考研生物化学笔记

1、生物化学一、生物化学的概念生物化学是研究生命现象化学本质的学科 。生物化学就是生命的化学。 生物化学是研究生物体内的化学分子构成， 分子结构、 性质、功能及其在体内代谢过程的学科。 代谢包括物质和能量两方面。生物化学是研究生物的化学组成和化学变化的，所以生物化学也可以分作两大部分内容：化学组成部分，也称为静态生物化学，主要探讨构成生物体的分子类型、分子结构、化学性质及生物功能；化学 变化部分，讨论的是生物体内的化学分子之间如何进行转化，即研究生物体内的化学反应， 以及这些反应发生的部位和反应机理， 以及伴随这些反应所产生的能量变化。简单讲 生物化学就研究生物体的化学组成和生命中的化学变化。二、

2、生物化学的发展史生物化学的研究始于18 世纪下半叶，但作为一门独立的学科是在 20 世纪初。1629 年荷兰人海尔蒙特进行了柳枝试验， 100 磅土， 2 磅重柳枝，只浇水， 5 年后土和柳枝共重 169 磅，土减少了二两，论文发表于1648 年（死后 2 年）。1775 年拉瓦锡进行定量试验，证明呼吸过程和化学氧化是相同的。并推测呼吸形成的 co2也是由于吸入了氧气，与体内的有机物结合并氧化为co2从而将呼吸氧化与燃烧联系在一起。1783 年拉瓦锡和拉普拉斯在法国科学院院报发表论文， 提出动物热理论呼吸相当于不发光的燃烧。并测定了释放co2和释热的关系。现在一般把这一年称为生化开始年。并把拉

3、瓦锡称为生物化学之父。 但在这同一时期的开拓者还有普利斯特列和舍勒（ scheele ），前者发现了光合现象； 后者在 1770 年发现 了洒石酸， 之后又从膀胱结石中分离出尿酸， 并对苹果酸、柠檬酸，甘油等进行了大量研究。舍勒是瑞典人，学徒工出身，非常热爱化学，最后成为化学家。进入十九世纪，科学发展大大加快，成就不断涌现，例如1828 年维勒（李比西的学生）人工合成了第一个有机物尿素，证明有机物可以人造。1838 年施来登与施旺发表细胞学说。（在 1839 年）细胞是有机体，整个动物和植物乃是细胞的集合体。 它们按照一定的规律排列在动植物体内。 这一学说把植物和动物统一起来。*1842 年李

4、比西（德国人）在有机化学在生理学与病理学上的应用一书中首次提出新陈代谢一词。*1860 年巴斯德又对洒精发酵进行了研究首次提出发酵是由酵母菌或细菌引起的， 此研究为后来的糖代谢和呼吸作用研究奠定了基础。1871年米切尔（miescher霍佩的学生-瑞典人）发表文章分离出核素，即 dna当时年仅24 岁，是首次从 脓细胞中分离出脱氧核糖核蛋白。实际分离在 1868 年完成，论文在1871年发表。1877年德国生理学家一一医生霍佩赛勒，首次提出生物化学一词biochemie ,英文为biochemistry 。并 且首次提出蛋白质一词。1897 年 buchner 用酵母无细胞提取液发酵成功，证明

5、酶的存在。许多人开始提取酶，但都未成功。 二十世纪初，在维生素、激素、酶的研究方面发展较快。1902 年艾贝尔 （abel 美国人） 在德国学习七年， 1903 年制成肾上腺素晶体； 后来又在 1926 年制成胰岛素 晶体。1905年knoop提出了脂肪酸的b-氧化作用。同年 starling 提出激素（hormere） 一词。1907 年霍克（池延登的学生，美国人）发表实验生理化学一书，实际上就是生物化学的前身。这就标志着生物化学已经形成，已经从生理学中独立出来。1911年波兰科学家funk结晶出抗神经炎维生素，并命名为vitamine ,意为生命的胺，实际是复合维生素b。1913 年米利切

6、斯和曼顿研究了酶的动力学提出了米曼方程。同年wilstatter 和 stoll 分离出了叶绿素。1930年northrop分离出胃蛋白酶，并证明是蛋白质。 1933年krebs和henselen发现尿素循环；同年embdem 和 meyerhof 初步完成了糖酵解途径的中间产物研究。 提出了糖酵解途径。1937 年 krebs 提出了三羧酸循环的假说；同年lohmann 和 selitser 证明硫胺素是丙酮酸羧化酶辅基的组成成分； 在此期间 kalcker 及 belitser 各自对氧化磷酸化作用进行了定量研究。1944 年 avery ， maeleod 和 mccarty 完成了肺炎

7、球菌转化试验，证明 dna 是遗传物质。1948 年 calvin 和 bessen 发现磷酸甘油酸是光合作用中 co2 固定的最初产物，并用了十年时间完成了卡尔文循环的整个代谢途径研究。同年leloir 等人发现了尿苷酸在碳水化合物代谢中的作用。1953年watson和criek利用x制线衍射分析了 dna结构，提出了 dna结构的双螺旋结 构模型。这一发现为 生物的遗传研究奠定了分子基础。通常把这一年确定为分子生物学的诞生年。同年（ 1953 年） ， sanger 和 trhompson 完成了胰岛素a 链及 b 链的氨基酸序列测定，二年后报道了胰岛素中二硫键位置。1956 年 a.ko

