微生物A实验学生用

1、实验一 环境中微生物的检测一、实验目的1、了解环境中微生物的分布状况。2、学习常见环境中微生物的检测方法。3、体会无菌操作的重要性。4、初步认识微生物的菌落。二、实验原理 微生物“无处不在”，但肉眼看不到，要想验证微生物的存在，就需要把被检测的样品接种到适合它们生长的环境（培养基上）进行培养，经过一定时间的培养，如果被检测的样品或环境中有微生物存在，便会在培养基表面形成肉眼可见群体，即菌落。三、实验器材 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；培养器皿：无菌培养皿；酒精灯、记号笔、培养箱等。四、实验方法（一）平板培养基的制备1、融化培养基2、按无菌操作倒平板，倒10ml左右，放平凝固后即制作完毕。（二

2、）、微生物检测 1、贴标签于平板培养基底部，标签注明：检测项目、班级、小组。2、检测项目与检测方法 空气中微生物检测：在检测环境中，打开培养皿盖在空气中暴露3min。 手指上微生物检测：按无菌操作，用手指触摸平板培养基。 头发上微生物检测：取短头发一根放至平板培养基上。4）对照3、培养：将上述检测培养皿及对照培养皿倒置于28恒温箱培养35天。4、观察结果并将各环境检测的结果，填入表内表1、不同检测环境检出的微生物菌落数 菌落数（个）检测项目总菌落数细菌放线菌霉菌思考题：（二选一）1、 通过本次实验，说出你对微生物分布的认识及无菌操作的重要性。2、 通过观察，写出你对细菌菌落、霉菌菌落特征的认识

3、。实验二 细菌的简单染色与油镜的使用一、实验目的1、掌握油镜的工作原理、使用方法和保养技术。2、掌握细菌简单染色的技术。二、实验原理显微镜的分辨力D为看清两点间最小距离。公式：D=/2N·A。与光的波长（）和数值孔径（N·A）有关。N·A=n·sina/2，n为物镜与玻片标本间媒介的折射率，为镜口角，即被观察的物体与镜筒的夹角。油镜放大100倍，它与其他物镜不同的是，观察时镜头与玻片标本间媒介是一层油质，常选用香柏油，香柏油的折射率为1.54，另外，镜口角也增大，结果看清两点间距离更小，即放大倍数增大。细菌无色透明，个体微小（0.5-1um）,要想看清细

4、菌形态必须染色后在油镜下观察。简单染色是只用一种染料使细菌着色，染色目的就是为了观察细菌形态。三、实验器材显微镜、枯草杆菌（细菌菌种）、结晶紫或蕃红、载玻片，蒸馏水、接种环、酒精灯、香柏油、擦镜纸、无水乙醇、洗瓶、废液缸。四、实验方法（一）细菌简单染色片的制备1、涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，注意取菌不要太多。2、干燥：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰23次固定（以不烫手为宜）。不能将玻片在火上烤，否则细菌形态毁坏。4、染色：将固定过的涂片水平放置，滴加染色

5、液覆盖于涂菌处，染色约12min。5、水洗：用水洗去涂片上的染色液。6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸轻轻吸干，注意不要擦掉菌体。（二）细菌形态观察（观察细菌染色片）要求：1、规范使用显微镜。2.在油镜下观察到细菌细胞形态。1、正确放好显微镜，端正坐姿。2、调节光源：在低倍物镜下，将光线调至视野内均匀明亮。3、低倍镜观察染色片按规范操作，在低倍镜下对好焦距找到清晰的物象（片状、线状、点状分布的染色物）。注意：低倍镜是看不清细菌细胞特征，需继续在油镜下看。4、直接向玻片上滴加一滴香柏油。5、油镜下观察从侧面注视，小心慢慢地将油镜物镜转至正下方，此时油镜物镜已浸入油滴中，规范操作，在油

6、镜下观察细菌的形态并绘图。（四）油镜的保养技术去掉玻片，先用擦镜纸将油镜头上的油擦去，用擦镜纸沾少许无水乙醇将镜头擦23次，再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。看后的染色装片用废纸将香柏油擦干净后放回废玻片存放处。五、实验作业1、绘出所观察的细菌形态图2、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意什么？实验三 革兰氏染色法一、实验目的掌握革兰氏染色法的原理和方法。二、实验原理革兰氏染色法是根据细菌细胞壁结构和成分的不同，通过固定的染色程序，可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类的一种实验室常用的染色，是细菌学上最常用的鉴别染色法。三、实

7、验器材1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌2、染色液和试剂：结晶紫、番红、95%乙醇、卢戈氏碘液、无水乙醇、香柏油3、显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、酒精灯、洗瓶、废液缸等。四、实验方法（一）制片 1、涂菌：取干净载玻片一块，在载玻片的中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，注意取菌不要太多。2、干燥：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰23次固定（以不烫手为宜）。不能将玻片在火上烤，否则细菌形态毁坏。（二）染色 1、初染：在玻片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。 2、媒染：滴加卢戈氏

