植物生理指标检测方法

1、植物组织中可溶性糖含量的测定在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等； 分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为nh 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。蒽酮法测定可溶性糖一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定

2、量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下， 用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此， 有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外， 不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之， 半乳糖、甘露

3、糖较浅， 五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620 nm ，故在此波长下进行比色。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物鲜样或干样。（二）试剂1. 80 乙醇。2. 葡萄糖标准溶液（100 g/ml ）：准确称取100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100 ml ，使用时再稀释10 倍（100 g/ml ）。3 蒽酮试剂： 称取 1.0 g 蒽酮，溶于80% 浓硫酸（将98% 浓硫酸稀释， 把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中）1000 ml 中，冷却至室温，贮于

4、具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2 3 周。（三）仪器设备分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（5 、 1 、 0.5 ml ），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。三、实验步骤1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 1.0 g （或干样粉末5 100 mg ），放入大试管中，加入15 ml 蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min ，取出冷却，过滤入100 ml 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。2. 标准曲线制作取6 支大试管，从0 5 分别编号，按表24-1 加入各试剂。表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量试剂管号0

5、 1 2 3 4 5 100 g/ml 葡萄糖溶液（ml ）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ）1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蒽酮试剂（ml ）5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 葡萄糖量（g ）0 20 40 60 80 100 将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10 min ，取出冷却，在620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（g ）为横坐标绘制标准曲线。3 样品测定取待测样品提取液1.0 ml 加蒽酮试剂5 ml ，同以上操作显色测定光密度。重复3 次。四、结果计算溶性糖含量（）从标准曲线查得糖的量（g）

6、 提取液体积（ ml） 稀释倍数 /测定用样品液的体积 (ml) 样品重量 (g) 106 100式中：c 从标准曲线查得葡萄糖量，g 。v t 样品提取液总体积, ml 。v 1 显色时取样品液量，ml 。w 样品重（g ）。植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位/mg 蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有lowry 法和考马斯亮蓝g-250 染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。1考马斯亮蓝法一

7、、 实验原理考马斯亮蓝g-250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝g-250 在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465 nm，后者在595 nm。在一定蛋白质浓度范围内（0-100 g/ml ） ，蛋白质色素结合物在595 nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝g-250 结合在 2 min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1 h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。二、 实验材料、仪器和试剂1.材料小麦叶片或其他植物组织2.仪器

8、设备分光光度计， 离心机，研钵，25 ml 容量瓶 1 个，刻度吸管 0.5 ml 2 支，2 ml 1 支，10 ml试管 3 支。3.试剂(1)牛血清白蛋白配成1000 g/ml 和 100 g/ml。(2)考马斯亮蓝g-250：称取 100 mg 考马斯亮蓝g-250 溶于 50 ml 90%乙醇中，加入85%（ w/v ）磷酸100 ml，最后用蒸馏水定容至1000 ml。此溶液在常温下可放置一个月。(3)90%乙醇(4)磷酸（ 85%， w/v ）三、 实验步骤：1.可溶性蛋白的提取称取新鲜植物叶片0.5 g 置于研钵中，加入5 ml 4oc 下预冷的浓度为50 mmol/l ，ph

9、 7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10 ml 离心管中，在4 oc 冰箱中静置10 min，于 15000 rpm/min 下冷冻离心 25 min，上清液即为过氧化物粗提液。4 oc 下保存备用。2.标准曲线的绘制(1)0-100 g/ml 标准曲线的制作取 6 支试管， 按下表数据配制0-100 g/ml 血清白蛋白液各1 ml。准确吸取所配各管溶液0.1 ml，分别放入 10 ml 具塞试管中， 加入 5 ml 考马斯亮蓝g-250 试剂， 盖塞， 反转混合数次， 放置 2 min 后，在 595 nm 下比色，绘制标准曲线。配制 0-100 g/ml血清白蛋白液管号1

10、2 3 4 5 6 100 g/ml牛血清蛋白量 (ml) 蒸馏水量 (ml) 蛋白质含量 (mg) 0 1.0 0 0.2 0.8 0.02 0.4 0.6 0.04 0.6 0.4 0.06 0.8 0.2 0.08 1.0 0 0.10 (2)0-1000 g/ml 标准曲线的制作另取 6支试管， 按表 10-2 数据配制0-1000 g/ml牛血清白蛋白溶液各1 ml。与步骤 （1）操作相同，绘出 0-1000 g/ml 的标准曲线。配制 0-1000 g/ml血清蛋白血液管号7 8 9 10 11 12 1000 g/ml 牛血清白蛋白（ml ）蒸馏水量 (ml) 蛋白质含量 (mg

