固定化嗜麦芽寡养单胞茵的高效聚磷效果及应用研究

1、    固定化嗜麦芽寡养单胞茵的高效聚磷效果及应用研究    佘梦林 张钲 马卫 倪红摘要：为寻找能循环去除富磷废水的生物材料，以筛选鉴定出的高效聚磷菌嗜麦芽寡养单胞菌为材料，测定了该菌的生长曲线，并采用钼锑抗比色法测定该菌的聚磷曲线，比较了游离的嗜麦芽寡养单胞菌和海藻酸钙包埋茵小球对不同浓度含磷废水的聚磷效果。结果表明：游离菌处理5、10、15和20mg/l的舍磷废水24h后，聚磷率分别达到97.8%，96.3%，85.3%和70.7%;即游离菌处理10mg/l含磷废水，24h即可达到排放标准（tp关键词：嗜麦芽寡养单胞菌;聚磷茵;固定化;聚磷效果;应

2、用：x799.3：a：1674-9944（2018）10-0038-041引言水体中磷的含量能够决定藻类和水生植物的生物量。一旦水体中的磷（以p0i计）含量超过0.3mg/l，就会刺激藻类和水生植物的迅猛生长口，导致下层植物光合作用受阻;水中的溶氧量迅速降低;鱼类及其它生物大量死亡。因此，如何降低和处理水体富营养化（eutrophication）一直是当今水污染研究的热点问题。生物除磷技术是指利用生物在生长代谢过程中对磷的吸收、吸附作用达到除磷目的。生物法除磷的运行费用较低，装置自动化水平高，效果突出，不会出现二次污染和污泥膨胀现象，与化学絮凝过程相比优势显著，对治理水体富营养化具有重要意义口

3、。生物除磷主要包括微藻类除磷、水生植物除磷和微生物除磷三类。目前，有关微生物除磷技术的研究最为广泛。有一类微生物能够在好氧环境下从外界过量吸收可溶性磷酸盐，并以多聚磷酸盐（poly-p）的形式贮存;厌氧环境下，这类微生物可以通过释放体内的多聚磷酸盐获得能量，供自身新陈代谢所需，这种现象即luxuryuptake。人们把具有luxuryuptake生物特性的微生物统称为聚磷菌（polyphosphate accumulating organisms，paos），并将其广泛应用于污水的生物除磷技术。本室从磷化工污水处理厂的活性污泥中，筛选鉴定出一株具有高效聚磷作用的嗜麦芽寡养单胞菌，以该菌株为材料

4、，测定了该菌株的生长曲线和聚磷曲线，并采用固定化包埋方法，制备成海藻酸钠包埋菌小球，同时测定了游离菌和包埋小球处理不同浓度磷废水的聚磷效果，最后设计了磷循环处理的固定化反应器，对废水的处理效果进行了尝试，为该菌株更好地净化磷废水，提供了实验依据。2材料和方法2.1微生物菌株本室从某污水处理厂活性污泥中，筛选的高效聚磷嗜麦芽寡养单胞菌（stenotrophomonas maltophdia）作为实验菌株。2.2主要仪器与试剂722n型可见分光光度计（上海精科实业有限公司）、it-09a5型磁力搅拌器（上海一恒科学仪器有限公司）、dhl-d恒流泵（上海驰唐电子有限公司）、氯化钙（cacl2）、海藻

5、酸钠（分析纯）、抗坏血酸（分析纯）、钼酸铵（分析纯）、过硫酸钾（分析纯）、酒石酸锑钾（分析纯）均购于国药化学集团化学试剂有限公司。2.3培养基聚磷培养基：葡萄糖10g、（nh4）2so40.5g、kc10.3g、nac10.3g、fes04·7h200.03g、mns04.4h200.03g、caco35g和kh2po40.0439g，蒸馏水定容至1000ml。用于测定菌株聚磷一生长曲线。模拟废水培养基：葡萄糖0.3g、蛋白胨0.1g、酵母粉0.01g、ch3coonao.15g、nacl0.05g、mgs04·7h800.15g、nh4c10.18g，kh2p04（以p计