8、碘液，1min后水洗。 3、脱色：滴加95%乙醇脱色30s，水洗。 4、复染：滴加番红染液染色23min，水洗。 5、用吸水纸吸干或自然晾干，油镜镜检。（三）油镜观察与绘图革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。注意：写明两种菌的革兰氏染色特点。（四）油镜保养五、实验作业 1、绘出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌形态图。 2、革兰氏染色法中那一步是关键？ 实验四 霉菌、酵母菌形态观察一、实验目的1、自制水玻片观察霉菌、酵母菌的形态特征。2、学习如何观察已知霉菌的分类特征，掌握对未知霉菌怎样进行初步鉴定的方法。二、实验原理霉菌是丝状真菌，菌体呈丝状，菌体的基本单位是菌丝。霉菌的菌丝有分化，如，营养菌丝

9、分化成假根、吸器等，气生菌丝分化形成子实体。不同霉菌的子实体的形成不同，它们是真菌分类的重要依据，本实验的目的就是观察不同霉菌如：青霉、曲霉、根霉它们的菌丝分化特征。三、实验器材 观察菌株：根霉、青霉、曲霉、酿酒酵母。蒸馏水、载玻片、盖玻片、解剖针、显微镜、95酒精、擦镜纸。四、实验方法（一）制水浸制片观察霉菌  在载玻片上滴加一滴蒸馏水，用解剖针从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢子的霉菌菌丝，放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片，先用低倍镜，必要时转换高倍镜观察并绘图。根霉：观察假根、匍匐枝、孢子囊梗、孢子囊、孢子的形状与特征。青霉：观察分生孢子梗、梗基与

10、小梗、分生孢子的形状与特征。曲霉：观察分生孢子梗、顶囊、小梗、孢子的形状与特征。2、酵母菌观察：在载玻片上滴加一滴蒸馏水，用接种环从生长有酵母菌的平板中挑取少量酵母菌，放入载玻片上的液滴中，使其悬浮，盖上盖玻片，先用低倍镜，必要时转换高倍镜观察并绘图。酵母菌：卵圆形细胞、出芽生殖。五、实验作业给出根霉、青霉、曲霉酵母菌的个体形态图，并注明各部位名称。实验五 培养基的制备与灭菌一、实验目的1、掌握培养基制备的原理和方法。2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和方法二、实验原理培养基即人工配制的适合不同微生物生长繁殖和积累代谢产物的营养基质。不同的微生物对营养需要不同，在培养基配置时一定要根据微生物的需求加入

11、适合的碳源、氮源、无机盐和水。培养基配好后必须经过灭菌方能使用。高压蒸汽灭菌是制备培养基常用的灭菌方法，其原理是在密闭条件下提高锅内水蒸汽的压力来提供温度，达到在短时间内的灭菌效果。当锅内蒸气压力在0.103MPa时，相对应的温度为121，可在30min内杀死包括芽孢在内的所有微生物。三、实验器材 电磁炉、锅、瓷量杯、天平、玻璃棒、试管、三角瓶、棉花、手提式高压灭菌锅等。四、实验方法（一）称量：按照培养基配方准确称取各成分。1、马铃薯蔗糖琼脂培养基马铃薯200g 、蔗糖20g、 琼脂20g、水1000mL，pH66.4 2、牛肉膏蛋白胨培养基牛肉浸膏3g、蛋白胨10g、NaCL5g、琼脂 20

12、g、 水1000mL，pH7.07.23、高氏1号培养基可溶性淀粉20g、 KNO3 1g、 NaCl 0.5g、 KH2PO4 0.5g、 MgSO4 0.5g、FeSO4 0.01g、 琼脂20g 、水 1000mL，pH7.27.4（二）熬制 定量取水放入锅内加热，加热琼脂溶化，然后加入称量的其它药品，待溶化呈糊状后，补水定容。（三）调节pH 将前面熬制好的培养基趁热进行pH调整。用配值好的10%HCl和NaOH来调节PH值。（四）分装 根据需要将培养基分装在试管和三角瓶内，试管分装量为试管高的五分之一。三角瓶分装适量。分装时不要将培养基粘在管口。（五）塞棉塞及包扎 做棉塞的目的是过滤空