11、) 0 1.0 0 0.2 0.8 0.2 0.4 0.6 0.4 0.6 0.4 0.6 0.8 0.2 0.8 1.0 0 1.0 3.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1 ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管） ，加入 5 ml考马斯亮蓝g-250 试剂，充分混合，放置2min 后在 595 nm 下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。四、 结果计算与分析样品蛋白质含量（mg/g 鲜重） =式中c查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg） ；v提取液总体积（ml） ；a测定所取提取液体积（ml） ；w取样量（ g） 。wavc叶绿素测定方法1、

12、 称取剪碎叶片0.2g，放入容量瓶。2、 加 50ml 95% 的乙醇。3、 遮光浸提48-72 小时，中间摇晃一次。 （保证各批次浸提时间一致）4、 分光光度计测吸光值，三波长（649， 665，470） ，分别对应叶绿素a、b 和其他。空白为95%乙醇。计算公式如下：ca=13.95*d665-6.88*d649 c 单位： mg/l 叶绿素 a=ca*0.05/2 叶绿cb=24.96*d649-7.32*d665 叶绿素 b=cb*0.05/2 c其他=(1000*d470-2.05*ca-114.8cb)/245 叶绿素其他=c其他*0.05/2 总叶绿素含量为三者之和。一般叶绿素a

13、/b 为 3： 1 至 4： 1 选择的波长不一样，计算公式就不一样，网上也有其他的波长方法，计算公式里的系数响应也有差异。淀粉含量的测定原理淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量(c6h12o6 )n ( c6h10o5) n + nh2o 糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。在 625 nm 波长下的 od 值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色仪器用具和试剂1.仪器用具： 移液枪、10ml 离心管、试管、50ml 容量瓶

14、、试管架、棕色瓶（ =500ml ） 、 螺口瓶（=500ml ） 、烧杯、移液管（连续加样器）、离心机、分光光度计；2.试剂：葡萄糖标准液：精确称取0.1000g 蔗糖（分析纯） ，于小烧杯中加水溶解，定容至100ml ，加 2-3 滴浓 h2s04，该溶液可长期保存；葡萄糖标准液:准确吸取1mg/ml 的蔗糖标准液5ml，加水定容量50ml，得到浓度为0.1mg/ml 蔗糖标准液；蒽酮溶液： 100mg 蒽酮溶于50ml 浓 h2s04（化学纯）中，避光保存，当天配制当天使用；3mol/l naoh 溶液： 12g 氢氧化钠溶于100ml 蒸馏水；3mol/l hcl 溶液： 25ml 浓

15、盐酸与 75ml 蒸馏水混匀。测定方法1.植物淀粉相关溶液的提取：向测可溶性糖所剩残渣中加入7ml 3mol/l 的盐酸，在沸水浴中煮沸45 分钟，取出冷却，4000 转/分离心 15 分钟，取上清到50ml 容量瓶中，加入7ml 3mol/l naoh ，用蒸馏水定容到 50ml，作为待测样品。2.标准曲线的配制：吸取0.1mg/ml 葡萄糖标准液按下表加入至11 支试管：0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.1mg/ml 葡糖 (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 蒸馏水 (ml) 2 0.9 0.8 0.7 0.6 0.

16、5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 葡糖浓度（ mg/ml ）0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 蒽酮试剂 (ml) 8.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 45水浴中显色1015 分钟， 625 nm 处测 od 值3.准确吸取待测液1.0ml， 加蒽酮 4.0ml， 在 45水浴中显色10-15 分钟，各管在加入蒽酮试剂时要迅速，加完后用力振荡混匀。4.取出后避光冷却，在625 nm 处测 od 值，从标准曲线上得到提取液中可溶性总糖含量。结果计算葡萄糖糖含量（%）=标准曲

17、线对应含糖量 定容体积 100（样品质量 显色吸取液体积 103）粗淀粉含量（%） =葡萄糖含量 0.9强酸溶液，注意安全超氧化物歧化酶 (sod)的测定一、 实验原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod， ec 1.15.1.1)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(nbt) 在光下的还原作用来确定酶活性大小。在氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基o2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm 处有最大吸收。而sod 可清除 o2，从而抑制了甲腙的形成。于是

