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文档简介

1、alzheimer病的早期诊断和指标规范化研究项目申请书编写提纲一、立项依据和目标1. 本课题研究意义及同类研究工作国内外研究现状、知识产权状况与存在 问题人口老龄化成为一个全球性现彖,在全世界186个国家和地区屮,冇1/3 以上的国家和地区己进入“老年型”社会,中国的某些城市也已进入了 “老年 型”社会。据联合国佔计,1950年,全世界60岁以上的老年人约有2亿,1970 年达到3亿,2000年达到6亿。2020年将达到10亿,2050年,全球将有近20 亿的老年人。目前世界绝大多数老年人口生活在亚洲3. 38亿,中国60岁及以上 老年人口 1.34亿,占世界老年人口的21.34%,占亚洲老

2、年人口的39. 7%, 2050 年,亚洲老年人口将增长到12. 27亿,中国老年人口将超过4亿,占全国总人口 的30%,比口前法、德、意、日、英五国的总人口述要多。随着人口的老年化, 老年人的相关问题将r渐突出,如老年人生活问题、医疗保健和社会保障问题, 这些问题的有效处理直接关系到国民经济发展和社会稳定。近年来多数调查结果显示,在欧美国家,60岁以上老年人6%12%发生痴呆, 85岁以上的老人则有20%40%发牛痴呆,其中半数以上为老年性痴呆。在全球约 有超过2000万的人患有该病,痴呆发病率随着年龄的增长而成倍上升,年龄每 增长5岁,发病率即增长一倍。在65岁以上的年龄段中,老年痴呆的发

3、病率约 为5%;超过85岁,发病率增加到25%; 95岁以上的人群当中高达60%。我国流 行病学资料表明:55岁以上老人痴呆症总患病率为2.9%, 65岁以上人口屮痴呆 症总患病率为5. 22%o其中,60-69岁人群中老年痴呆症的发病率为2. 3%, 70-79 岁为3.97%, 80岁以上为32%。我国现有65岁以上人口 9610万,估算全国共有 各类痴呆症患者500万,老年痴呆占2/3之多,2050年,痴呆患者将增加到2000 万,与目前全球痴呆人数持平。这是中国未來几十年将面临的严峻问题,医务人 员和相关专业人员对这个问题应引起高度的重视,在疾病的早期诊断和干预方而 做些深入的研究。阿

4、尔茨海默病(alzheimer, s disease, ad)是老年痴呆的最常见原因,它是 一种原因不明的、进行性的、中枢神经系统的退行性疾病,其特征性病理改变为 大脑皮层及脑区的纤维蛋口沉积,即细胞外间隙的b淀粉样蛋口 ( p -amyloid, ab )和细胞内多聚tau蛋白的沉积,两者在病理形态学上分别表现为老年斑(sp) 和神经纤维缠结(nft) o ad患者的最终结局痴呆,当出现明显痴呆时,临床诊断 没有多大困难,但此时病情已无法逆转,失去了治疗时机。最近有研究者提出从 正常老年发展成ad痴呆是连续的过程,纽约大学医学院barry reisberg博士把 这个连续过程分为七个期:st

5、age 1一止常增龄期(nonned ageing), stage 2 极轻微认知损害期(very mild cognitive impairment), stage 3一轻微认知损 害期(m订d cognitive impairment), stage 4一中度认知损害期(moderate cognitive impairment), stage 5中等严重认知损害期(moderately severe cognitive impairment), stage 6一严重认知损害期( severe cognitive impairment), stage 7一极严重认知损害期(very sev

6、ere cognitivc impairment)o正常增龄期,其记忆能力与年龄和教育水平相对应,既无主观记 忆减退的体验,也无客观的认知损害;极轻微认知损害期,个体有主观记忆减退 的症状,如忘记熟悉的字或人名,或常找不到钥匙、眼镜或其它常用物品,朋友、 家人或同事还没有注意到记忆问题,医学检查无异常发现,这些现象可能是增龄 相关改变,也能是ad最早期的症状;轻微认知损害(mci)期,冇主观记忆困难, 朋友、家人或同事能发现其记忆缺陷,医学检查或心理测试发现有记忆缺陷的证 据,其它认知功能和社会功能没有明显的缺陷,有这些症状的老年人三年后有半 数发展成ad,许多研究者把mci看着临床前期ad;

7、中度认知损害期,即临床早 期ad,除记忆损害外,还有其它认知功能损害,如执行功能、推理能力和计算 能力等方而的损害,iq70,社会适应能力受损;以后各期认知损害更加明显。 zaudig m认为从正常增龄到ad是一个连续谱,可以人为地分为儿个期:正常增 龄期、无症状ad期、主观记忆减退期、轻度认知损害期(轻、屮、重)、ad痴 呆期,如下图所示。mci和ad的关系虽然没有最后定论,但多数研究者认为mci是止常老化与 ad的过度期,bozoki a等人研究发现每年冇4%-25%的mci发展成痴呆,但多数 随访研究发现每年有10%-15%的mci发展成痴呆,所以多数研究者把mci看着临 床前期ad。在