8、rnberg 发现了 dna 聚合酶。与此同年ubarger 发现了从苏氨酸合成异亮氨酸时终产物异亮氨酸 能抑制合成链中的第一个酶， 即发现了生物合成过程 的反馈作用。1958年s.b.weiss和hurwitz等人发现了 dna指导的rna聚合酶；同在此年crik提出分 子遗传的中心法则； meselson 和 stahl 用同位素标记方法证明了 dna 的半保留复制假说。1961年jacob和monod提出了操纵子学说，并指出了 mrna的功能；同年 weiss和hurwitz 从大肠杆菌中发现了 dna 指导的 rna 聚合酶； 同年 m.nirenberg 和 h.matthei 发现

9、了遗传密码（苯丙氨酸的） 。为三连体核苷酸。1965中国首次人工全合成了牛胰岛素。从七十年代后，生物化学的发展主要集中在分子生物学方面。关于中国的生物化学发展，也做一简略回顾。第一章蛋白质化学（一）.掌握蛋白质的概念与生物学意义蛋白质是由l- a -氨基酸通过肽键缩合而成的，具有较稳定的构象和一定生物功能的 生物大分子（biomacromolecule ）。蛋白质是生命活动所依赖的物质基础，是生物体中含量最丰富的大分子。 生物学意义单细胞的大肠杆菌含有 3000多种蛋白质，而人体有 10万种以上结构和功能各异的蛋 白质，人体干重的 45%是蛋白质。生命是物质运动的高级形式，是通过蛋白质的多种功

10、能 来实现的。新陈代谢的所有的化学反应几乎都是在酶的催化下进行的，已发现的酶绝大多数是蛋白质。生命活动所需要的许多小分子物质和离子，它们的运输由蛋白质来完成。生物的运动、生物体的防御体系离不开蛋白质。蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性，以及高等动物的记忆、识别机构等方面都起着重要的作用。随着蛋白质工程和蛋白质组学的兴起和发展，人们对蛋白质的结构与功能的认识越来越深刻。（二）氨基酸 基本结构与性质各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。因此，可以用定氮法来推算样品中蛋白质的大致含量。每克样品含氮克数x 6.25x 100=100g样品中蛋白质含量（g%） 组成蛋白质的20种氨基酸有共同的结构

11、特点：1 .氨基连接在a - c上，属于a -氨基酸（脯氨酸为a -亚氨基酸）。2 . r是但u链，除甘氨酸外都含手性 c,有d-型和l-型两种立体异构体。天然蛋白质中的氨 基酸都是l-型。注意：构型是指分子中各原子的特定空间排布，其变化要求共价键的断裂和重新形成。 旋光性是异构体的光学活性，是使偏振光平面向左或向右旋转的性质，（-）表示左旋，（+ ）表示右旋。构型与旋光性没有直接对应关系。1 . 一般物理性质a -氨基酸为无色晶体，熔点一般在 200 oc以上。各种氨基酸在水中的溶解度差别很大 （酪氨酸不溶于水）。一般溶解于稀酸或稀碱，但不能溶解于有机溶剂，通常酒精能把氨基 酸从其溶液中沉淀

12、析出。芳香族氨基酸（tyr、trp、phe）有共轲双键，在近紫外区有光吸收能力，tyr、trp的吸收峰在280nm, phe在265 nm。由于大多数蛋白质含 tyr、trp残基，所以测定蛋白质溶 液280nm的光吸收值，是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。2 .两性解离和等电点（isoelectric point, pi ）氨基酸在水溶液或晶体状态时以两性离子的形式存在，既可作为酸（质子供体），又可作为碱（质子受体）起作用，是两性电解质，其解离度与溶液的ph有关。在某一 ph的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势和程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的 ph称为该氨基酸的等电点

13、。氨基酸的 pi是由a -竣基和a -氨基的解 离常数的负对数 pk1和pk2决定的。计算公式为：pi=1/2（pk1+ pk2）。若1个氨基酸有3个可解离基团，写出它们电离式后取兼性离子两边的pk值的平均值，即为此氨基酸的等电点（酸性氨基酸的等电点取两羧基的 pk 值的平均值，碱性氨基酸的等电点取两氨基的 pk 值的平均值） 。3 氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应是其基团的特征性反应。重要的有：（ 1 ）茚三酮反应所有具有自由a-氨基的氨基酸与过量苗三酮共热形成蓝紫色化合物（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质） 。用分光光度法可定量测定微量的氨基酸。蓝紫色化合物的最大吸收峰在570nm

14、 波长处，黄色在440nm 波长下测定。吸收峰值的大小与氨基酸释放的氨量成正比。（ 2）与 2， 4-二硝基氟苯（dnfb ）的反应（ sanger 反应）在弱碱性溶液中，氨基酸的a -氨基很容易与 dnfb作用生成稳定的黄色 2, 4-二硝基 苯氨基酸（dnp-氨基酸），这一反应在蛋白质化学的研究史上起过重要作用，sanger等人应用它测定胰岛素一级结构。（ 3） edman 反应多肽顺序自动分析仪是根据相类似的原理设计的，即利用多肽链n端氨基酸的“-氨基与异硫氰酸苯酯pitc 反应（ edman 降解法） 。氨基酸的分类） 根据 r 基团对 20 种蛋白质氨基酸的分类及其三字符的缩写1 按