18、光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性的大小。二、 实验材料、仪器和试剂：1.材料小麦叶片或其他植物组织2.仪器设备高速离心机；分光分度计；微量进样器；荧光灯(反应试管处理度为4000 lx)；试管或指形管数支。3.试剂(1)1.50 mmol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.8)。(2)2.130 mmol/l 甲硫氨酸 (met) 溶液：称1.9399 g met 用磷酸缓冲液定容至100 ml。(3)3.750 mol/l氮蓝四唑 (nbt) 溶液：称取0.06133 g nbt 用磷酸缓冲液定容至100 ml，避光保存。(4)4. 100 mol

19、/l edta-na2溶液：称取0.03721 g edta-na2用磷酸缓冲液定容至1000 ml。(5)5. 20 mol/l核黄素溶液：称取0.0753 g 核黄素用蒸馏水定容至1000 ml 避光存。三、 实验步骤：1.显色反应取 5 ml 指形管数支，测定管数目依据处理而定，另4 支为对照管，按表2 依次加入下列各溶液对照管用缓冲液代替酶液，蒸馏水 0.25 ml。将其中 2 支对照管置于暗处，其它置于4000 lx 日光下反应20 min左右，主要看颜色的变化，全部变成灰色，对照可能较浅。2.测定待反应结束，以不照光的对照管做空白，依次测定其它各管的吸光值。表 2 各溶液显色反应用

20、量试剂 (酶) 用量 (ml) 终浓度 (比色时 ) 0.05 mol/l 磷酸缓冲液1.5 130 mmol/l met 溶液0.3 13 mmol/l 750 mol/l nbt溶液0.3 75 mol/l 100 mol/l edta na2液0.3 10 mol/l 20 mol/l 核黄素0.3 2.0 mol/l 酶液/缓冲液（对照）0.1 对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.2 总体积3.0 四、 结果计算与分析已知 sod 活性单位以抑制nbt 光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算sod 活性。sod 总活性sod 比活力式中： sod 总活性以酶单位每克鲜重表示。比活

21、力单位以酶单位每毫克蛋白表示。ack 照光对照管的吸光度。ae 样品管的吸光度。vt 样品液总体积，ml。vt 测定时样品用量，ml 。w 样品鲜重， g。蛋白质含量单位为mg/g。五、 注意事项1.配好的 met 溶液须在4冰箱中保存备用，以防止met 活性损失。2.配好的 nbt 溶液须放入棕色试剂瓶，并在4冰箱中保存备用，以防止nbt 见光分解。3.配好的核黄素溶液须放入棕色试剂瓶避光保存。六、 思考题1.在 sod 测定中为什么设照光和暗中两个对照管? 2.影响本实验准确性的因素是什么? 应如何克服? vtwackvtaeackfwgu5.0)()(/蛋白质含量总活性蛋白sodmgu)

22、(/实验六植物抗氧化酶活性的测定酶液的提取称取新鲜植物叶片0.5 g 置于研钵中，加入5 ml 4oc 下预冷的浓度为50 mmol/l ，ph 7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10 ml 离心管中，在4 oc 冰箱中静置10 min，于 15000 rpm/min 下冷冻离心 25 min，上清液即为过氧化物粗提液。4 oc 下保存备用。1过氧化氢酶 (cat)的活性测定植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而导致h2o2累积。 h2o2可以直接或间接地氧化细胞内的核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除植物体内的h2o

23、2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此， 植物组织中过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。一、 实验原理h2o2在 240 nm波长下有强吸收，过氧化氢酶(catalase, cat, ec 1.11.1.6) 能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度 (a240)随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。二、 实验材料、仪器和试剂1.材料小麦叶片或其他植物组织2.仪器设备紫外分光光度计， 离心机，研钵，25 ml 容量瓶 1 个，刻度吸管 0.5 ml 2 支，2 ml 1 支，10 ml 试管 3 支，恒温水浴锅。3.试剂(1)0.2 mol/l ph7.8 磷酸缓冲

24、液 (内含 1%聚乙烯吡咯烷酮)。(2)0.1 mol/l h2o2 (用 0.1 mol/l 高锰酸钾标定 )。三、 实验步骤：取 10 ml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管， 1 支为空白管 (将酶液煮死 )，按表 1 顺序加入试剂。表 1 紫外吸收待测样品测定液配制表试剂 (酶) 管号s0s1s2粗酶液 (ml) 0.2 0.2 0.2 ph 7.8 磷酸缓冲液 (ml) 1.5 1.5 1.5 蒸馏水 (ml) 1.0 1.0 1.0 25 oc 预热后， 逐管加入0.3 ml 0.1 mol/l 的 h2o2， 每加完 1 管立即计时， 并迅速倒入石英比色杯中，240 nm