8、无症状ad期,部分病人未经特殊治疗,可能会自发逆转;在主观 记忆减退期和轻度认知损害期,经合理冇效治疗,部分病人口j能会逆转;进入痴 呆期后,即使积极治疗,也无法使病情逆转,但能延缓疾病的进程。由此看來, ad的早期诊断对指导治疗和改变预后具冇重要的意义,也是发展新治疗技术的 基础。要改变ad患者的结局,必须在轻度认知损害期之前做出诊断,这才是真 正意义上的ad早期诊断。ad早期诊断标记包括神经心理学标记和生物学标记,后者包括遗传标记、 影像学标记和神经生化标记。在神经心理学标记方面,主要是测量新联想形成和 保持的记忆测验、反映执行功能的神经心理测验,因为与学习和记忆冇关的神经 细胞首先受损,

9、以后逐渐波及到控制思维、判断和行为的神经细胞。在遗传标记 方面,口前发现有四个基因与ad发病有关,其屮三个基因(分别在1、14和21 号染色体上)与早发ad有关,载脂蛋白e等位基因(ap0e-4)与晩发ad有关。在影象学标记方面,目前比较多研究认为spect和pet可以作为ad早期诊 断技术,已发现早期ad患者存在颍顶区低灌流,而月.血流降低程度与认知功能 下降程度存在显著的相关关系;ad早期多巴胺系统的调节也值得关注,已发现 海马、颛叶屮d2受体变化与图片记忆、人名记忆等功能密切相关;fdg-pet显 像显示中颖叶在ad早期存在糖代谢速率下降;近年来正在开发靶向斑块显像剂, 以期待能在活体脑

10、中直接标记显示ad的特征性病理改变一一老年斑(sp)和神经 纤维缠结(nft) o联合应用多种显像剂进行活体脑显像,探讨ad机制,将是ad 早期诊断中的重大突破。在神经生化标记方面,主要是测量脑脊液和血液屮a b和tau蛋白,口前认 为在疾病早期随着年龄壇加,皿沉积增加,脑脊液中皿12降低,但e纯检测脑 脊液中ab含量并不能作为ad的诊断指标。ad患者脑脊液中tau蛋白含量增高, 与其他神经系统疾病以及正常人z间冇显著性差异。脑脊液屮tau蛋白检测对 ad的诊断具有75%的特杲性和93%的灵敏度。上述这些诊断技术在不同阶段的ad 患者屮诊断的特异性和敏感性,国内外都有研究报告,结果差距很大,从

11、30%到 90%,有些甚至出现矛盾的结果。从现有的研究文献來看,多数研究是对单一指 标的考杳,联合多项指标的研究不多;横断面或短期随访研究多,长期的随访研 究少;多数研究的对象是临床期ad,对临床前期ad的诊断价值还不清楚。ad早期诊断必须在轻度认知损害(mci)期之前做出,在dsm-iv和icd-10 都列入了增龄相关认知损害的诊断类别,并提出了相应的诊断标准:年龄在50 岁以上,有ad特征病理改变的物质基础,与年轻时相比记忆力有明显的减退, 客观记忆测验成绩低于年轻成人平均成绩,一般认知功能和日常生活能力正常, 没有痴呆的证据。多数调查发现,有1/3的老年人符合mci的诊断标准。多数学 者

12、认为mci是ad的早期,将来可能发展成ad痴呆,有研究报告每年有25%的mci 患者转化为痴呆,大多数研究报告每年冇10%-15%的mct患者发展成ad痴呆, 因此及时诊断和治疗mci对改变ad的结局具有重要的意义。本项目拟以mci为研究对象,采用纵向研究方法,考查神经心理测验、脑脊 液/血浆ab和tau蛋口、神经核医学显像技术(a b班块显像和d2受体显像)、 载脂蛋白e等位基因(apoe-4)对早期ad的诊断特异性和敏感性,以及对ad 痴呆的预测价值。靶向ab班块显像技术在活体直接显示ad特征病理改变(老 年斑)国内外还没有报道,有关多巴胺d2受体与ai)的关系国内也未见报道。如 能开展此

13、项目,冇望研制出一套客观、特异、灵敏的早期ad诊断技术,对ad 预防、治疗和新药开发具有重要的指导意义,可望改变ad的结局,为家庭和社 会做出积极的贡献。主要参考文献(1) burns a, zaudig m. mild cognitive impairment in older people. lancet, 2002; 360:1963-1965(2) albert ms. cognitive and neurobiologic markers of early alzheimer disease.proc natl acad sci usa, 1996, 93:13547-13551(3

14、) mitchell a, brindle n. csf phosphorylated tau一does it constitute an accurate biological test for alzheimer's disease? international journal of geriatric psychiatry, 2003, 18:407-411(4) nitsch rm, rcacck gw, deng m,et al. cerchrospinal fluid levels of amyloid-b protein in alzheimer's diseas