6、：10mg/l，0.0439g;以p计：20mg/l，0.0878g），蒸馏水定容至1000ml，ph值为7.0。用于菌株的聚磷性能测定。2.4实验方法2.4.1嗜麦芽寡养单胞菌的生长曲线和聚磷曲线将活化后制备的嗜麦芽寡养单胞菌的种子液（od600=1.0）按2%（v/v）接种至液体聚磷培养基（p含量为10mg/l）中，放入28、150r/min摇床振荡培养48h。每隔一段时间取样1ml，12000r/min离心5mm，菌体用pbs重悬后，测定od600nm，并按gb11893-89-钼锑抗比色法测定上清液的p浓度，测定结果重复3次，并计算聚磷率。聚磷率的计算方式如下：聚磷率（%）=（1-x/

7、x。）×100 （1）式（1）中，x。为p（磷酸盐）的初始浓度;x为p（磷酸盐）的残留浓度，绘制菌株在一个生长周期（48h）内的生长曲线和聚磷曲线，分析细菌的生长量与聚磷率的关系。2.4.2游离菌处理不同浓度含磷废水的聚磷效果实验测定了不同浓度的含磷废水（5、10、15、20mg/l）对菌聚磷效果的影响。将菌种子液（od600nm=1.0）按10%的接种量转接至200ml的模擬废水培养基（以p计：5、10、15和20mg/l）中，于28、150r/min条件下培养。在12、24、36、48、60h几个时间点取样lml离心（12000r/min，5min），测定上清液的磷浓度，测定结果

8、重复三次，计算聚磷率，计算方法同上。2.4.3海藻酸钙包埋嗜麦芽寡养单胞菌小球的制备和对为了提高菌株met70的除磷性能和循环性能，参照文献制备海藻酸钙包埋菌小球：称取2g海藻酸钠溶于30ml无菌水中，加热溶解后冷却至室温，静置消泡。将菌活化并制成odbod=1.0的菌悬液，与上述海藻酸钠溶液等体积混合均匀，无菌水定容至100ml。用50ml注射器将上述混合液缓慢滴入4%的cacl2溶液中，交联固定8h后滤出固定化小球，用生理盐水多次洗涤，4冰箱保存备用。制备海藻酸钙空白小球时将上述菌悬液换成等量无菌水，其余方法相同。分别称取2g固定化包埋菌小球，放入装有200ml的含磷废水（p浓度分别为5、

9、10、15和20mg/l）的500ml锥形瓶中，在28、150×10-0摇床中处理。分别在12、24、36、48和60h几个时间点取样离心（12000×10-6，5min），测定上清液的磷浓度，测定结果重复3次，计算聚磷率，计算方法同上。另称取2g海藻酸钙空白小球加入p浓度为20mg/l的含磷废水，体系和条件如上，测定空白小球对磷的吸附容量，排除海藻酸钙空白小球对磷吸附的干扰。2.4.4包埋茵小球反应器处理磷废水效果的初步实验将制备出的嗜麦芽寡养单胞菌固定化小球按照一定的填充量（100g），置于直径10cm，高度30cm的反应柱子中，100ml、50mg/l磷废水的流速60

10、滴/min，温度为30，ph值为7，包菌量为1.2%，3次循环处理后，测定聚磷效果，测定方法同2.4.1。3结果与分析3.1嗜麦芽寡养单胞菌的生长曲线和聚磷曲线嗜麦芽寡养单胞菌在液体聚磷培养基（p含量为10mg/l）中，28、150×10-6下培养48h。不同时间点对菌的生长量及相应的聚磷率作图，得到菌的生长曲线和聚磷曲线，见图1。由图l可知，嗜麦芽寡养单胞菌的聚磷效率随培养时间的变化而改变：当06h时，菌生长处于适应期，菌体生长速度缓慢（odbodnm=0.06），无显著聚磷效果;当612h时，菌进入对数生长期，此时菌浓度0600迅速增至0.95，聚磷效率由8.8%提高到89.5%