25、下测定吸光度，每隔l min 读数 1 次，共测4 min，待 3 支管全部测定完后，计算酶活性。四、 结果计算与分析以 1min 内 a240减少 0.1 的酶量为1 个酶活单位 ( )。过氧化氢酶活性式中： a240 as0 (as1+as2)/2。as0 加入煮死酶液的对照管吸光度。as1、as2 样品管吸光度。vt 粗酶提取液总体积(ml) 。v1 测定用粗酶液体积(ml) 。fw 样品鲜重 (g)。0.1 a240每下降0.1 为 1 个酶活单位 ( )。t 加过氧化氢到最后一次读数时间(min) 。注意：凡在240 nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。五、 注意事项1.试剂中的h

26、2o2的浓度对测定结果影响较大，要注意标定的准确性。2.缓冲液中必须加pvp，以防止酶活性降低。六、 思考题1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？2. 超氧化物歧化酶 (sod)的测定七、 实验原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod， ec 1.15.1.1)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(nbt) 在光下的还原作用来确定酶活性大小。在氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基o2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm 处有最大吸收。而sod 可清除

27、o2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性的大小。八、 实验材料、仪器和试剂：1.材料小麦叶片或其他植物组织2.仪器设备高速离心机；分光分度计；微量进样器；荧光灯(反应试管处理度为4000 lx)；试管或指形管数支。3.试剂(6)1.50 mmol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.8)。(7)2.130 mmol/l 甲硫氨酸 (met) 溶液：称1.9399 g met 用磷酸缓冲液定容至100 ml。(8)3.750 mol/l氮蓝四唑 (nbt) 溶液：称取0.06133 g nbt 用磷酸缓冲液定容至100 ml，避光

28、保存。(9)4. 100 mol/l edta-na2溶液：称取0.03721 g edta-na2用磷酸缓冲液定容至1000 ml。(10) 5. 20 mol/l核黄素溶液：称取0.0753 g 核黄素用蒸馏水定容至1000 ml 避光存。九、 实验步骤：fwtvvtagu11.0240min)/(3.显色反应取 5 ml 指形管数支，测定管数目依据处理而定，另4 支为对照管，按表2 依次加入下列各溶液对照管用缓冲液代替酶液，蒸馏水 0.25 ml。将其中 2 支对照管置于暗处，其它置于4000 lx 日光下反应20 min左右，主要看颜色的变化，全部变成灰色，对照可能较浅。4.测定待反应

29、结束，以不照光的对照管做空白，依次测定其它各管的吸光值。表 2 各溶液显色反应用量试剂 (酶) 用量 (ml) 终浓度 (比色时 ) 0.05 mol/l 磷酸缓冲液3 130 mmol/l met 溶液0.6 13 mmol/l 750 mol/l nbt溶液0.6 75 mol/l 100 mol/l edta na2液0.6 10 mol/l 20 mol/l 核黄素0.6 2.0 mol/l 酶液0.1 对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.5 总体积6.0 十、 结果计算与分析已知 sod 活性单位以抑制nbt 光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算sod 活性。sod 总活性s

30、od 比活力式中： sod 总活性以酶单位每克鲜重表示。比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。ack 照光对照管的吸光度。ae 样品管的吸光度。vt 样品液总体积，ml。vt 测定时样品用量，ml 。w 样品鲜重， g。蛋白质含量单位为mg/g。十一、注意事项4.配好的 met 溶液须在4冰箱中保存备用，以防止met 活性损失。5.配好的 nbt 溶液须放入棕色试剂瓶，并在4冰箱中保存备用，以防止nbt 见光分解。6.配好的核黄素溶液须放入棕色试剂瓶避光保存。十二、思考题3.在 sod 测定中为什么设照光和暗中两个对照管? 4.影响本实验准确性的因素是什么? 应如何克服? 3过氧化物酶 (pod)

31、活性的测定一、 实验原理vtwackvtaeackfwgu5.0)()(/蛋白质含量总活性蛋白sodmgu)(/过氧化物酶 (peroxidases, pod, ec 1.11.1.7)是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶， 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等有密切关系，当植物受到环境胁迫时，酶活性就会发生变化。在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化，测定过氧化物酶活性。二、 实验材料、仪器和试剂1.材料小麦叶片或其他植物组织2.仪器设备分光光度计，研钵， 100 ml 容量瓶，吸管