15、e; inverse correlation with severity of dementia and effect of apolipo protein e genotype, neurol, 1995,87:512-518(5) encinas m, de juan r, marcos a, et al. regional cerebral blood flow assessed with "mtc-ecd spet as a marker of progression of mild cognitive impairment to alzheimer's diseas

16、e. euro j nucl mol imaging, 2003, 30:1473-1480(6) esteez-gonzalez a, kulisevsky j, boltes a, et al. rey verbal learning test is a useful tool for differential diagnosis in the preclinical phase of alzheimer's disease: comparison with mild cognitive impairment and normal aging. int j geriatr psyc

17、hiatry 2003; 1 & 1021 -1028(7) demattos rb, bales kr, cummins dj, et al. brain to plasma amyloid-b efflux: a measure of brain amyloid burden in a mouse model of alzheimer's disease. science, 2002, 295:2264-2267(8) kung mp, catherine h, zhuang zp, et al. impy: an improved thioflavin-t derivat

18、ive for in vivo labeling of b -amyloid plaque. brain reseach, 2002, 956:202-210(9) skovronsky dm, bin z, kung mp, et al. in vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of alzheimer's disease. neurobiology, 2000, 97:7609-7614(10) 王力,程灶火,李欢欢.alzheimer病人记忆损害特征的研究。心理科学, 2004年第4期(11) kemppaine

19、n n, laine m, laakso mp, et al. hippocampal dopamine d2 receptors coitelate with memory functions in alzheimefs disease eur j neurosci. 2003 jul;18(l): 149-54.(12) mega ms, chu t, mazziotta jc,et al. mapping biochemistry to metabolism: fdg-pet and amyloid burden in alzheimefs disease. neuroreport.2.

20、 本课题的研究内容、研究目标和拟解决的关键问题研究内容(1)神经心理测验对临床前期和临床早期ad的诊断特异性和敏感性和对 ad痴呆的预测价值,采用标准化记忆测验和智力测验进行测试,选出对学习、 记忆、新联想形成和执行功能等功能的心理学指标,这些是早期ad的主要心理 改变。(2)神经核医学显像技术对临床前期和临床早期ad的诊断特异性和敏感 性和对ad痴呆的预测价值,采用a b班块和d2受体等显像剂进行活体 spect/pet 脑显像。(3)脑脊液或血.浆a b z2和磷酸化tau蛋白对临床前期和临床早期ad的 诊断特异性和敏感性,国内外己有研究报道,但主要针对ad痴呆病人,本研究 主要考查对mc

21、i的诊断特开性和敏感性,同吋考查对ad痴呆的预测价值。(4)载脂蛋白e等位基因(apoe-4)对临床前期和临床早期ad的诊断特 异性和墩感性和对ad痴呆的预测价值。(5)综合分析不同诊断技术联合对临床前期和临床早期ad的诊断特异性 和敏感性和对ad痴呆的预测价值。研究目标(1)考查正常老年人、mci (临床前期ad)和临床早期ad在各项观察指 标上的差异,确定mci每年转化成ad的概率。(2)通过对100名mci患者的追踪对照研究,考查各指标和不同指标组合 对早期ad的诊断特异性和墩感性和对ad痴呆的预测价值。(3)建立早期ad的标准化诊断程序。(4)建立预测ad痴呆的数学模型和鉴别正常老人和

22、早期ad的判别模型。拟解决的关键问题(1)获得有代表性的同质样本:国外一些研究结果不一致,样本的同质性 问题可能其屮原因之一,木研究将严格按mci的诊断标准和ad的研究诊断标 准选择样本,特别强调ad特征病理改变的物质基础。(2)选择能反映ad早期认知功能改变的神经心理测验,过去我们在增龄 性记忆改变和老年痴呆记忆特征等研究屮,发现多维记忆评估量表屮的某些 分测验(如汉词配对学习、图符配对学习、图画冋忆等分测验)对正常老年人、 ad痴呆和其它类型痴呆有鉴别价值。(3)神经核医学分子显像技术的建立是本研究的关键技术,也是本研究的 难点,本研究需要的两种显像剂(多巴胺d2受体显像剂131i-cpi

23、dcpridc.斑块 显像剂,3,1-1mpy)合作单位已研制成功,并拥冇放射性药品使用许可证(四类), 可在其下属江原医院完成本研究。3. 本课题的特色和创新之处(与国内外类似研究比较)(1)目前ad的生前诊断主要根据临床症状和间接的实验室证据,确诊需 要死后病理证据(老年斑和神经纤维缠结),木研究联合应用多种神经核医学活 体显像技术(尤其是131i-impy标记spect a 13班块显像技术和 ,3ii-epidepride标记spect多巴胺d2受体显像技术)作为ad早期诊断指标, 国内外均未见报道。这些技术能在活体上直接显示临床早期和临床前期ad的特 征性病理改变,具有重要的确诊价值