11、;当1228h时，菌生长趋于稳定，聚磷速率较对数期变缓，当菌株到达最大生长量（od600nm=l.572）时上清液p浓度降到最低，约0.47mg/l，此时菌的聚磷率达到最高，为95.58%;在随后的48h内菌的生长量处于动态平衡，培养液的p浓度略有上升的趋势，但总体趋于稳定。结果还表明，菌的聚磷能力与生长量紧密相关，菌体生长代谢越旺盛，聚磷能力越强;另一方面，菌株的聚磷能力并不是随着培养时间的延长而增强，在培养后期，由于次生代谢产物的积累和营养的缺乏，菌株生长进入衰亡期，部分菌体裂解会导致胞内的p释放，使环境中的p含量有所回升。3.2嗜麦芽寡养单胞菌对不同浓度含磷废水的聚磷效果实验嗜麦芽寡养单

12、胞菌在不同时间（12、24、36、48和60h）内，对p含量为5、10、15、20mg/l四个不同浓度的废水的除磷效果如图2所示。由图2可知，模拟废水中的磷浓度不同，菌的聚磷能力也不相同：游离菌处理5、10、15、20mg/l的含磷废水24h后，聚磷率分别为97.8%和96.3%，85.3%和70.7%。即游离菌处理低浓度（p10mg/l）的含磷废水时，24h内可以满足污水综合排放标准（gb8978）中的一级排放标准，即tp结果还表明，随着模拟废水中磷含量的增加，游离菌的除磷效率虽然有所下降，但磷的总积累量有所上升，说明met70能够随外界环境的改变提高自身的聚磷性能，有较好的开发利用潜力;同

13、时聚磷性能在24h达到稳定，这与菌的生长特性相吻合，即环境生长量达到最大时，除磷效率最高。3.2海藻酸钙包埋菌小球的制备和对不同浓度含磷废水按上述方法制备的海藻酸钙空白小球和海藻酸钙包埋菌小球如图3所示。将海藻酸钙空白小球投入p含量为20mg/l的废水中，测定空白小球在不同时间（12、24、36、48和60h）点的聚磷率（见图4）。由图4可知，空白小球对磷有一定的吸附作用，且24h即达到吸附平衡，此时的空白小球聚磷率为41.66%，最大吸附容量约为8.33mg/l。海藻酸钙包埋菌小球按1%的质量体积处理p含量为5、10、15、20mg/l4种不同浓度的废水，测定出不同时间（12、24、36、4

14、8和60h）下的聚磷率如图5所示。由图可知，与游离菌和空白小球处理相比，met70的固定化小球对模拟废水的聚磷能力进一步提升：包埋小球处理5mg/l和10mg/l的含磷废水12h后，聚磷率达到最高，分别为99.9%和98.9%;包埋小球在处理15mg/l和20mg/l的含磷废水48h后，聚磷率达到最高，分别为98.2%和98.54%，且后期的除磷效率起伏变化较小，几乎无释磷现象。实验结果表明，海藻酸钠包埋met70小球的聚磷能力优于空白小球和游离菌。在处理含磷量为5、10、15、20mg/l四种浓度的污水时，met70包埋小球最终都能够满足污水综合排放标准（gb8978）中的一级排放标准（tp

15、< p>3.3包埋菌小球反应器处理磷废水效果的初步实验为探讨包埋菌小球在废水处理中的实际应用，初步设计了磷废水循环处理的工艺流程，如图6所示。初步用测定了该装置在30、ph值为7、包菌量为1.2%条件下，处理100ml、50mg/l含磷废水，经过3次循环处理后，测定聚磷率为87%。说明固定化包埋小球用于循环处理废水，效果比较显著。4讨论4.1嗜麦芽寡养单胞菌的聚磷性能实验在研究嗜麥芽寡养单胞茵聚磷特性的实验中，菌株的除磷效果与生长量紧密相关，因此在实际处理污水过程中，应考虑菌株生长和聚磷最佳的平衡点，才能最大限度的发挥菌株的应用价值;另一方面，菌的聚磷容量会随着外界环境的磷含量升高而增大，可能是磷浓度的增加刺激了聚磷微生物体内磷酸激酶活性，从而使摄磷量得到提高。传统聚磷菌株在污水的cod/p较小即有机物不足时，会由于自