蛋白纯化培训总结

1、蛋白纯化培训总结蛋白质分离纯化一般需经过细胞破碎、澄清、分离等步骤。1 细胞破碎常见的细胞破碎方法有超声破碎法、反复冻融法、高压匀浆法、珠磨破碎法等。实验中应根据实验室现有实验条件来选择合适的破碎方法。冻融法操作十分简便，无需特殊设备，在实验室中使用很方便，但耗时，耗能，大规模应用困难。珠磨破碎法适用范围较广，但对操作者的经验水平要求较高，且制备量不易放大。本实验室主要采用高压匀浆法破碎细胞，一方面可以得到充分破碎的细胞，高压匀浆机的制冷系统也可减少蛋白质的热变性的可能，另一方面此种方法与其他方法相比，可在增大细胞破碎量的时候有效的节约时间。若不具备高压匀浆破碎细胞的条件，也可采用超声破碎法，

2、但超声破碎的效率受到声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等多种因素的影响。2 澄清经过细胞破碎的蛋白样品中含有大量的细胞碎片，不利于此后纯化过程的进行，需对样品液进行澄清处理。这一过程可通过离心、过滤、微滤等方法进行。实验室较多采用离心的方法获取澄清的液体，也可使用微滤的方法，如使用膜孔大小低于0.45m的滤膜进行过滤，但容易出现频繁的滤膜堵塞的状况，需多次更换滤膜。大规模生产中可使用过滤的方法，如板框过滤法。3 分离分离的方法主要有沉淀法、超速离心、超滤、层析。沉淀法在血液制品的生产中应用较多，如沿用至今的冷乙醇沉淀法制备血浆蛋白。超速离心法根据不同大分子物质沉降系数的不同，通过离心将其

3、分离开来，如用于病毒颗粒的分离。超滤法分离效率不高，主要应用于样品的浓缩。层析法在蛋白纯化中应用最为广泛，主要包含了离子交换层析、反相层析、疏水相互作用层析、亲和层析、体积排阻层析。3.1 层析在以上几种层析方法中，应用较多的为离子交换层析和亲和层析。离子交换层析根据蛋白质与介质之间静电吸附的强弱进行分离。实验中应用离子交换层析时，需要根据纯化对象的不同，在离子交换层析介质、洗脱液pH值、缓冲溶液类型、洗脱盐类型这几方面进行预实验，以寻找出最适的条件，预实验可用重力柱进行。离子交换层析分为阳离子交换层析和阴离子交换层析，两种类型离子交换剂的常用电荷基团如下表：阴离子交换剂阳离子交换剂Dieth

4、ylaminoethyl(DEAE) 二乙氨乙基 -CH2CH2N+(CH2CH3)2Carboxymethyl (CM)羧甲基-CH2COOQuaternary aminoethyl(QAE) 季铵基乙基-CH2CH2N+(C2H5)2CH2CHOHCH3Sulphopropyl (SP)-CH2CH2CH2SO3Quaternary ammonium (Q)季铵盐-CH2N+ (CH3)3Methylsulphonate (S)-CH2SO3亲和层析则是通过生物特异性差异分离样品的液相层析技术。可分离其他层析方法难以分离的样品。此种方法需根据纯化的物质不同选择不同的配基。在我们的实验中，选

5、择了将目的蛋白与组氨酸标签融合表达，运用组氨酸标签与层析柱上金属离子（Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+）的特异结合，来分离纯化目的蛋白。层析技术的基本步骤包含平衡、上样、洗脱，需根据纯化对象的不同，来探索优化洗脱方案。线性梯度洗脱虽为标准方法，且精确度高，但阶梯洗脱方法往往有更好的效果，实验中需摸索不同洗脱浓度下的洗脱体积，以确定针对特定蛋白样品的最佳方案。如果单一一种层析方法的纯化效果不佳，可尝试采用多种层析方法进行纯化。实验内容实验培训中纯化的目标蛋白为在BL21（DE3）菌株中表达的带His标签的可溶融合蛋白，蛋白由IPTG诱导表达，通过超声破碎法裂解细菌得到粗蛋白，在通过亲和层析