24、。(2) 本项目以ad痴呆的高危人群(mci)为研究对象,采用纵向追踪研 究方法考查神经心理测验、血浆a b和tau蛋白、apoe-4检测对ad早期诊断 和预测价值,国内尚未见报道,国外纵向追踪研究也不多。(3) 本项目mci的入组标准比国外类似的研究严格,除记忆轻度减退外, 特别强调ad特征性病理改变的物质基础脑脊液或血浆a p和tau蛋白含量 异常,排除其它原因(抑郁、脑血管病变等)引起的轻度认知损害,所以本项廿 中mci是真止意义上的早期ado4. 研究工作的预期结果、成果提交方式及专利申请状况。木项研究通过对健康老年人和mci患者的追踪对照研究,考查各指标和不 同指标组合对早期ad的诊

25、断特异性和敏感性和对ad痴呆的预测价值;建立早 期ad的标准化诊断程序;建立预测ad痴呆的数学模型和鉴别正常老人和早期 ad的判別模型。为ad的早期诊断提供敏感的或新的技术指标,对临床实践(老 年痴呆的早期诊断、病理性记忆缺陷和壊龄性记忆改变的鉴别、ad的早期治疗) 都有重要的指导价值。木研究主要以发表科学论文的形式推广研究成果,预计可 发表论文45篇,其中在国外期刊上发表12篇。培养研究生23名。二、研究方法和技术路线1. 拟采取的研究实验方法、步骤、技术路线及可行性、可靠性论证;研究对象本项研究的对彖包括健康老年人、mci患者和老年痴呆患者三组。(1) 健康老年人取样30-50人,入组标准

26、为:年龄在60-70岁之间;目前 和过去无明显精神和神经系统疾病;无主观记忆困难、详细医学检查无记忆缺陷 的证据;标准化记忆测验的记忆商数和标准化智力测验的tq在正常范围;脑脊 液或血浆a b和tau蛋口含量止常;脑部ct无异常发现。(2) mci组取样60-100人,入组标准为:年龄在60-70岁之间;目前和过 去无明显精神和神经系统疾病;有主观和客观记忆减退的证据,日常生活和社会 功能基木正常标准化记忆测验成绩低于健康成人1个标准差,标准化智力测验 的tq在85以上,或mq低于iq 15分以上;脑脊液或血浆a b和tern蛋白含量 异常;脑部ct无异常发现。(3) 临床早期ad组取样30-

27、50人,入组标准为:年龄在60-70岁之间;符 合器质性精神障碍的诊断标准;记忆和智力全面受损(标准化记忆测验的记忆商 数在70以下、标准化智力测验的iq在50-69之间;脑脊液或血浆a b和tau 蛋白含量异常;脑部ct证明冇脑萎缩;排除其它躯体和脑部疾病及精神疾病所 致智能损害或假性痴呆。研究方法(1) 神经心理测验:采用项目负责人编制的多维记忆评估量表和龚耀 先教授修订的韦氏成人智力量表对入组对象做个别测试,健康老年人和mci 组以后每年检测一次,观察动态变化过程。(2) 脑脊液或血浆abw和磷酸化tau蛋白含量测定:采用双抗体夹心式 酶联免疫吸附法(elisa)进行定量测定。所有对象入

28、组时都做检测,健康老年 人和mci组以后每年检测一次,观察动态变化过程。(3)载脂蛋口 e等位基因(ap0e-4)检测:采用聚合酶链式反应(pcr)检测 apoe基因型,所有对象入组吋都做检测。(4)神经核医学显像:注射适量显像剂后用spect/pet采集脑断层影像, 用脑断层显像和图像重建技术显示脑内情况,用固定框r 0 i取连续3层获得各 局部脑组织的放射性计数率,再求出各局部脑组织的放射性浓度。所冇对彖入组 时都做检测,研究过程mci患者发展成ad痴呆时检测确诊,mci组未出现痴呆 者在研究的第三年再测一次。可行性分析(1)mci在老年人群屮发生率高(20%-30%),有可靠的被试来源,

29、最近两 年我们完成了本地区精神疾病的流行病学调查(包括老年痴呆),掌握了本地区 老年人的基木资料。(2)本研究所需的贵重仪器(spect)项目中请者或主要研究者所在单位已 具备。(3)木项口采用的神经心理测验取自项口负责人编制多维记忆评佔量表, 已建立了国内常模,具有较高信度和效度,龚耀先教授修订的韦氏成人智力量 表在国内已广泛应用,我们曾对老年人、老年痴呆、parkinson病等进彳亍过一 些研究,发现这些测验对老年痴呆具有较好的诊断和鉴别诊断价值。(4)神经核医学分子显像是本研究的关键技术,合作单位(江苏省原子医 学研究所)已研制成功多种国内外先进的脑显像剂(如脑血流灌注显像剂 tc-ec

30、d、多巴胺d2受体显像剂i-epidepride、斑块显像剂i-impy、代谢显 像剂沖-fdg等)。其下属江原医院有放射性纱品使用许可证(四类)和相应的显像 设施、医技人员,可保证本研究的按时高质完成。(5)本研究涉及的相关技术,研究组成员都已掌握,并有多年的相关研究 经验。2. 研究工作的总体安排及进度。研究期限:2006年6月-2009年6月,在2007年1月前完成准备工作和文 林杏闻 册它细术1-9笛*2007 i 1 -6月,腐成所有研究对象入组工作和心理、ab班块和多巴胺 d2受体的活体显像(spect)检测工作,2007年7月-12月完成三组研究对象的生化指标的检测工作,并对第一