13、气，防止杂菌侵入，因此棉塞应做得松紧、大小合适。包扎就是用双层报纸把试管、三角瓶的棉塞包起来，防止灭菌时把棉塞打湿，一般试管10个包一捆。（六）高压蒸汽灭菌1、加水 关好排水阀门放入清水至标度为止或水要淹没电阻丝。 2、装锅 将要灭菌物品放入内套锅，装有培养基的器皿要口朝上垂直放，排气管插入内套锅的槽子内，平衡旋紧螺旋并关掉放气阀，防止漏气，造成难以升压。3、通电灭菌过程的管理 通电后很快锅内水沸腾产生水蒸汽，压力表指针开始移动，当指针升至0.05MPa时，慢慢打开放气阀排空气，压力回零后，关放气阀继续加热升温，当压力表指针升至0.103MPa时，此时锅内蒸气温度为121，控制电源保证锅内温度

14、不低于121，维持30，达到灭菌效果，断开电源。4、降温降压过程 断电后随锅体温度下降水蒸气冷凝，压力表自然回零。也可放气回零，但放气降压回零，一定要谨慎操作。（七）摆斜面 灭菌结束后（压力表指针回零），开锅盖取出物品，制备固体斜面培养基时，则应趁热将试管斜放在桌上，冷却后便呈斜面。（八）无菌检查 五、实验作业1、培养基配好后，为什么要立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2、培养基为什么要采用高压蒸汽灭菌？3、灭菌过程为什么要排空气？实验六 微生物的接种技术一、实验目的学习和掌握斜面接种，要求做到操作技术规范化。二、实验原理接种就是将一定量的纯种微生物在无菌操作的条件下转接到新鲜培养基上

15、的过程。常用的接种方法有斜面接种、液体接种、平板接种、固体接种、穿刺接种等。常采用的接种工具有：接种环、接种钩、吸管、接种锄等。接种过程一定要严格进行无菌操作，防止污染。三、实验器材1、菌种：枯草杆菌、平菇菌种。2、材料：PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、接种针、接种环、无菌吸管、70酒精、酒精灯、超净工作台。四、实验方法1、接种前的准备工作 提前30min打开超净工作台、放好菌种、培养基、接种工具、酒精灯等。2、贴标签：标签上写明菌种名称、接种日期、接种人姓名，贴在要接种的培养基上。注意：枯草杆菌与牛肉膏培养基对应，平菇菌种与PDA培养基对应。3、按无菌操作接种1）点燃酒精灯；2）用70酒精

16、对手、接种工具消毒；3）接种工具在酒精灯火焰上灭菌；4）拿起菌种和培养基、松动棉塞；5）左手拿试管，右手拔下棉塞，并将试管口封在酒精灯火焰的无菌区；6）右手拿接种工具再次灭菌；7）将灭过菌的接种工具迅速伸入菌种试管，稍微冷却后取少量菌种放在新鲜培养基上。真菌接种菌种放在培养基中央，细菌接种要在培养基表面划曲线；8）塞上棉塞，烧死多余的细菌。五、实验作业1、每位学生结两支斜面培养基，根据接种情况打分。2、微生物接种时有哪些环节造成污染？怎样避免污染。实验七 细菌鉴定中常用的生理生化反应一、实验目的了解细菌鉴定中常用的生理生化反应试验法及其原理。二、实验原理 能区分细菌的外表特征太少，因此在细菌鉴

17、定中常需采用一些生理生化反应进行辅助鉴定。菌体内某种酶的有无及的差异就表现为对同种底物的利用或代谢产物的不同。1、糖发酵试验 根据细菌分解利用糖能力的差异，表现出是否产酸和产气的现象可作为鉴定菌种的依据。在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫，其变色范围在5.26.8，pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。2、淀粉水解试验 检查菌种是否产生淀粉酶，如产淀粉酶，淀粉酶就会把菌种周围的淀粉水解，用碘液检验在菌种周围会形成透明圈。三、实验器材1、菌种：大肠杆菌，产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌的斜面菌种。2、培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基，蛋白胨水培养基，

18、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖、蔗糖）3、试剂：40NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6臭甲酚紫指示剂。4、器材：超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、试管、移液管、杜氏小管。四、实验方法（三）糖发酵试验1、试管标记：取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各3支，每种糖发酵试管上，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌和空白对照。2、接种培养：按无菌操作，首先向糖发酵试管中加入指示剂溴甲酚紫，在分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌，空白对照不接种。置37恒温箱中，培养2472小时。3、观察记录：与对照相比，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用这种糖，用“”表示；若呈黄

19、色，表明该菌能利用这种糖代谢产酸，其反应结果为性，用“”表示。若培养液中杜氏小管内有气泡为阳性反应，用“”表示，表明该菌能利用这种糖，代谢产气；若培养液中杜氏小管内没有气泡，表明该菌不能利用这种糖产气，反应结果为阴性，用“”表示。（二）淀粉水解试验 1、接种与培养：制备淀粉铵盐平板培养基，接种大肠杆菌与枯草杆菌，两个菌种接种点相距2cm,接种后28°C培养，72小时观察结果。2、观察记录 向平皿内滴加碘液，观察在菌种周围的透明圈。（三）V.P试验1、试管标记：取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌和空白对照。2、接种培养：按无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，