15、 r 基的化学结构分为脂肪族、 芳香族、 杂环、 杂环亚氨基酸四类。2 按r 基的极性和在中性溶液的解离状态分为非极性氨基酸、极性不带电荷、极性带负电荷或带正电荷的四类。带有非极性r （煌基、甲硫基、口引味环等，共 9种）：甘（gly）、丙（ala）、然（val）、 亮（ leu ） 、异亮（ ile ） 、苯丙（ phe） 、甲硫（ met ） 、脯（pro） 、色（trp ）带有不可解离的极性r （羟基、疏基、酰胺基等，共 6种）：丝（ser）、苏（thr）、天胺（ asn） 、谷胺（ gln ） 、酪（tyr） 、半（cys）带有可解离的极性r 基（共 5 种） ：天（ asp ） 、谷

16、（ glu ） 、赖（ lys） 、精（ arg ） 、组（ his ） ，前两个为酸性氨基酸，后三个是碱性氨基酸。蛋白质分子中的胱氨酸是两个半胱氨酸脱氢后以二硫键结合而成， 胶原蛋白中的羟脯氨 酸、羟赖氨酸，凝血酶原中的羧基谷氨酸是蛋白质加工修饰而成。（三）蛋白质的结构与功能1 .肽（peptide ）概念：由氨基酸通过肽键相连而成的化合物称为肽。2 .肽的理化性质（与氨基酸相似）蛋白质的分子结构一、 蛋白质的一级结构（ primary structure ） （蛋白质的共价结构有时也称蛋白质的一级结构或称化学结构）蛋白质的一级结构只指肽链中的氨基酸序列。蛋白质的一级结构是由共价键形成的，

17、如肽键和二硫键。 而维持空间构象稳定的是非共 价的次级键。如氢键、盐键、疏水键、范德华引力等。1953年，英国科学家f. sanger首先测定了胰岛素（insulin）的一级结构，有 51个氨基酸残基，由一条a 链和一条 b 链组成，分子中共有3 个二硫键，其中两个在 a 、 b 链之间，另一个在 a 链内。蛋白质的一级结构测定或称序列分析常用的方法是edman 降解和重组 dna 法。 edman降解是经典的化学方法，比较复杂。首先要纯化一定量的待测蛋白质，分别作分子量测定、氨基酸组成分析、 n-末端分析、c-末端分析；要应用不同的化学试剂或特异的蛋白内切酶水解将蛋白质裂解成大小不同的肽段，

18、 测出它们的序列， 对照不同水解制成的两套肽段， 找出重叠片段， 最后推断蛋白质的完整序列。 重组 dna 法是基于分子克隆的分子生物学方法，比较简单而高效，不必先纯化该种蛋白质，而是先要得到编码该种蛋白质的基因（ dna 片段） ，测定dna 中核苷酸的序列，再按三个核苷酸编码一个氨基酸的原则推测蛋白质的完整序列。这两种方法可以相互印证和补充。目前，国际互联网蛋白质数据库已有3 千多种一级结构清楚。 蛋白质一级结构是空间结构和特异生物学功能的基础。二、蛋白质的二级结构（secondary structure）蛋白质的二级结构是指其分子中主链原子的局部空间排列， 是主链构象 （不包括侧链r基团

19、） 。构象是分子中原子的空间排列， 但这些原子的排列取决于它们绕键的旋转， 构象不同于构型， 一个蛋白质的构象在不破坏共价键情况下是可以改变的。 但是蛋白质中任一氨基酸残基的实际构象自由度是非常有限的， 在生理条件下， 每种蛋白质似乎是呈现出称为天然构象的单一稳定形状。20 世纪 30 年代末， l.panling 和 r.b.corey 应用 x 射线衍射分析测定了一些氨基酸和寡肽的晶体结构，获得了一组标准键长和键角，提出了肽单元（ peptide unit ）的概念 , 还提出了两种主链原子的局部空间排列的分子模型（”-螺旋）和（3 -折叠）。1. 肽单位肽键及其两端的a-c共6个原子处于

20、同一平面上，组成了肽单位（所在的平面称肽键平面） 。肽键c-n键长为0.132nm,比相邻的单键（0.147nm）短，而较 c=n双键（0.128nm） 长，有部分双键的性质， 不能自由旋转。 肽键平面上各原子呈顺反异构关系，肽键平面上的o、h以及2个a -碳原子为反式构型（trans configuration ）。主链中的ca c和ca n单键可以旋转，其旋转角（h3决定了两个相邻的肽键平面相对关系。由于肽键平面的相对旋转， 使主链可以以非常多的构象出现。 事实上，肽链在构象上受到很大限制， 因为主链上有1/3 不能自由旋转的肽键， 另外主链上有很多侧链r 的影响。蛋白质的主链骨架由许多肽

21、键平面连接而成。2. a -螺旋（a -helix）a -螺旋是肽键平面通过a-碳原子的相对旋转形成的一种紧密螺旋盘绕，是有周期的一种主链构象。其特点是： 螺旋每转一圈上升 3.6个氨基酸残基，螺距约0.54nm（每个残基上升0.15nm,旋转100o）。相邻的螺圈之间形成链内氢键， 氢键的取向几乎与中心轴平行。 典型a -螺旋一对氢键o与 n 之间共有 13个原子（3.613） ，前后间隔3 个残基。螺旋的走向绝大部分是右手螺旋， 残基侧链伸向外侧。 r 基团的大小、 荷电状态及形状均对a -螺旋的形成及稳定有影响。3. 3 -折叠（3 -pleated sheet）3 -折叠是一种肽链相当

