)列为发病必 须上报的动物传染病2。本研究采集山东省某牛场发生严重腹泻症 状的病牛的粪便，并对其进行了分离和鉴定，bvdv山东

5、株的获得为 bvdv疫苗的研究奠定了基础。1材料与方法1. 1材料牛肾细胞(mdbk )由山东省农业科学院奶牛研究中心实验室保 存；dna marker dl2000购于上海生工生物工程技术服务有限公司； dmem细胞培养基、新生马血清、胰蛋白酶为hyclone公司生产；minibest viral rna/dna extraction kit, takara pimescripttmrt-pcr kit, lataq 酶,dntp,rna酶抑制剂，均购于宝生物工程(大连)有限公司。病料样品为山东省某牛场发生严重腹泻症状的 病牛的粪便。1.2病毒培养1. 2. 1病料的处理取腹泻奶牛粪便，用p

6、bs (含10%双抗)1 ： 5 稀释。3 000 r/min离心10 min,得到的上清液经0.22 u m滤膜过 滤除菌后得到病料处理液。1. 2. 2病毒的接种选择生长旺盛的mdbk单层细胞,弃去营养液。 按细胞培养瓶1%的量接种病料处理液后37°c感作1 h,弃去感作液， 加入维持液(2%新生马血清的dmem)于5%c02、37°c培养。12 h观 察细胞病变，培养24 h后收毒。细胞毒反复冻融3次后再次接种mdbk 细胞，如此传3代，收获的细胞毒用于其它试验。1. 3rt-pcr鉴定及序列测定分析1.3. 1引物的设计合成根据已发表的bvdv nadl株、0sloss株、 orengon c24