32、，离心机。3.试剂(1)50 mmol/l 磷酸缓冲液ph 7.0。(2)过氧化氢：取30%的过氧化氢613 l 用蒸馏水定容至50 ml，备用。(3)含愈创木酚的混合液：取60.3 l 愈创木酚溶于50 mmol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.0)的烧杯中，置于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，用磷酸缓冲液ph 7.0 定容至 200 ml，保存于冰箱中，备用。三、 实验步骤取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入水或磷酸缓冲液(ph 7.0) 50 l，反应混合液2.9 ml 和过氧化氢 60 l ，作为对照，另1 只中加入酶液50 l( 如酶活性过高可稀释之)

33、，反应混合液2.9 ml 和过氧化氢60 l ，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470 nm 下吸光度值，每隔1min 读数一次。四、 结果计算与分析以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以a 470/ming(fw) 表示之。也可以用每分钟内a470变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位(u)表示。过氧化物酶活性式中： a470 反应时间内吸光度的变化。w 植物鲜重， g。vt 提取酶液总体积，ml。vs 测定时取用酶液体积，ml 。t 反应时间， min。五、 注意事项1.愈创木酚的含量会影响测定结果，在配制愈创木酚溶液时，必须准确量取。2.h2o2须准确配制六、 思考题

34、1.在 pod 测定的过程中不设置对照对实验结果有无影响？为什么？tvswvtagu01.0470min)/(淀粉酶活力的测定方法淀粉酶主要包括 -淀粉酶、 -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和r-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是 -淀粉酶和 -淀粉酶。 -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分 -1,4 糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、 -极限糊精和少量葡萄糖。 ca 2+能使 -淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸， ph 3.6 以下可使其钝化。 -淀粉酶从非还原端作用于 -1,4糖苷键，遇到支链淀粉的 -1,6 键时停止。单

35、独作用时产物为麦芽糖和 -极限糊精。 -淀粉酶是一种巯基酶，不需要ca 2+ 及 cl 等辅助因子，最适 ph 偏酸，与 -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 保温 15min 可使其钝化。通常提取液中 -淀粉酶和 -淀粉酶同时存在。可以先测定（ + ）淀粉酶总活力，然后在 60 加热 15 min ，钝化 -淀粉酶，测出 -淀粉酶活力，用总活力减去 - 淀粉酶活力，就可求出 - 淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的3- 氨基 -5- 硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。

36、以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。1 酶活测定方法（1）标准曲线的制作 (见下表 ) 取 7 支 20 ml 具塞刻度试管 ,预先洁净灭菌干燥 ,编号,按表加入试剂。摇匀 ,至沸水浴中煮沸 5 min。 取出后流水冷却 ,加蒸馏水定容至 20 ml,以 1 号管作为空白调零点 ,在 520 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。试剂1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（ ml ）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 h2o（ml）2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 3,5-二硝基水杨酸（ml）2.0

37、2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 麦芽糖含量（ mg）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 od520(2)粗酶液淀粉酶活力测定待测粗酶液的制备：发酵 24 h 后发酵液 4000 r/ min 离心 10 min,去除菌体，在上清液中加入65饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4盐析 2h，然后 5000r/min 离心 20min，得到初步纯化的淀粉酶。表 1 标准麦芽糖溶液成分表及od 测定值按以下顺序操作：取预先洁净灭菌干燥试管,编号。取粗酶液1 ml 于各只试管中，各只试管分别加入3ml蒸馏水，于 60水浴中预热 5min，各加 1ml 2%的淀粉溶液柠檬

38、酸淀粉缓冲液同时在40水中预热 5min， 取柠檬酸淀粉缓冲液1ml 加入试管中 ,于 40水浴中保温 30min加入 1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸 ,沸水中 5 min,加入氢氧化钠溶液终止反应,加蒸馏水至 20 ml。摇匀,用分光光度计测定 od520 nm 值。在上述条件下以单位体积样品在30 min 释放 1 mg 麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力酶活力测定公式：淀粉酶活力 =麦芽糖含量（ mg） 淀粉酶原液总体积（ ml）/所加淀粉质量每个样品按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时

39、间间隔要绝对一致：表 2 样品酶活力测定步骤反应顺序样品（重复3个）样品空白标准空白样品稀释液（ ml）1 1 0 蒸馏水0 0 1 60预热 5min 依 次 加 入 淀 粉 溶 液（ml）1.5 1.5 1.5 混合 60保温 30min 依 次 加 入 dns 试 剂（ml）1.5 1.5 1.5 混合 100煮沸 5min 加入 0.4mol/l naoh 溶液终止反应加入蒸馏水至总体积（ml）20 20 20 反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm 离心 10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计520nm 波长处测定样品空白（ a0）和样品