22、伸展的周期性结构。 相邻肽键平面间折叠成110o 角，呈锯齿状。 两个以上具3 -折叠的肽链或同一肽链内不同肽段相互平行排列，形成3-折叠片层，其稳定因素是肽链间的氢键。 逆向平行的片层结构比顺向平行的稳定。a -螺旋和3 -折叠是蛋白质二级结构的主要形式。毛发中的a -角蛋白和蚕丝中的丝心蛋白是其典型，在许多球蛋白中也存在，但所占比例不一样。胶原蛋白中存在的螺旋结构不同于一般的a-螺旋，是由3条具有左手螺旋的链相互缠绕形成右手超螺旋分子。链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持其稳定性。4. 3 -转角（3 -turn）为了紧紧折叠成球蛋白的紧密形状，多肽链180o回折成发夹或3 -转角。其处

23、由4个连续的氨基酸残基构成，常有 gly和pro存在，稳定3 -转角的作用力是第一个氨基酸残基 厥基氧（o）与第四个氨基酸残基的氨基氢（ h）之间形成的氢键。3-转角常见于连接反平行3 -折叠片的端头。5. 无规卷曲（random coil ）多肽链的主链呈现无确定规律的卷曲。典型球蛋白大约一半多肽链是这样的构象。6超二级结构和结构域超二级结构和结构域是蛋白质二级至三级结构层次的一种过渡态构象。超二级结构指蛋白质中两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近， 形成一特殊的组合体，又称为模体（motif）。通常有a a , 3 3, 3 " 3等，例如钙结合蛋白质中的螺 旋-环-螺旋

24、模序及锌指结构。结构域是球状蛋白质的折叠单位， 是在超二级结构基础上进一步绕曲折叠有独特构象和部分生物学功能的结构。 对于较小的蛋白质分子或亚基， 结构域和三级结构是一个意思， 即这些蛋白质是单结构域的； 对于较大的蛋白质分子或亚基， 多肽链往往由两个或两个以上的相对独立的结构域缔合成三级结构。三、蛋白质的三级结构（tertiary structure ）指一条多肽链中所有原子的整体排布， 包括主链和侧链。 维系三级结构的作用力主要是次级键 （疏水相互作用、 静电力、氢键等） 。在序列中相隔较远的氨基酸疏水侧链相互靠近，形成“洞穴”或“口袋”状结构，结合蛋白质的辅基往往镶嵌其内，形成功能活性部

25、位，而亲水基团则在外，这也是球状蛋白质易溶于水的原因。 1963 年 kendrew 等从鲸肌红蛋白的x 射线衍射图谱测定它的三级结构（ 153 个氨基酸残基和一个血红素辅基，相对分子质量为17800）。由a-h 8段a -螺旋盘绕折叠成球状，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部形成一个袋形空穴，血红素居于其中，富有极性及电荷的则在分子表面形成亲水的球状蛋白。四、蛋白质的四级结构（quaternary structure）有些蛋白质的分子量很大， 由 2 条或 2 条以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键相互结合而成，称为蛋白质的四级结构。构成四级结构的每条多肽链称为亚基（subunit）

26、，亚基单独存在时一般没有生物学功能， 构成四级结构的几个亚基可以相同或不同。 如血红蛋白（hemoglobin,hb）是由两个a -亚基和两个3 -亚基形成的四聚体（a 2 3 2）。蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系（一）一级结构是空间构象的基础（二）种属差异（三）分子病二、蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质的空间结构是其生物活性的基础， 空间结构变化， 其功能也随之改变。 肌红蛋白（ mb ）和血红蛋白（ hb ）是典型的例子。肌红蛋白（ mb ）和血红蛋白（ hb ） 都能与氧进行可逆的结合， 氧结合在血红素辅基上。然而 hb 是四聚体分子，可以转运氧； mb 是单体，可

27、以储存氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散。它们的氧合曲线不同， mb 为一条双曲线， hb 是一条 s 型曲线。在低p（o2）下，肌红蛋白比血红蛋白对氧亲和性高很多，p（o2）为2.8torr（1torr 133.3pa）时，肌红蛋白处于半饱和状态。在高 p（o2） 下，如在肺部（大约 100torr ）时，两者几乎都被饱和。其差异形成一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统。hb 未与氧结合时，其亚基处于一种空间结构紧密的构象（紧张态， t 型） ，与氧的亲和力小。 只要有一个亚基与氧结合， 就能使 4 个亚基间的盐键断裂， 变成松弛的构象 （松弛态，r 型） 。 t 型和 r 型的相互转

28、换对调节hb 运氧的功能有重要作用。一个亚基与其配体结合后能促进另一亚基与配体的结合是正协同效应， 其理论解释是hb 是别构蛋白， 有别构效应。蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质和氨基酸相似， 有两性解离及等电点、 紫外吸收和呈色反应。 作为生物大分子， 还有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。 要了解和分析蛋白质结构和功能的关系就要利用其特殊的理化性质，采取盐析、透析、电泳、 层析及离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法分离纯化蛋白质。蛋白质的相对分子质量蛋白质的相对分子质量在 1 万 100 万，其颗粒平均直径约为 4.3 nm （胶粒范围是1100nm ） 。准确可靠的测定方法是超速离心法，蛋

