DNA重组的载体蓝背景学习课程

1、质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征第1页/共47页第一页，编辑于星期五：十七点 二分。载体的功能及特征载体的功能（P12）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供在受体细胞中 扩增和表达能力注意：上述三大功能并非所有的载体分子都必须具备第2页/共47页第二页，编辑于星期五：十七点 二分。载体的功能及特征载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记 具有较高的外源DNA的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点

2、或整合位点 第3页/共47页第三页，编辑于星期五：十七点 二分。质粒载体质粒的基本特征 定义：质粒是一类存在于原核细菌和真菌细胞中，能独立于寄主染色体而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子并被稳定遗传的一类核酸分子。是处于生命与非生命的分界线上。（1）质粒常见于原核细菌和真菌中；（2）绝大多数的质粒是DNA型的，绝大多数的天然DNA质粒具有共价封闭、环状的分子结构，即cccDNA；（3）质粒DNA的分子量范围：1 - 100 kb第4页/共47页第四页，编辑于星期五：十七点 二分。质粒的基本特征1.质粒的自主复制性：质粒能摆脱寄主细胞的DNA复制系统的束缚进行自主复制；质粒DNA上含有自己的复

3、制起始区（ori），形成独立的复制子结构根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒 1 - 5拷贝 stringent plasmid松弛型复制控制的质粒 30 - 50 拷贝 relaxed plasmid第5页/共47页第五页，编辑于星期五：十七点 二分。质粒的基本特征2.质粒的可转移性：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA

4、转移，这个过程由bom和mob基因决定。第6页/共47页第六页，编辑于星期五：十七点 二分。质粒的基本特征3.质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：第7页/共47页第七页，编辑于星期五：十七点 二分。质粒的基本特征4.携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生

5、长非必需的附加性状，包括：物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。第8页/共47页第八页，编辑于星期五：十七点 二分。质粒的构建原因：天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验 室 使 用 的 大 肠 杆 菌 质 粒 大多是由少数几个野生型质粒构建而成的：pSC1018.8 kb，拷贝数 5，四环素抗性标记基因 TcrColE16.5 kb，拷贝数 20 - 30，大肠杆菌内毒素标记基因

6、E1RSF2124ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因 Apr第9页/共47页第九页，编辑于星期五：十七点 二分。改造的原则（1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的相对分子质量（2）灭活某些质粒的编码基因，应为非转移性质粒，应为松弛型质粒（3）加入易于识别的选择标记基因（4）引入具有多种限制性内切酶的单一识别位点（5）根据外源基因克隆的不同要求，加装特殊的基因表达调控元件构建过程（P14）第10页/共47页第十页，编辑于星期五：十七点 二分。质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因低拷贝质粒 来自pS

7、C101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头（polylinker）整合质粒 装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选第11页/共47页第十一页，编辑于星期五：十七点 二分。重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEc

8、oR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell用于基因克隆 第12页/共47页第十二页，编辑于星期五：十七点 二分。pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII第1

9、3页/共47页第十三页，编辑于星期五：十七点 二分。重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBr5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galClBrClBrONNO第14页/共47页第十四页，编辑于星期五：十七点 二分。重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743 bpMCSlacZ

10、PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等第15页/共47页第十五页，编辑于星期五：十七点 二分。质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法 质粒DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间第16页/共47页第十六页，编辑于星期五：十七点 二分。氯化铯密度梯度离心法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 加CsCl和溴乙锭；超速离心过夜；在紫外

11、灯下吸取cccDNA；稀释沉淀cccDNA。proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第17页/共47页第十七页，编辑于星期五：十七点 二分。碱溶法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 加NaOH和SDS的混合溶液，破膜释放内含物； 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质； 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA；用无DNase的RNase去除残余的RNA。 cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA第18页/共47页第十八页，编辑于星期五：十七点 二分。沸水浴法： 用含有ED

12、TA和Triton X-100的加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 沸水浴40秒钟；离心，用无菌牙签挑去沉淀物； 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。缓冲液悬浮菌体； 第19页/共47页第十九页，编辑于星期五：十七点 二分。另一类载体 噬菌体或病毒DNA 噬 菌 体 或 病 毒 是 一 类 非 细 胞 微 生 物 ， 能 高 效 率 高 特 异 性 地 侵 染 宿 主细 胞 ， 然 后 或 自 主 复 制 繁 殖 ， 或 整 合 入 宿 主 基 因 组 中 潜 伏 起 来 ， 而 且 在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬 菌 体 或 病 毒 的 上 述 特 性 使 得 它 们 的D N A能 被 开 发

13、 成 为 基 因 工 程 的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。第20页/共47页第二十页，编辑于星期五：十七点 二分。l 噬菌体的生物学特性：生物结构l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61？个基因l双链噬菌体DNA载体第21页/共47页第二十一页，编辑于星期五：十七点 二分。l 噬菌体生物学特性： 生物结构5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期