31、批数 据进行分析,撰写论文1-2篇。2008年1月-12月,对健康老年人组和mci组做一次随访,复测血浆a b 和tau蛋口、ap0e-4检测和神经心理测验。2009年1月-6月,对健康老年人组和mci组做第二次随访,再次检查血浆 ab和tau蛋白、ap0e-4检测和神经心理测验,复测spect。总结资料,撰写 论文2-3篇。登记序号:项目编号:中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称:痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位课题负责计划年限邮政编码:210029 联系电话:86617141 30306申报口期江苏省中医药局制填写提纲一、立项依据:与选题直接相关的国内外现状、水平

32、和发展趋势;选题的理 论和实践依据;研究目的、意义;本研究达到的科学技术水平,预期社会经济效 益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思,主要研究内容、关键技术、目标(达到的主要技 术指标或技术经济指标),技术特征及创新之处,开发项口应说明开发规模。三、研究试验方法及技术路线(工艺路线)。四、现有工作条件和基础:开展本项研究的技术优势,现冇的主耍仪器设备 及应用合格实验动物的基本条件等;已有工作基础,预试验情况。五、计划进度:根据总的研究期限、年度计划进度,分别列出具体的廿标和 进度的考核指标。六、参加(协作)单位意见及具体分工(附协议书)。七、经费概算(包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的

33、自主)和核算 依据,以及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页,用纸大小和封页一致,字迹清楚,装订整齐后按申 报要求上报。二、填写捉纲所列内容,要全而详细、如实填写。三、封面上“登记序号” “项目编号”请勿填写。1、立项依据1研究目的、意义骨关节炎(osteoarthritis, 0a)又称退行性关节病,以关节软骨发生弥漫性 龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群,是多见于 中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高,据调查,在美 国目前2亿多人口屮,就冇骨关节炎4500万,发病率占总人口的20%,在老年 人中所占比例更高,50岁以上人群中,oa的患病

34、率仅次于心血管疾病,位居第 二位。在我国,根据流行病学调查显示,55-64岁的人群中发病率达40%,而 65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展, 我国已进入老龄化社会,0a的发病率还将越来越高,这不仅严重危害人民的生 活、健康,对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也而临着同样的问题, 因而oa引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对oa的研究颇多,在发 病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较犬进步,但总的来说还缺乏令人满意 的突破性进展。西药治疗oa的主要手段是非番体药,但存在副作用大、作用单 一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗0a也取得了一些经验,

35、但对其具体的 作用机制冇深入研究的却很少,因此在屮医理论的指导下,运用现代科淫技术, 对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究,使中药治疗oa的疗效在国际先进 行列中占一席之地,是摆在我们面前非常重要的课题。1.2国内外现状水平和发展趋势近十年来,国内外对0a进行了较深入地研究,大致归纳如下:1.2.1流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中,oa是影响人类健康最常见的关节疾患 之一,没有明显的种族和地域差异,本病的患病率随年龄增加而增高,故随着人 类平均寿命的延长,患病率也有增高的趋势。felson等报道70岁以下人群膝0a 患病率为7% (男6.4%,女11.4%), 80岁以

36、上为11.2% (男5.4%,女15.8%); 而放射学膝oa70岁以上为27.4% (男30.4%,女25), 80岁以上为43.7%。 butter等报道,44岁以卜、4559岁、6()岁以上人群中,放射血oa患病率各 为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示, 症状性0a患病率2.2%;无症状性0a患病率53%,其屮3039、4049、50 59岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例,结杲40岁 以下、4049、5059 和 60 岁以上各占 12.2%、17.4%、26.1%和 44.3%。另外 不同关节oa易感性不同

37、。美国在卫生统计屮心调查结果,oa患病率以手最高, 以下依次为足、膝、競。国内陈顺乐等调查结果oa是颈椎最多,以下依次为腰 椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大,但手、膝、骯oa均以女性较 多,且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在framingham的研究中,felaon 等发现女性体重减少11磅,骨关节炎形成的风险相应减少50%o saase等调查 结果,膝oa患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%o根据1994年统计,在 美国,骨关节炎的消耗为155亿美元,约为类风湿关节炎的3倍,其中一半以上 消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查,但随着老龄化社会进程的 不断加快,

38、oa的发病率会越来越高,这必将给家庭、社会带来沉重负担。1.2.2病因、发病机制有了巨大突破口前基础研究认为软骨的损伤与退变是oa的根木,随着分子生物学免疫学 的发展,近年来众多学者对oa关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大 量研究,其发病机制仍未完全明了,又捉出了许多学说,如软骨下骨内高压学说: 由于骨血液动力学的改变,在骨髓腔容积不变的前提卜增加内容物引起压力增 高,即表现为骨内压力壇高。骨内高压持续壇高存在下关节滑液ph值下降,成 分改变,干扰并破坏了软骨细胞的正常'代谢导致细胞变性坏死,胶原纤维解聚, 蛋口多糖分解,软骨下骨破坏、修复,最终产生骨性关节炎。自由基学说:认为