29、白质的相对分子质量可用沉降系数（s）表示。 二、蛋白质的两性解离及等电点蛋白质和氨基酸一样是两性电解质，在溶液中的荷电状态受 ph 值影响。当蛋白质溶液处于某一 ph 时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的ph称为该蛋白质的 等电点。ph>pi时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。在人体体液中多数蛋白质的等电点接近ph5 ， 所以在生理ph7.4 环境下， 多数蛋白质解离成阴离子。少量蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白的 pi 偏于碱性，称碱性蛋白质，而胃蛋白酶和丝蛋白为酸性蛋白。蛋白质的紫外吸收蛋白质含芳香族氨基酸，在 280nm 波长处有特征性吸收峰

30、，用于定量测定。 （主要是酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸中的 r 基团有苯环共轭双键系统）蛋白质的变性及复性蛋白质在某些理化因素的作用下， 空间结构被破坏， 导致理化性质改变， 生物学活性丧失，称为蛋白质的变性（ denaturation ） 。蛋白质变性的本质是多肽链从卷曲到伸展的过程， 不涉及一级结构的改变 （如加热破坏氢键，酸碱破坏盐键等） 。变性作用不过于剧烈，是一种可逆反应，去除变性因素，有些蛋白质原有的构象和功能可恢复或部分恢复，称为复性（ denaturation ） 。蛋白质变性的主要表现是失去生物学活性， 如酶失去催化能力、 血红蛋白失去运输氧的功能、 胰岛素失去调节血糖的生理功能

31、等。变性蛋白溶解度降低， 易形成沉淀析出；易被蛋白水解酶消化。蛋白质变性具有重要的实际意义。 蛋白质的分离、纯化第二章核酸的化学dna的分子结构一、 dna 的一级结构（primary stucture）dna的一级结构是指分子中脱氧核甘酸的排列顺序，常被简单认为是碱基序列（basesequence碱基序有严格的方向性和多样性。一般将5,-磷酸端作为多核甘酸链的“头”， 写在左侧，如 pacuga （ 5/一 3，）。在dna 一级结构中，有一种回文结构的特殊序列，所谓回文结构即dna互补链上一段反向重复顺序，正读和反读意义相同，经反折可形成“十字形”结构，在转录成rna后可形成“发夹”样结构

32、，有调控意义。.gcta gttca ctc tgaac aatt -cgat caagt gag acttg ttaa -dna分子很大，最小的病毒 dna约含5000b。1965年holley用片段重叠法完成酵母 trnaala 76nt序列测定；1977年sanger利用双脱氧法（酶法）测定了 e x174单链dna5386b 的全序列。1990年实施的人类基因组计划（hgp）,用15年，投资30亿美元，完成人类单 倍体基因组dna3 x109bp全序列的测定。该计划由美、英、日、法、德、中六国科学家合 作，于2003年提前完成，生命科学进入后基因组时代，研究重点从测序转向对基因组功能

33、的研究。二、dna的二级结构双螺旋 （double helix）1953年，watson和 crick 根据 wilkins 和 franklin 拍摄的 dna x-射线照片（dna 有0.34nm和3.4nm两个周期性变化）以及 chargaff等人对dna的碱基组成的分析（a=t , g=c, a+g=c+t ）,推测出dna是由两条相互缠绕的链形成。watson-crick双螺旋结构模型如下图：1 .两条反向平行的多核甘酸链形成右手螺旋。一条链为5/一 3、另一条为3/一 5%（某些病毒的 dna是单链分子ssdna）2 .碱基在双螺旋内侧，a与t, g与c配对，a与t形成两个氢键，g

34、与c形成三个氢键。糖基-磷酸基骨架在外侧。表面有一条大沟和一小沟。3 .螺距为3.4 nm,含10个碱基对（bp）,相邻碱基对平面间的距离为0.34 nm。螺旋直径为2 nm。氢键维持双螺旋的横向稳定。碱基对平面几乎垂直螺旋轴，碱基对平面间的疏水堆积力 维持螺旋的纵向稳定。4 .碱基在一条链上的排列顺序不受限制。遗传信息由碱基序所携带。5 . dna构象有多态性。watson和crick根据 wilkins和franklin拍摄的dna x-射线照片是相对湿度 92%的 dna钠盐所得的衍射图， 因此watson-crick双螺旋z勾称 b-dna。细胞内的dna与它非 常相似。另外还有 a-

35、dna、c-dna、d-dna 。1979年rich发现z-dna （左手螺旋、螺距4.5nm、直径1.8nm）三、 dna 的三级结构dna 双螺旋进一步盘曲所形成的空间构象称dna 的三级结构。某些病毒、细菌、真核生物线粒体和叶绿体的 dna 是环形双螺旋，再次螺旋化形成超螺旋；在真核生物细胞核内的 dna 是很长的线形双螺旋，通过组装形成非常致密的超级结 构。1环形 dna 可形成超螺旋当将线性过旋或欠旋的双螺旋 dna 连接形成一个环时，都会自动形成额外的超螺旋来抵消过旋或欠旋造成的应力， 目的是维持 b 构象。 过旋 dna 会自动形成额外的左手螺旋 （正 超螺旋） ，而欠旋形成额外

