分离技术实验

1、实验一: 双水相萃取牛血清蛋白一.实验目的1.了解双水相系统的成相原理和方法；2.了解制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识；3.掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作；4.掌握分配系数和萃取收率的计算方法。二. 实验原理双水相系统是由两种互不相溶的聚合物（如聚乙二醇（PEG）与葡聚糖（DX）或者互不相溶的聚合物溶液和盐溶液（如PEG与（NH4）2SO4）组成。双水相系统的制备一般是将两种溶质分别配制成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静止一段时间，当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。相图是研究双水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典

2、型的高聚物-高聚物双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。图1 A-B双水相体系相图双水相萃取与有机

3、溶剂萃取原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配原则。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水性、氢键、离子键等）的存在，使得待分离的物质在上、下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化的目的。本实验选择PEG-硫酸铵双水相系统萃取牛血清蛋白。双缩脲反应是指蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子结合生成紫色络合物的反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应，蛋白质含有多个肽键，因此有双缩脲反应，反应生成物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以利用双缩脲反应进行蛋白质的定量测定。三、试剂及仪器仪器：

4、紫外可见分光光度计，电子天平，台式高速离心机，电热恒温水浴箱，漩涡混合仪，滴定管，大试管，离心试管(20mL)6只，移液管(1mL,5mL)，试管（10mL），注射器（10mL）试剂：PEG2000，硫酸铵，牛血清蛋白，双缩脲试剂四、实验内容1.蛋白质溶液标准曲线的测定取七支试管分别加入0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5,0.6mL的标准蛋白质溶液（用标准的结晶牛血清蛋白（BSA）配制成10mg/mL 的标准蛋白溶液），并用水补足到1mL,然后加入4mL双缩脲试剂（A NaOH 3.5mL,，B CuSO4 0.5mL），充分摇匀后在室温下放置30min，在540nm波长下测定吸光度。

5、用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照样。以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。BSA浓度（mg/mL）0.10.20.30.40.50.6吸光度A0.0590.1150.1660.2190.2600.3012.PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定（1）取50%的PEG2000溶液（w/v,g/mL）10.07g，约10mL于大试管中；（2）用40%的硫酸铵溶液（w/v,g/mL）装入滴定管中向大试管滴加，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止，记录硫酸铵消耗的体积。加入1mL水使溶液澄清，继续用硫酸铵滴定至恰好混浊，重复7次，记录每次硫酸

6、铵消耗的体积，计算每次出现混浊时体系中PEG和硫酸铵的浓度（w/v,g/mL）,并填入表1中。表1 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的制作表编号累计加水量(mL) 硫酸铵溶液读数大试管中纯硫酸铵的累计量(g)溶液的总体积（mL）PEG2000的浓度(w/v)硫酸铵的浓度（w/v）100.820.32810.820.46210.0303210.380.48012.200.40980.0393320.440.65613.640.36660.0481430.380.80815.020.33290.0538540.481.00016.500.30300.0606650.581.23218.080.

7、27650.0681760.581.46419.660.25430.0745870.641.72021.300.23470.0808以硫酸铵的浓度（w/v,g/mL）为横坐标，PEG的浓度（w/v,g/mL）为纵坐标作图，即得到PEG2000-硫酸铵的相图。3.利用PEG2000-硫酸铵双水相体系分离牛血清蛋白根据相图，选择三个成相比例，如上图所示，选取了PEG的浓度为0.35g/mL，硫酸铵的浓度分别为6%，7%，8%，取定萃取总体积为18mL，由0.5V/18=0.35可算出需要加入V=12.6mL的PEG溶液，实验称取12.6gPEG溶液，约等于12.6mL。由于还要加入3ml牛血清蛋白

8、溶液，根据m/18=0.06、0.07、0.08可算出分别需要1.06g、1。07g、1.08g固体硫酸铵。18-12.6=2.4mL，即为需加入水的体积。如下图所示。PEG2000浓度（w/v）%35离心管内需加PEG体积/mL12.6管内需加去离子水体积/mL2.4管内需加蛋白溶液体积/mL3硫酸铵浓度（w/v）%678离心管内需加硫酸铵质量/g1.081.261.44实际加入硫酸铵质量/g1.061.251.45实际硫酸铵浓度（w/v）%5.896.948.06 将双水相体系配好后，分别加入3mL浓度为10mg/mL牛血清蛋白溶液。搅拌均匀，3500r/min离心5min，静置分层，分别

9、量取记录上下相的体积，并测量上下相的吸光度。由BSA标准曲线图可得萃取后上下两相中BSA的浓度。硫酸铵浓度（w/v）%678上相体积/mL17.016.315.2上相吸光度0.0350.0320.031上相浓度mg/mL0.3730.3110.2905下相体积（测得）/mL1.01.72.8下相吸光度0.3570.3320.333下相浓度mg/mL7.016.4956.5154、根据实验所得数据，计算系统的相比，蛋白在不同双水相系统中的分配系数及收率。计算公式如下：表观分配系数 K=Ct/Cb相比 R=Vt/Vb回收率 P=下相蛋白含量/上下相蛋白总含量=Vt*Ct/(Vt*Ct+Vb*Cb)

10、=R*K/(1+R*K)式中 Ct、Cb分别为上下相蛋白浓度；Vt、Vb分别为上下相体积。比较上下相蛋白总含量与加入的蛋白总量是否一致。a、PEG2000 35%，硫酸铵 6%K= 0.0746/1.402 = 0.0532R= 17.0/1.0 = 17 P（下相）= R*K/(1+R*K) = 17*0.0532/(1+17*0.0532) = 0.475b、PEG2000 35%，硫酸铵 7%K= 0.0622/1.299 = 0.0479R= 16.3/1.7 = 9.6 P（下相）= R*K/(1+R*K) = 9.6*0.0479/(1+9.6*0.0479) = 0.315c、P

11、EG2000 35%，硫酸铵 8%K= 0.0581/1.303 = 0.0445R= 15.2/2.8 = 5.4 P（下相）= R*K/(1+R*K) = 5.4*0.0445/(1+5.4*0.0445) = 0.1945、讨论1、 如何正确绘制相图？如何根据相图配制双水相体系，并对混合物进行分离？如何绘制相图：精确称取一定质量PEG溶液于大试管中，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。记录盐溶液的加量(g)。然后，加入1毫升水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。计算每次达到浑浊时，PEG和盐在系统总量中的质量分数，记录实验数据，以PEG的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。如何分离：根据相图，选择三个成相比例，分别加入3mL浓度为10mg/mL牛血清蛋白溶液。搅拌均匀，3500r/min离心5min，静置分层，分别量取记录上下相的体积。2、实验操作中应注意哪些问题？分析实验误差。l 注意事项：滴定管使用前必须要检