39、 t由基对软骨细胞dna和pg的合成具冇抑制作用。自由基作用软骨细胞后, 引发膜脂质过氧化,使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多,丙二醛可与dna发生 交联,自由基也可直接攻击软骨细胞dna即合成dna所需的酶,使dna链断 裂、碱基损伤从而影响了 dna的合成,也造成前列腺(pg)合成障碍。骨关节 炎时,滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润,其表面受免疫复 合物、补体等作用能释放大量。2-和h2o2;细胞因子学说:细胞因子对骨关节炎 的发生、发展起了重要作用,如白细胞介素1 (il1)、白细胞介素-6(il-6).肿 瘤坏死因子(tnf)等在oa中水平明显壇高。il1具冇刺激软骨细胞分

40、泌一氧 化氮、前列腺e和il6的作用,引起滑膜炎症和疼痛,同吋il1也是软骨基质 降解的主要駆动因子;软骨酶降解学说:oa软肯细胞的基质降解酶类的合成与 分泌率明显增加,并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分了的降解 酶类口j以壇加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质 金属蛋白酶,尤其是基质溶素和胶原酶,参与关节软骨的降解过程,这些iw类可 以降解细胞外基质的所有成分,与循环系统中的纤维蛋口溶酶和局部合成的纤溶 酶原一起,快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的il1和tnf的作用下, 软骨细胞以酶原的形式分泌大量的基质金屈蛋口酶,而对金屈蛋口酶组织抑制剂 无影响

41、,使二者失衡从而增加对软骨主要成分ii型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作 用,使软骨进行性破坏;一氧化氮学说:no是一种细胞间信使分子,可介导许 多生物学现彖。nos可催化重要炎性介质no的产生,oa患者血清、滑液中 no含量明显高于正常。no可通过抑制软骨细胞增殖,促进软骨细胞凋广,改 变蛋口多糖和胶原蛋口的合成与分泌功能,同时使软骨细胞分泌透明质酸减少, 滑膜粘蛋白解聚,抑制软骨细胞合成软骨基质,促进软骨细胞糖酵解,使软骨破 坏。细胞凋亡学说:细胞凋亡是细胞死亡的形式之一,许多正常组织均可发现凋 亡,但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病,在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋 亡有异常表现,冃凋广细胞数目

42、与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于 软骨细胞小孔或间隙内,其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙,有ntpph(nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase)和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨 细胞修复过程失败,而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。0a软骨细胞凋亡主要 通过两种相互独立的途径完成,一种是同滑膜炎症无关的途径,由no介导;另一 种是同滑膜炎症相关的途径,由fas介导。典型的oa不存在明显的炎症反应,此 时软骨细胞凋亡以no途径为主;当产生炎症反应时,则通过fas途径加剧软骨细 胞凋亡和关节破坏。no通过两种方式造成组织及细胞损伤。一是高浓度的

43、no 能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸, 造成组织损伤;二是no与超氧化阴离子0 2-反应,生成氧化亚硝基阴离子0n00, 在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为oh和no?自由基,这两种自由基具冇很 强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在oa患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例 明显高于未受损区。fas表达的结果与其相符,oa受损区的fas表达远高于未受 损区,提示fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除no途径和fas途径外,还有一些因 素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如il1、il8、tnf,、pge2、aggrecan g1 区等。1.2.3治疗方面有了不少新方法

44、口前屮西医治疗0a的药物较多,西药治疗0a主要有三大类,第一类为快 作用药,即非笛体药,特点是发挥作用快,但副作用较大,对胃肠、肝肾、血小 板均冇较大彩响,0a多为老年人,长期服用此类药尤英不能耐受,且部分药物 价格不菲,而且由于过分的镇痛,导致病人失去警惕过分运动,以致出现“消炎 痛轆”,从长期疗效來看反而不佳,最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗0a的 首选药,但尚有一定争议,且同样存在上述副作用;第二类为慢作用药,发挥作 用慢,疗效不确切,价格昂贵,临床上诡未广泛运用;第三类为软骨保护剂,尚 未问世。关节清理术、膝关节置换术,适应症较少,费用高,创伤大,病人难以 接受。中哦药治疗oa的研究取

45、得了可喜的进步,但中纱治疗仍存在较多共性的 问题:多属临床经验,无对照组,特别是西药对照组观察,处方不固定。缺 乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻 找治疗0a的中药。未针对0a发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、 病理、细胞分子水平来探讨屮药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副 作用小的新药。中医认为oa属痹症中的痹、痛痹、骨痹,认为其病因与年老体 衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关,明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为 0a的发病基础,而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统屮医 理论基础上,阐述了膝0a骨内高压一血瘀证一氧口由基之间的密切