36、的右手螺旋（负超螺旋） 。一段双螺旋圈数为 10 的 b-dna 连接成环形时，不发生进一步扭曲，称松弛环形dna（双螺旋的圈数=链绕数，即 t=l ，超螺旋数w=0 ； l=t+w ） ，但将这一线形dna 的螺旋先拧松一圈再连接成环时，解链环形dna 存在的扭曲张力，可导致双链环向右手方向扭曲形成负超螺旋（t = 10, l=9, w = -1）o在生物体内，绝大多数超螺旋 dna 以负超螺旋的形式存在，也就是说，一旦超螺旋解开，则会形成解链环形dna ，有利于 dna 复制或转录。螺旋具有相同的结构，但 l 值不同的分子称为拓扑异构体。 dna 拓扑异构酶切断一条链或两条链，拓扑异构体可

37、以相互转变。 w 的正表示双链闭环的螺旋圈在增加， w 的负表 示减少。 l 和 t 的正负表示螺旋方向，右手为正，左手螺旋为负； l 值必定是整数。2真核细胞染色体真核细胞 dna 是线形分子，与组蛋白结合，其两端固定也形成超螺旋结构。 dna 被 紧密地包装成染色体来自三个水平的折叠： 核小体、 30nm 纤丝和放射环。核小体是染色体的基本结构单位，是dna 包装的第一步，它由 dna 结合到组蛋白上形成复合物，在电镜下显示为成串的 “念珠” 状。组蛋白是富含精氨酸和赖氨酸的碱性蛋白质，其氨基酸序列在进化中是高度保守的。组蛋白有5 种， h2a、 h2b、 h3 和 h4 各两分子组成的八

38、聚体是核小体核心颗粒， dna 缠绕其上，相邻核小体间的 dna 称为连接 dna 且 结合h1。200 bpdna的长度约为68nm,被压缩在10nm的核小体中。压缩比约为7 30nm纤丝是第二级压缩，每圈含 6 个核小体，压缩比是6 。 30nm 螺旋管再缠绕成超螺旋圆筒，压缩比是 40。 再进一步形成染色单体， 总压缩近一万倍。 典型人体细胞的 dna 理论长度应 是180 cm,被包装在 46个5dm的染色体中。rna 的分子结构rna 通常以单链形式存在， 比 dna 分子小得多， 由数十个至数千个核苷酸组成。 rna 链可以回折且通过a 与 u ， g 与 c 配对形成局部的双螺旋

39、，不能配对的碱基则形成环状突起，这种短的双螺旋区和环称为发夹结构一、转运 rna （transfer rna ， trna ）1分子量最小的 rna ，约占总 rna 的 15%。主要功能是在蛋白质生物合成过程中， 起着转运氨基酸的作用。2 1965 年 holley 等测定了酵母丙氨酸trna 的一级结构，并提出二级结构模型。一级结构特点：核苷酸残基数在7395 ；含有较多的稀有碱基（如mg、 dhu 等） ； 5 -末端多为 pg， 3 - 末端都是 -cca 。3 trna 的二级结构为“三叶草”形，包括4个螺旋区、 3 个环及一个附加叉。各部分的结构都和它的功能有关。5端17位与近3端

40、6772 位形成的双螺旋区称氨基酸臂，似“叶柄” ， 3端有共同的 -cca-oh 结构，用于连接该rna 转运的氨基酸。 3 个环是二氢 尿喀咤环（d环）、反密码子环、twc环。4 19731975年s.h.kim的x射线衍射分析表明，trna的三级结构呈倒 l字母形， 反密码环和氨基酸臂分别位于倒l的两端。二、信使 rna （ messenger rna , m rna ）1 .细胞内含量较少的一类rna,约占总rna的3%。其功能是将核内 dna的碱基顺序（遗传信息）按碱基互补原则转录至核糖体，指导蛋白质的合成。2 .种类多，作为不同蛋白质合成的模板，其一级结构差异很大。真核细胞的mrn

41、a有不同于原核细胞的特点：3/ -末端有多聚 a （polya）尾，5/ -末端加有一个“帽”式结构，（m7 gppp）。3 .代谢活跃，寿命较短。三、核糖体 rna （ribosomal rna , rrna）1 .约占细胞总 rna的80%。主要功能是与多种蛋白质组成核糖体，是蛋白质合成的 场所。2 .核糖体在结构上可分离为大小两个亚基。 原核细胞的rrna有3种，23s与5s rrna 在大亚基，16s在小亚基。真核细胞有 4种rrna ,其中大亚基含 28s、5.8s、5s,小亚基 只有18s。3 .各种rrna的一级结构中的核甘酸残基数及其顺序都不相同，且有特定的二级结构。核酸的性质

42、一、一般理化性质1 . dna为白色纤维状固体， rna为白色粉末；都微溶于水，不溶于一般有机溶剂。 常用乙醇从溶液中沉淀核酸。2 .具有大分子的一般特性。分子大小可用 da、b或bp、s、链长（科m）表示。一个 bp相当的核甘酸平均分子量为660da； 1科m长的dna双螺旋相当3000bp或2x 106da。3 .两性电解质。各种核酸的大小及所带的电荷不同，可用电泳和离子交换法分离。 rna在室温下易被稀碱水解，dna较稳定，此特性用来测定 rna的碱基组成和纯化 dna。4 .紫外吸收，最大吸收峰在260nm处，核酸的变性或降解，吸光度a升高，称为增色效应。核酸的分离纯化第三章酶酶的概念