20、空白对照不接种。置37恒温箱中，培养2448小时。3、观察记录：1）取出作V.P反应的试管，振荡2分钟。取等数的空白试管分别标记相应的菌名，然后对应加入35mL，这批试管留作甲基红试验。2）向作V.P反应的试管中加入40NaOH溶液1020滴，并用牙签挑入约0.51mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37恒温箱中保温1530min，若培养液为红色，表示V.P反应为阳性，用“”表示；若培养液不呈红色，表示V.P反应为阴性，用“”表示。（四）甲基红试验（M.R.试验）向做甲基红试验的培养液中，分别沿管壁加入23滴甲基红指示剂，若培养液上层变成红色，即为阳性反应，若仍呈黄色，则为阴性反应。

21、五、实验作业1、细菌生理生化试验测定结果试验项目V.P反应甲基红试验糖发酵试验葡萄糖乳糖蔗糖大肠杆菌产气肠杆菌空白2、记录淀粉水解试验的结果实验八 微生物的纯系分离一、实验目的 掌握从土壤中分离获得放线菌菌株纯培养的原理和方法。二、实验原理纯培养是指微生物单细胞繁殖而来的后代。在自然界微生物是处于混杂状态，要想得到某种微生物的纯培养，必须进行纯系分离。从土壤中分离某种微生物的纯培养，通常采用平板稀释分离法。在稀释分离时为了抑制其它杂菌的生长，达到分离效果，还可根据该微生物对营养、酸碱度、温度及对抗生素的敏感性等条件加以控制。三、实验器材 高氏一号培养基，无菌培养皿，无菌水、土样，天平，刮铲，培

22、养箱等四、实验方法（一）土壤稀释液的制备  准确称取土样品l g，放入装有99mL无菌水的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡15 min，使微生物细胞分散，静置20-30秒，即成10-2稀释液。配制l0-3土壤稀释液：用1mL无菌吸管，吸取10-2稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成l0-3稀释液。以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液。选用哪一种稀释梯度根据土壤含菌量，我们选用10-4、10-5。2、平板接种与涂布 1）预制高氏一号平板培养基并编号。2）接种：取无菌吸管从高稀释度做起，按无菌操作吸取0.1mL菌

23、液接种在无菌平板上，每个稀释梯度重复三皿。3）涂布：按无菌操作，用无菌刮铲将0.1ml土壤菌液在平板上涂抹均匀。注意先涂抹高稀释度再涂抹低稀释度。3、28恒温箱倒置培养。4、结果观察分离结果，根据菌落分布情况确定是否进行平板划线进行进一步纯化。5、平板划线分离法 挑取待纯化的培养物在琼脂平板培养基上进行连续划线，在划线过程中微生物数量逐渐减少，培养后，观察是否出现单菌落。6、纯培养的接种。将单菌落接种到斜面培养基上。五、实验作业 1、对你所做的实验结果进行描述。2、为什么要将培养皿倒置培养？3、放线菌生长的最适pH7.2，但分离所用的培养基pH为8.08.5，为什么？实验九 微生物细胞计数一、

24、实验目的学习血球计数板的构造、计数原理，掌握血球计数板的计数方法。二、实验原理血球计数板是一块特制的厚型载玻片，有两个完全相同的计数室（区域），计数室的面积为l mm2，计数区的高度为0.1m，所以每个计数室的体积为0.1mm3。计数室充满菌悬液，菌液量为0.1mm3。为了计数方便，计数室分呈25个中方格，没个中方格又分为16个小格，计数室总计有400个小格。公式：菌数/mL=小方格平均菌数×400×10000×菌液稀释倍数 菌数/mL=中方格平均菌数×25×10000×菌液稀释倍数三、实验器材 酵母菌菌悬液、血球计数板、显微镜、滴管

25、、擦镜纸等。四、实验方法 1、待测菌悬的稀释 按倍稀释，以每小格的菌数可数为度。2、显微镜下镜检计数室。3、加样 先用干净的盖玻片覆盖一个计数室，将酵母菌悬液摇匀，用玻棒取少许菌悬液，从盖玻片与计数室接触的边缘加入，靠毛细管作用，让利用液体的表面张力充满计数区。4、计数 按五点取样法（四个角及中央），计数五个中方格中的菌数，然后求平均数。如菌体位于双线上，计数原则是计上不计下，计左不计右，以减少误差。对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2次，每次数值不应相差过大，否则应重新操作。5、血球计数板的清洗 用水将血球计数板冲洗干净，洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。五、实验作业：1、将实验结果填入下表中： 计数次数中方格菌数中方格平均菌数稀释倍数每毫升菌数12345 第一次                 第二次