46、关系;谢 林等论述了膝0a与血瘀证z间的内在联系,旨在为运用活血化淤药治疗0a捉 供理论依据。治疗方面从占到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强 筋骨、补气血治其本;散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒 湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防,具有补肝肾、活血通络之功,临床 常见本方加减治疗0a,疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例,总有效 率94.7%o单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例,有效率为87.5%o陆智报 道用木方加减治疗104例,总有效率91.3%o1.2.4实验研究方面有了较大的进展随着对oa发病机理的不断深入认识,对oa的实验研究方面也开始了向多

47、 层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验, 现已使用针对oa的动物实验,并采用相关的指标进行检测。冃丽实验研究内容 主要有以下几个方面,研究最多的是oa的血液流变学、氧自出基及一氧化氮含 量等,这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成,也可通过使用其它相 似的模型检测相关指标来进行,如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标, 使用老龄动物通过检测体内sod及mda含量推断药物的抗氧自由基的能力等。 在no对oa影响的实验中,一般采用硝酸还原酶法来测定no含量,运用pt-pcr 技术测定nos基因表达。il1、il6、tnf等细胞因子、软骨降解酶尤其是基 质金属

48、蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶iw原激活物和前列腺 素pge2、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为 检测指标使用到实验研究屮来。1.3选题的理论和实践依据祖国医学并无骨关节炎的病名,从历代文献來看本病应归属于“骨痹”、“痛 痹”范畴。我们认为oa病人除了肝肾亏虚,寒湿痹阻外,一般oa病人体重超 重较多,也即为痰湿偏盛之体,另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰,痰淤交 阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素,所谓顽症怪病皆质z于痰淤。 基于现代医学对oa发病机理的深入研究,我们在补益肝肾、活血通络基础上, 结合中药对缓解软骨降解,增加软骨细胞功能,抑制

49、滑膜增生及炎症的研究成果, 于1995年即对备急千金要方屮的独活寄生汤进行化裁,重用活血化淤,加 用化痰清热之品,总结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒,并于 1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝oa,方中以独活为君药,以祛下焦与筋骨间 风寒湿邪;威灵仙舒筋通络止痹痛;淫羊薰、怀牛膝补肝肾,强筋骨,通经络, 其中怀牛膝为引经药;当归养血柔肝、舒筋活血;川茸则通达四肢关节,为血中 气药;虎杖活血清热解毒,同吋防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、 化瘀痰之功,冀能消炎止痛,保护软骨。通过36例的临床研究、观察,结果表 明本方疗效显著月副作用小。因此冇必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用

50、机制 尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究,冀能证实痛痹颗 粒的临床疗效,明确其作用机制,并初步探讨本病发病的町能机理,为新药问世 提供客观的依据,所以进行设计并立题。1.4本研究达到的科学技术水平,预期社会效益和应用推广前景141继承和发扬祖国医学,保持中医特色,以临床疗效为前提,以实验研 究为基础,制造规范化大鼠的膝0a模型,从发病机理探讨本药的作用机制。本 实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型,并采用最新的检测指标il-k tnf、sod、mda、no等,总之本研究基于现代医学对0a发病机制的最新研 究成果,从生化、免疫等多个角度多个层次,系统观察并进行归纳总结,确

51、保本 课题不但可行而且先进,冀能填补省内外运用中药治疗oa的空白,并希望以此 为基础,进一-步从细胞水平(包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响)研 究屮药对0a的长久作用及影响,从而达到挤身国际先进水平的口的,让屮药真 正走向世界。1.4.2目前,中药治疗oa的方法颇多,但大多以临床疗效研究为主,大样 木、规范化的研究很少,中医中药治疗机理的研究,虽有涉及,但大多分散且存 在一定的重复性,理想的治疗药物尚未问世,具冇公认疗效的小儿迁延性腹泻临 床治疗方案尚未确立,其疗效评价体系尚需研究确定,尤其是缺少屮医药治疗学 整休研究思路与方法,使中药复方治疗0a的疗效机理诃未能全面揭示,影响了 该领

52、域研究的深入。而痛痹颗粒是在屮医理论指导下选用千金要方屮独活寄 生汤进行加减所得,并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实 验研究,观察其对oa的确切疗效及作用机理,这必将对oa的中医理论产生较 大影响,同吋对临床治疗也起到更好的指导作用,从而产生较好的社会经济效益。 随着改革开放的形势发展,以及中国加入wto与国际接轨的进程的不断完善, 祖国医学国际地位不断的捉高,我们将从祖国医学宝库屮发掘出的治疗oa的高 效药物与现代新技术、新方法进行研究总结,从而为人类造福,为振兴中医事业 做出应有的贡献。2. 科研假说或技术构想:主要内容、技术关键口的,技术特征及创新之处, 开发项目应说明