43、和作用一、酶的概念酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂（ biocatalyst）。已发 现的有两类：主要的一类是蛋白质酶（enzyme）,生物体内已发现4000多种，数百种酶得到结晶。美国科学家 cech于1981年在研究原生动物四膜虫的rna前体加工成熟时发现核酶“ribozyme”，为数不多，主要做用于核酸（1989年的诺贝尔化学奖）。二、酶的作用特点酶所催化的反应称为酶促反应。在酶促反应中被催化的物质称为底物，反应的生成物称为产物。酶所具有的催化能力称为酶活性。酶作为生物催化剂， 具有一般催化剂的共性， 如在反应前后酶的质和量不变； 只催化热力学允许的化学反应，即

44、自由能由高向低转变的化学反应；不改变反应的平衡点。 但是，酶 是生物大分子，又具有与一般催化剂不同的特点。1极高的催化效率酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。例如,月尿酶催化尿素的水解速度是 h+催化作用的7x1012倍；碳酸酊酶每一酶分子每秒催化6x105 co2 与水结合成h2co3 ，比非酶促反应快107倍。2高度的特异性酶对催化的底物有高度的选择性， 即一种酶只作用一种或一类化合物， 催化一定的化学反应， 并生成一定的产物， 这种特性称为酶的特异性或专一性。 有结构专一性和立体异构专 一性两种类型。结构专一性又分绝对专一性和相对专一性。前者只

45、催化一种底物，进行一种化学反应。如脲酶仅催化尿素水解。 后者可作用一类化合物或一种化学键。 如酯酶可水解各种有机酸和醇形成的酯。 在动物消化道中几种蛋白酶专一性不同， 胰蛋白酶只水解arg 或 lys 羧基形成的肽键； 胰凝乳蛋白酶水解芳香氨基酸及其它疏水氨基酸羧基形成的肽键。立体异构专一性指酶对底物立体构型的要求。例如乳酸脱氢酶催化l-乳酸脱氢为丙酮酸，对d-乳酸无作用；l-氨基酸氧化酶只作用l-氨基酸，对d-氨基酸无作用。3酶活性的可调节性酶促反应受多种因素的调控， 通过改变酶的合成和降解速度可调节酶的含量； 酶在胞液和亚细胞的隔离分布构成酶的区域化调节； 代谢物浓度或产物浓度的变化可以抑

46、制或激活酶的活性； 激素和神经系统的信息， 可通过对关键酶的变构调节和共价修饰来影响整个酶促反应速度。 所以酶是催化剂又是代谢调节元件， 酶水平的调节是代谢调控的基本方式。4酶的不稳定性酶主要是蛋白质，凡能使蛋白质变性的理化因素均可影响酶活性，甚至使酶完全失活。酶催化作用一般需要比较温和的条件(37、1atm 、 ph7 ) 。三、酶的国际分类与命名(一)酶的分类根据国际酶学委员会( international enzyme commission ， iec )的规定，按照酶促反应 的性质，分为六大类：1 .氧化还原酶(oxidoreductases)催化底物进行氧化还原反应。如乳酸脱氢酶、琥

47、珀酸 脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。2 .转移酶(transferases)催化底物之间某些基团的转移或交换。如甲基转移酶、氨基 转移酶、磷酸化酶等。3 .水解酶(hydrolases)催化底物发生水解反应。如淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶 等。4 .裂解酶(lyases)催化底物裂解或移去基团(形成双键的反应或其逆反应)。如碳酸酐酶、醛缩酶、柠檬酸合成酶等。5异构酶(isomerases) 催化各种同分异构体之间相互转化。如磷酸丙糖异构酶、消旋atp 的分解释能。酶等。6合成酶(ligases) 催化两分子底物合成一分子化合物，同时偶联有如谷氨酰胺合成酶、氨基酸-rna

48、连接酶等。（二）酶的命名1961年，国际酶学委员会（iec）主要根据酶催化反应的类型，把酶分为6大类，制定了系统命名法。 规定每一酶只有一个系统名称， 它标明酶的所有底物与催化反应性质， 底物名称 之间以“： ”分隔，同时还有一个由 4 个数字组成的系统编号。如谷丙转氨酶的系统名称是 丙氨酸：a -酮戊二酸氨基转移酶（酶表中的统一编号是ec2.6.1.2）。乳酸脱氢酶的编号是ec1.1.1.27。 酶的作用机制1 酶的活性中心酶的活性部位酶的活性部位（ active site ）是它结合底物和将底物转化为产物的区域，又称活性中心。它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维小区（为裂

49、缝或为凹陷）。酶活性部位的基团属必需基团，有二种：一是结合基团，其作用是与底物结合，生成酶-底物复合物； 二是催化基团， 其作用是影响底物分子中某些化学键的稳定性， 催化底物发生化学 反应并促进底物转变成产物， 也有的必需基团同时有这两种功能。 还有一些化学基团位于酶 的活性中心以外的部位， 为维持酶活性中心的构象所必需， 称为酶活性中心以外的必需基团。构成酶活性中心的常见基团有组氨酸的咪唑基、 丝氨酸的羟基、 半胱氨酸的巯基等。 如丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶， 都催化蛋白质的肽键使之水解，但底物的专一性由它们的底物-结合部位中氨基酸基团的性质所决定，与其作用的底物