40、溶液（ a）的吸光值， aa0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。2 活性计算酶活力单位定义：在60、ph5.6 条件下，每小时从2的可溶性淀粉溶液中释放出1mg尔麦芽糖的酶量定义为1 个酶活力单位（ u）淀粉酶活性 u 按下式计算：u = f 其中： u样品淀粉酶活性， u/ml；k标准曲线斜率；f样品溶液反应前的总量，ml；s样品测试量；表 1 中 s1ml； k（ aa0）s（ 3060） 180601 小时为 60min；30反应时间， min。试剂(1)2% 淀粉溶液(2) 0.4mol/l 氢氧化钠(3) ph5.6 柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g ，溶解后定容至

41、1000ml ，为 a 液。称取柠檬酸钠29.41g ， 溶解后定容至1000ml ， 为 b 液。 取 a 液 13.7ml 与 b 液 26.3ml 混匀，即为ph5.6 之缓冲液。(4) 精确称取1g3,5- 二硝基水杨酸溶于20ml 1mol/l 氢氧化钠中，加入50ml 蒸馏水，再加入30g 酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100ml ，盖紧瓶塞，防止co2进入。植物组织游离脯氨酸含量的测定原理：植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，

42、快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样 )限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后， 此缩合物在波长520nm 处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。材料、仪器设备及试剂1材料：植物叶片2仪器设备： 分光光度计； 水浴锅： 漏斗：大试管 (20m1)；具塞刻度试管(20m1) 注射器或滴管 (5loml) 。3试剂：(1)3磺基水杨酸溶液(2)甲苯；(3)2.5酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mo1.l-l 磷酸以 3:2 混合，作为溶剂进行配制，此液在4下 23 天有效 (4)脯氨酸标准溶液：准确称取25mg 脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至2

43、50ml，其浓度为100ug.ml-l 。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至looml ，即成 10gml-1 的脯氨酸标准液。1 标准曲线制作 （1） 取 7 支具塞刻度试管按表9.2-1 加入各试剂。 混匀后加玻璃球塞， 在沸水中加热40min。(2)取出冷却后向各管加入5ml 甲苯充分振荡， 以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0 号管匀对照在波长 520nm 下比色。（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程921 各试管中试剂加入量试管0 1 2 3 4 5 6 脯氨酸标准溶液(m1) 0 02 04 08 1 2 16 20 水(m1) 2 18 1

44、6 12 0 8 04 0 冰乙酸 (m1) 2 2 2 2 2 2 2 茚三酮显色液(m1) 3 3 3 3 3 3 3 样品测定（1）脯氨酸提取：取不同处理的剪碎混匀植物叶片0205g(干样根据水分含量酌减)，分别置于大试管中，加入5m1 3磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。 (2)取出试管， 待冷却至室温后， 吸取上清液2m1，加 2m1 冰乙酸和3m1 显色液， 于沸水浴中加热40min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml 甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm 下比色）。 (3)结果计算：

45、从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度脯氨酸含量的百分数。脯氨酸 g.g -1(干或鲜重 )(c v) (a w)1 式中： c 一提取液中脯氨酸浓度(ps)，由标准曲线求得： v 提取液总体积（ml） a - 测定时所吸取得体积（ml） w- 样品重（ g）实验一植物激素的酶联免疫吸附测定法（elisa ）一、 实验目的学习植物激素的elisa 测定原理，掌握激素测定技术和样品提取方法。二、 实验原理免疫测定的方法是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。由于酶联免疫吸附分析法（ enzym

46、e-linked immunosorbent assays, 简称 elisa ）具有灵敏性高且快速、简便、成本低廉、无放射性污染等特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。目前，几大类植物激素iaa 、aba 、ga3、ga4、ipa、 zr 和 dhzr 等都建立了相应的elisa 方法并有试剂盒出售。elisa 是建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即抗原和抗体反应的高度专一性和敏感性；酶的高效催化特性。elisa 把这而这有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。elisa 根据均相、非均相以及竞争与非竞

47、争可分为非竞争固相免疫测定、非竞争均相免疫测定、竞争均相、竞争固相测定。常用的免疫测定均为非竞争固相和竞争固相免疫测定统称为酶联免疫吸附测定。所用的吸附载体为聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯酶联板以及硝酸纤维素膜（dot-elisa ）等。目前植物激素的酶联免疫检测方法有三种形式（见下图）：直接法，间接法和简化的间接法。直接法 是在固相载体上直接包被抗体（或先包被二抗， 再加一抗。 此为直接包被抗体的一种变通形式），利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。ab+h+he=abh+abhe 其中 ab 表示抗体， h 表示游离激素，he 表示酶标抗原。根据质量作用定律，当该反应体系中ab 及he 的