53、开发规模。2主要内容2丄1探讨oa的病因病机,提出新见解,发展中医理论。2丄2运用现代科学技术,开展实验研究,从分子生物学、免疫学、生理生 化学等多方面来探讨“痛痹颗粒”治疗膝oa的疗效机制及药理毒理作用。2.2主要技术关键221膝0a模型的复制目前所使用的oa动物模型-般可分为两大类,其一是诱发模型,即通过各 种操作方法如制动、手术、关节内注药、关节内植入软骨碎片或微粒等诱导0a 产生;另一类为自发模型,即不用任何外界干预,动物自发0a,如c57黑鼠等。 在选择动物模型时一般应考虑动物的种屈(包括其生活习性、关节结构、组织学 及病理学特征)、不同方法的造模机制和oa模型的特点,并应参照研究目

54、的加 以选择。在诱发模型中,常用的方法是手术造成关节的应力改变及关节腔内注入 木瓜蛋白酶,这两种方法都能复制出较成功较高的0a模型,且操作较为简单。 具休的造模机制在于低应力可以造成软骨厚度减少,so染色变淡,水分增加, 蛋白聚糖聚集度损伤等变化,木瓜蛋白酶作为一种蛋白水解酶会引起关节软骨的 退行性改变。在具体的造模过程中我们选用以上两种方法來分别复制动物模型。 用于动物模型的动物一般冇狗、兔、鼠等,我们选用大鼠做0a模型,因为该模 型关节软骨退变的组织学特征与人类相似,且动物来源较广泛,且经济。2.2.2关节软骨细胞的获取和培养基于来源广泛,操作可行的原则,目前用于体外培养的软骨细胞一般均为

55、兔 关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离,经过一系列的漂 洗、消化等工作后获取软骨细胞。目前还没冇专门用于软骨细胞培养的培养液, 国外采用的培养液种类繁多,有199、1640、fl2>改良eagle等,国内的有199、 1640、dmem (高糖)等,其中加入胎牛血清(占15%), 一般以使用dmem 培养液居多。在培养液屮述含冇一些辅助添加剂,包括25mmol/lhepes> 1 mmol/l 丙酮酸钠、2mmol/l谷氨酰胺、50umol/l二硫基乙醇以及10万单位/l的青霉 索和10万单位/l的链霉索,ph7.4。培养过程中一般使用5%co237°

56、c的恒温培 养箱。2.2.3采用的检测手段及指标在病理组织形态学的检查屮,一般釆用以下几个观察指标:大体肉眼观察 软骨及滑膜表面情况;he染色观察有关的形态变化;masson三色染色观察 胶原的变化;sanfranin-0即沙红o染色用于组织学评分,评分方法按mankin 法;电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。在细胞培 养的相关检测中,我们采用mtt法检测软骨细胞的增殖能力,用全自动生化分 析仪对检测总蛋口含量,使用细胞流式仪进行细胞凋亡的测定,对inos、no 含量的测定则使用分型nos试剂盒和no试剂盒。2.3 口标(达到的主要技术指标或技术经济指标)、技术特征及创新

57、之处。现代科学技术与中医药理论相结合,深入研究中医药治疗oa的作用机制, 为临床应用捉供更加科淫冇利的客观依据,发挥屮医药治疗oa的特色和优势, 为临床常见、严重影响人类健康的oa研究出有效、安全、便于推广应用的中医 药治疗方法,使能迅速缓解症状,大大减轻病人痛苦,降低膝骨关节炎的致残率 和复发率,且副作用小的简、便、廉、验的屮药制剂问世。治疗膝oa的新药生 产及对其在治疗中所起作用机制的深入探讨,既符合国情乂能够走向世界,产生 较大的社会和经济效益,这必然形成高新技术产业进入高新领域,对促进科技进 步,发展中医约,有着积极的作用,同时这也是中药现代化研究的发展方向和新 的探索。3. 实验研究

58、方法及技术路线。3对实验性大鼠骨性关节炎的防治作用oa模型的制备:(1)取sd雄性大鼠50只,体重200220g,固定,常规 备皮消毒,沿離韧带内侧缘切】i,切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部, 并在断端处修剪去除约2mm,造成双后肢膝外翻畸形。术后第二天放造模人鼠 于拖箱内每天赶其行走30mo (2)取sd雄性大鼠50只,体重200220g, 4% 木瓜蛋口酶溶液与0.03mol/l半胱氨酸溶液1 : 1混置0.5小时后,分别在第1、 3、5、7天于实验大鼠膝关节腔内注入混合液20ul。方法:将造模后的大鼠随机分为模型组、阳性对照组(维骨力组)、治疗组, 另设正常对照组,分别灌胃给药或蒸饰水,连续7周。七周后将动物麻醉后,立 即将大鼠以仰卧位固定,颈总取血,接入试管屮,2000rmpl5min离心获取含药 血清;切开关节囊,进行大体观察后,然后以锐利刀片切取膝关节前正中部分的 滑膜组织,作he染色,电镜下观察。再用锐利刀片切取股骨内保软骨使其呈2mm x 1mm全层软骨标木,2.5%戊二醛溶液固定,电镜下观察。所余z股骨内保连 同软骨下骨一并切下,10%福尔马林溶液固定24小时以上,分别作he、沙红0

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