6、、蛋白酶切、离子交换层析技术获得纯度达90%以上的目标蛋白。一、 实验材料：1.仪器：高速冷冻离心机、恒流泵、蛋白核酸检测仪（见图1）、电泳仪、pH计图12.层析柱：IMAC预装柱、Q预装柱、SP预装柱3.试剂：Tris、NaCl、Imidazole、Ni2SO4、EDTA、NaOH、重组肠激酶Enterokinase二、 实验方法：1. 诱导表达加入量为：1ml菌液加入1l 0.5mIPTG，37诱导3h.2. 破菌 破菌buffer：20mM Tris 250mM NaCl 10mM Imidazole,pH 8.0 20:1(ml/g)比例用破菌buffer重悬菌体，10探头400W超声

7、4s,停止6s，循环99次。中间暂停一次搅拌均匀。破菌液12000rpm离心20min。3. 亲和层析：Column：IMAN预装柱（规格1ml）Buffer A：20mM Tris 250mM NaCl 10mM Imidazole,pH 8.0Buffer B：20mM Tris 250mM NaCl 500mM Imidazole,pH 8.0Flow rate: 1.5ml/min 清洗柱子：100mM EDTAddH2O0.2M NaOHddH2O，每种清洗液至少10个柱体积，最后一步冲ddH2O至流出液pH约为中性。 挂Ni：冲100mM Ni2SO4至流出液出现绿色，用至少10个

8、柱体积ddH2O洗柱，去掉多余未螯合的Ni2+。 平衡柱子：Buffer A平衡至少10个柱体积，归零蛋白核酸检测仪读数。 上样：样品留取40l，其余上柱。 洗脱液配制：用Buffer B配制梯度洗脱液，每个梯度至少10ml，梯度为50mM Imidazole、100 mM Imidazole、250 mM Imidazole。收集洗脱液方法：待蛋白纯化仪出峰时（即读数开始上升）开始收样至峰下降至稳定数值时停止收样。4. 酶切：Digestion buffer：20mM Tris 50mM NaCl，pH 7.5 样品稀释：取200l 250mM Imidazole洗脱液，加入800l Dig

9、estion buffer混匀。 酶切：3个EP管A、B、C，依次加入100l、100l、200l上述混合液，C内加入8l EK酶，混匀取100l加入B混匀取100l加入A。室温酶切1h。5. 离子交换层析：阴离子交换：Column：Q预装柱（规格1ml，His标签结合柱上，目标蛋白穿透，此柱可去除样品中内毒素）Buffer A：20mM Tris pH ±1.5单位PI值Buffer B：20mM Tris 1M NaCl pH ±1.5单位PI值步骤：10ml Buffer A平衡柱子EK酶切样品上样，收集流穿样品10ml Buffer A平衡柱子100/300/500

10、mM/1M NaCl 和0.2M NaOH洗脱，收集洗脱液各取40l电泳阳离子交换：Column：SP预装柱（规格1ml，目标蛋白结合柱上，此柱可去除样品中内毒素并对样品进行浓缩）Buffer A：20mM Tris pH ±1.5单位PI值Buffer B：20mM Tris 1M NaCl pH ±1.5单位PI值步骤：10ml Buffer A平衡柱子QFT上样，收集流穿样品10ml Buffer A平衡柱子100/300/500mM/1M NaCl 和0.2M NaOH洗脱，收集洗脱液各取40l电泳三、 透析、超滤、浓缩至保存体系1、 透析袋处理及透析 裁剪合适大小

11、的透析袋。 大体积2% NaHCO3和1mM/L EDTA（pH 8.0）中将透析袋煮沸10min。 去离子水彻底清洗透析袋。 1mM/L EDTA（pH 8.0）煮沸10min。 冷却后存于4，透析袋始终浸没于液体中，此后均需带手套操作。 透析袋验漏后，将待透析液体加入透析袋内，置于透析液中4透析过夜。2、 超滤浓缩去离子水润洗滤膜，透析液润洗滤膜，加入样品，4低温4000rpm （速度过大易破坏滤膜）2min预超滤，根据样品超滤速率，调整此后超滤时间，切勿使滤膜干掉。超滤完后，吹打匀样品后再继续超滤。附 1：超滤管处理方法新管：去离子水、透析buffer润洗旧管：0.1M NaOH 浸泡30min，用枪吹打，