48、量确定时，游离h 越多，abh 形成的就越多，而abhe 形成的就越少，即结合在板上的酶标抗原就越少；反之游离h 越少，abh 形成的就越少，而abhe 形成的就越多，即结合在板上的酶标抗原就越多。通过检测酶的活性，就可以确定游离h 量的多少。间接法和简化的间接法是包被抗原（间接法） 。利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。间接法是竞争后，再加入二抗标记的酶，而简化的间接法是在竞争的同时就加入二抗标记的酶。ab+h+hp=abh+abhp 其中 ab 表示抗体，h 表示游离激素， hp 表示吸附在板上的激素蛋白质复合物。根据质量作用定律，当该反应体系中ab 及 hp 的量确定时，游离h 越

49、多， abh 形成的就越多，而abhp 形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少；游离h 越少， abh 形成的就越少，而abhp 形成的就越多，即结合在板上的抗体就越多。而板上的抗体可以与二抗标记的酶结合，检测酶的活性，就可以确定游离h 量的多少。间接法直接法简化间接法三、 实验材料、仪器和试剂1.材料新鲜植物材料2.仪器设备研钵，冷冻离心机，氮气吹干装置，酶联免疫检测仪，吸水纸，恒温箱，冰箱，96 孔酶标板，可调微量液体加样器（10 l ， 40 l ，200 l ，1000 l ） ，带盖瓷盘（内铺湿纱布）。3.试剂(1)包被缓冲液： 称取 1.5 g na2co3, 2.93 g nah

50、co3, 0.2 g nan3（可不加） , 用量筒加1000 ml 蒸馏水，ph 为 9.6。(2)磷酸盐缓冲液（pbs） ：称取 8.0 g nacl, 0.2 g kh2po4, 2.96 g na2hpo4 12h2o，用量筒加1000 ml 蒸馏水， ph 为 7.5。(3)样品稀释液：500 ml pbs 中加 0.1 ml tween-20，0.5 g 明胶（稍加热溶解） 。(4)底物缓冲液：称取5.10 g c6h8o7 h2o（柠檬酸）， 18.43 g na2hpo4 12h2o，用量筒加1000 ml 蒸馏水溶解，再加1 ml tween-20， ph 为 5.0。(5)

51、洗涤液： 1000 ml pbs 加 1 ml tween-20。(6)终止液： 2 mol/l 硫酸。(7)提取液： 80甲醇，内含1 mmol/l bht( 二叔丁基对甲苯酚为抗氧化剂，先用100%甲醇溶解bht ，再配成 80%的浓度。否则bht 难溶解 )。(8)各激素包被抗原、各激素抗体、激素标准物和辣根过氧化物酶（hrp）标记的二抗（间接和简化间接酶免疫测定用试剂） 。各激素抗体、激素标准物和各激素酶标物（直接酶免疫测定用试剂）。四、 实验步骤1. 样品中激素的提取(1)称取 0.5-1.0 g 新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20的低温冰箱中） ，加

52、2 ml 样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10 ml 试管，再用2 ml 提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4冰箱中。(2)4下提取 4 h， 1000 g 离心 15 min( 实验中离心机型号ldz5-2 ， 约 4000 rpm), 取上清液。沉淀中加1 ml提取液，搅匀，置4下再提取1 h，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。(3)上清液过c-18 固相萃取柱。具体步骤是：80%甲醇（ 1 ml ）平衡柱 上样 收集样品 移开样品后用 100%甲醇（ 5 ml）洗柱 100%乙醚（ 5 ml）洗柱 100%甲醇（ 5 ml）洗柱 循环。(4)将过柱后的样品转入

53、5 ml 塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液定容（一般0.5 g 鲜重用 1.5-3.0 ml 左右样品稀释液定容） 。2. 样品测定(1)包被：在10 ml 包被缓冲液中加入一定量的包被抗原（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀，在酶标板每小孔中加100 l 。然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置于37下 3 h。(2)洗板：将包被好的板取出，放在室温下平衡。然后甩掉包被液，将下口瓶内的洗涤液通过乳胶管均匀加入板上，使每孔充满洗涤液，放置约0.5 min,再甩掉洗涤液。重复3 次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。(3)竞争：即加标准物、待测样和抗体。a