50、互补。像胰蛋白酶， 在它的底物 -结合部位有带负电荷的 asp 残基， 可与底物侧链上带正电荷的 lys和 arg 相互作用，切断其羧基侧；胰凝乳蛋白酶在它的底物 -结合部位有带小侧链的氨基酸残基，如gly和ser,使底物庞大的芳香的和疏水氨基酸残基得以进入，切断其竣基但u;弹性蛋白酶有相对大的val和thr不带电荷的氨基酸但u链，凸出在它的底物 -结合部位，阻止了除ala和gly小但u链以外的所有其他氨基酸。2 酶的专一性和高效性机制影响酶促反应速度的主要因素底物浓度、酶浓度、温度、 ph 、激活剂、抑制剂二、酶浓度对反应速度的影响当研究某一因素对酶促反应速度的影响时， 体系中的其他因素保持

51、不变， 而只变动所要 研究的因素。当底物浓度远大于酶浓度时，酶促反应速度与酶浓度的变化成正比。三、底物浓度对酶反应速度的影响（一）米-曼氏方程式1913年，michaelis和menten根据中间产物学说进行数学推导，得出 v与s的数学方 程式，即米-曼氏方程式。 1925 年 briggs 和 haldane 提出稳态理论，对米氏方程做了一项重要的修正。底物浓度对酶促反应速度的影响呈双曲线。 当底物浓度较低时， v 与 s 呈正比关系 （一级反应） ；随着 s 的增高， v 的增加逐步减慢（混合级反应） ；增到一定程度， v 不再增加 而是趋于稳定（零级反应） 。当svv km 时，v =

52、vmax s /km,反应速度与底物浓度成正比；当 s>> km时，vvmax,反应速度达到最大速度，再增加 s也不影响v。（二） km 的意义1当 v/v =2 时, km =s , km 是反应速率v 等于最大速率v 一半时的底物浓度，单位为摩尔/升（ mol/l ） 。2 km =k2+k3/k1 ，当k2>> k3时，km值可用来表示酶对底物的亲和力。km值越小，酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。3 km 是酶的特征性常数，它只与酶的结构和酶所催化的底物有关，与酶浓度无关。km 和 vmax 可用图解法根据实验数据测出。通过测定在不同底物浓度下的vo ，再用1

53、/vo 对 1/s 的双倒数作图，又称lineweaver-burk 作图法，即取米氏方程式倒数形式。四、 ph 对反应速度的影响每一种酶只能在一定限度的 ph 范围内才表现活力，酶表现最大活力时的 ph 称为酶的最适 ph 。最适 ph 的微小偏离可使酶活性部位的基团离子化发生变化而降低酶的活性，较大偏离时， 维护酶三维结构的许多非共价键受到干扰， 导致酶蛋白的变性。酶的最适 ph 不是固定的常数，受酶的纯度、底物的种类和浓度、缓冲液的种类和浓度等的影响。 一般酶的最适 ph 在 48 之间， 植物和微生物体内的酶最适ph 多在 4.56.5,而动物体内的最适ph 多在 6.58，多在 6.

54、8 左右。但也有例外，如胃蛋白酶最适ph 为 1.9，胰蛋白酶的最适ph 为 8.1, 肝精氨酸酶的最适 ph 为 9.0。 vo 对 ph 的关系图形是钟形曲线。五、温度对反应速度的影响温度对 vo 关系的图形是一条曲线，它可清楚地表示出最适温度。多数哺乳动物的酶最适温度在37左右，植物体内酶的最适温度在 5060。 也有些微生物的酶适应在高温或低温下工作。 温度从两方面影响酶促反应速率， 是升高温度提高反应速率和酶遇热易变性失活两个相反效应间的平衡。六、激活剂对反应速度的影响凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂 （ activator ） 。 必需 激活剂常是金属离

55、子，如 mg2+ 、 k+ 、 mn2+ 等 , mg2+ 是多种激酶和合成酶的必需激活剂；非必需激活剂是有机化合物和cl-等，如胆汁酸盐是胰脂肪酶，cl-是唾液淀粉酶的非必需激活剂。七、抑制剂对反应速度的影响使酶活性下降而不导致酶变性的物质称为酶的抑制剂。 抑制剂作用有可逆和不可逆抑制两类。以可逆抑制最为重要。（一） 不可逆抑制作用这类抑制剂通常以共价键与酶活性中心上的必需基团相结合， 使酶失活， 一般不能用透析、 超滤等物理方法去除。 这类抑制作用可用某些药物解毒， 使酶恢复活性。 如农药敌百虫、敌敌畏、 1059 等有机磷化合物能特异地与胆碱酯酶活性中心的丝氨酸羟基结合，使酶失活，导致乙

56、酰胆碱不能水解而积存。迷走神经兴奋呈现中毒状态。解磷定（ pam ）可解除有机磷化合物对羟基酶的抑制作用，显然这类解毒药物和有机磷农药结合的强度大于和酶结合。重金属盐引起的巯基酶中毒，可用络合剂或加入其他过量的巯基化合物，如二巯基丙醇（ bal ）来解毒。（二）可逆抑制作用这类抑制剂通常以非共价键与酶可逆性结合，使酶活性降低或失活， 采用透析、超滤的方法可去除抑制剂，恢复酶活性。可逆抑制有竞争、非竞争、反竞争3种类型，以竞争性抑制研究的最多。三种作用的共同点是因 km和vmax值的变化导致酶促反应初速度下降。竞争性抑制剂的结构与底物类似，且在酶的同一部位 （活性中心）和酶结合，仅在加大底物浓度时才逐渐抵消，显然 km值要增加，vmax不变。非竞争性抑制剂不直接影响酶与底物的 结合，酶同时和二者结合