14、控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l - DNA第22页/共47页第二十二页，编辑于星期五：十七点 二分。l 噬菌体生物学特性： 感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解第23页/共47页第二十三页，编辑于星期五：十七点 二分。l 噬菌体生物学特性： 感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDA第24页/共47页第二十四页，编辑于星期五：十七点 二分。l 噬菌体生物学特性： 溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子

15、代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态。 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶原状态第25页/共47页第二十五页，编辑于星期五：十七点 二分。l-DNA重组分子的体外包装： l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。

16、包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。第26页/共47页第二十六页，编辑于星期五：十七点 二分。-DNA载体的构建：缩短长度 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体取代型载体第27

17、页/共47页第二十七页，编辑于星期五：十七点 二分。取代型 （Replacement vectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的DNA区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon 4 载体：克隆能力大，2025kb插入型 （Insertion vectors ）这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。如：gt10 、 gt11 克隆能力小，一般不到10kb-DNA载体的主要类型：第28页/共47页第二十八页，编辑于星期五：十七点 二分。-DNA及其重组分子的分离纯化：P22将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或

18、重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA 第29页/共47页第二十九页，编辑于星期五：十七点 二分。l-DNA作为载体的优点：l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因第30页/共47页第三十页，编辑

19、于星期五：十七点 二分。单链噬菌体DNA载体噬菌体的生物学特性： 生物结构M13噬菌体的外型呈丝状M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 DNA全长6407个核苷酸M13 DNA上至少有10个基因2700个VIIIM13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 IIIVIVIIXI第31页/共47页第三十一页，编辑于星期五：十七点 二分。M13 DNA“+”链进入雄性大肠杆菌合成“-”链产生双链M13 DNA（复制型DNA或RF-DNA）按环状双链DNA方式复制，同时以“+”链DNA为模板转录包装蛋白 RF-DNA达200拷贝时，单链DNA特异结合蛋白与“+”链结合而阻断合成“-”链

20、结果只能以“-”链为模板合成“+”链 “+”链DNA被包装蛋白包装成新的M13噬菌体挤出受体细胞宿主细胞不被溶菌。M13噬菌体的生物学特性： 感染周期第32页/共47页第三十二页，编辑于星期五：十七点 二分。载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列载体lacZpolylinker第33页/共47页第三十三页，编辑于星期五：十七点 二分。M13 DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便被M13

21、噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb第34页/共47页第三十四页，编辑于星期五：十七点 二分。 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链DNA病毒双链DNA病毒单链RNA病毒双链RNA病毒 RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。插曲插曲第35页/共47页第三十五页，编辑于星期五：十七点 二

22、分。质粒与噬菌体杂合载体 l- D N A载 体 和M 1 3 - D N A载 体 的 装 载 量 最 大 分 别 为 2 5 k b和 1 . 5 k b ，但 在 很 多 情 况 下 ， 往 往 需 要 克 隆 更 大 的 外 源D N A片 段 ， 考 斯 质 粒 和 噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。 在 包 装 上 限 固 定 的 条 件 下 ， 大 幅 度 缩 短 噬 菌 体 D N A的 长 度 ， 就 能同 步 增 加 载 体 的 装 载 能 力 。 将 噬 菌 体D N A与 包 装 有 关 的 序 列 与 质 粒 组装 在 一 起 ， 既 能 最 大

23、 限 度 地 缩 短 载 体 的 长 度 ， 同 时 又 能 保 证 重 组 D N A分 子 在 体 外 仍 被 包 装 成 有 感 染 力 的 颗 粒 ， 这 便 是 构 建 考 斯 质 粒 和 噬 菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。第36页/共47页第三十六页，编辑于星期五：十七点 二分。考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建： 考 斯 质 粒 是 一 类 人 工 构 建 的 含pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalI有l- D N A c o s 序 列

24、 和质 粒 复 制 子 的殊 类 型 的 载 体 ，1 9 7 8 年 由C o l l i n s由 含 c o s序 列 的1 . 8 k b的l 片 段 和 考斯质粒的装载范围为31-45kb。和 H o h n发 明 构 建 。 例 如 ， p H C 7 9质粒pBR322片段组合而成。第37页/共47页第三十七页，编辑于星期五：十七点 二分。考斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞第38页/共47页第三十八页，编辑于星期

25、五：十七点 二分。噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒载体的特点： 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA概念：25页第39页/共47页第三十九页，编辑于星期五：十七点 二分。重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119pUC118：pUC18 + M13间隔区 IGpUC119：pUC19 + M13间隔区 I

26、G500 个拷贝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-MGpUC118 / 119表示M13辅助噬菌体DNA第40页/共47页第四十页，编辑于星期五：十七点 二分。重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZPT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬 菌 体 启 动 子 PT 3和PT 7强 化 外 源 基 因 的转 录 ， 提 取 出 来 的 单 链 D N A重 组 分 子在 噬 菌 体R N A 聚 合 酶 的 存 在 下 ， 又 可实现外源基因的体外转录。第41页/共47页第四十一页，编辑于星期五：十七点 二分。人造染色体载体 人类、动物、植物的全基