54、)加标样及待测样：取样品稀释液0.98 ml，内加 20 l激素的标样试剂（100 g/ml ）,即为 2000 ng/ml 标准液，然后再依次稀释1000 ng/ml, 500 ng/ml,250 ng/ml,125 ng/ml,62.5 ng/ml，31.25 ng/ml ，15.625 ng/ml ，0 ng/ml 。将系列标准样加入96 孔酶标板的前三行，每个浓度加3 孔，每孔 50 l ，其余孔加待测样，每个样品重复三孔，每孔50 l 。b)加抗体：在5 ml 样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签）,混匀后每孔加50 l ，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。c)竞争条

55、件37左右 0.5 h。(4)洗板：方法同包被之后的洗板。但要注意第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。目的是防止各孔的相互干扰。(5)加二抗：将一定量的酶标二抗，加入10 ml 样品稀释液中（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀后，在酶标板每孔加100 l ，然后将其放入湿盒内，置37下，温育0.5 h。(6)洗板：方法同竞争之后的洗板（步骤4） ，洗五次，(7)加底物显色：称取10-20 mg 邻苯二胺（ opd）溶于 10 ml 底物缓冲液中（小心勿用手接触opd） ，完全溶解后加2-4 l 30% h202。混匀，在每孔中加100 l （在暗处操作） ，然后放入湿盒内，当显色适

56、当后（即0 ng/ml 孔与 2000 ng/ml 孔的 od 差值约为1.0 左右时），每孔加入50 l 2 mol/l硫酸终止反应。(8)比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品492 nm 处的 od 值。五、 结果计算与分析1. 标准曲线用于 elisa 结果计算最方便的是logit 曲线。曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/ml ）的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit 值表示。 logit 值的计算方法如下：b/b0b logit （ b/b0）=ln =ln1-b/b0b0-b 其中 b0是 0 ng/ml 孔的显色值， b 是其它浓度的显色值。作出的l

57、ogit 曲线在检测范围内应是直线。待测样品可根据其显色值的logit 值从标准曲线计算出所含激素浓度（ng/ml）的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度（ng/ml） 。2. 含量计算求得样品中激素的浓度后，样品中激素的含量（ng/gfw）可用下式计算：n v2 v3 b a = v1 w 其中， a 表示激素的含量（ng/gfw ） ；v2表示提取样品后，上清液的总体积；v1表示进行真空浓缩干燥的上清液体积；（当提取的上清液全部进行真空浓缩干燥时v1与 v2的体积是相等的）v3表示真空浓缩后用样品稀释液定容的体积；w 表示样品的鲜重；n 表示样品中激素的浓度（ng/ml） ；b 表示样

58、品的稀释倍数（样品稀释液定容以后的稀释倍数）。无菌技术与微生物分离培养一、实验室的主要仪器和常用器皿介绍1主要仪器天平、光学显微镜、 干热灭菌用电烘箱、 高压蒸气灭菌锅、 培养箱、冰箱、摇床、离心机、分光光度计、 ph 计、水浴锅、细菌过滤器、磁力搅拌器等。2常用玻璃器皿试管、培养皿、三角瓶、吸管、量筒、漏斗、烧杯、烧瓶、试剂瓶、滴瓶、干燥器、载玻片、盖玻片3.其它器具接种环、接种针、接种钩、试管架、铝锅、染色缸、玻璃刮刀、洗瓶、注射器、酒精灯、硅胶塞、滤纸、 ph 试纸、纱布、棉花、包扎绳。二、普通光学显微镜观看细胞示范光学显微镜可分辨大于0.2um 的物体，有一定的适用范围。如果有更高的实

59、验要求可以选择扫描电子显微镜、透射电子显微镜、扫描隧道显微镜。（附观察到的细胞视野图片）三、器具洗涤与干燥1、洗涤剂a.肥皂、洗洁精、洗衣粉是很好的去污剂，用于除去器皿上沾有的少量油脂。去污粉含有碳酸钠、碳酸镁，具有起泡和除油垢作用；硼砂增加了摩擦作用，使去污能力增强。b.重铬酸盐洗涤液，是一种强氧化剂，去污能力很强，常用来洗去玻璃和瓷质器皿上的有机物。c.酸碱洗涤剂1)稀释 3 倍的盐酸。除去铁锈、碳酸钡、钙盐及其他金属氧化物污污痕。2)稀释 3 倍的硝酸。用于塑料器皿和沾污硝酸银器皿的洗涤。3)5.0g 乙二酸溶于 100ml10%的硫酸溶液，经加热可洗去盛过高锰酸钾的容器内壁上的棕色二氧化锰。4)碱性乙醇溶液。 用 30%氢氧化钠和等体积乙醇配制而成，用于清洗有油垢的玻璃器皿和瓷质器皿。具有强腐蚀性，使用时小心。d.其他有机洗涤剂常