第八章发酵过程控制PPT课件

1、 本章内容一、概述二、代谢调控在发酵过程控制中的应用1. 初级代谢物的生产调节 2. 次级代谢物的生产调节三、温度对发酵的影响及其控制四、pH对发酵的影响及其控制五、溶解氧对发酵的影响及其控制六、CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制七、基质浓度对发酵的影响及补料控制八、高密度发酵及过程控制九、泡沫对发酵的影响及其控制十、自动控制技术在发酵过程控制中的应用第1页/共138页1. 过程控制的重要性 菌株特性(营养要求、生长速率、 呼吸强度、产物合成速率) 传递性能 物理：n、T、Ws 化学：pH、DO、浓度 过程控制的意义：最佳工艺条件的优选（即最佳工艺参数 的确定）以及在发酵过程中通过过程调节达到

2、最适水平的 控制。决定发酵单位(水平)的因素外部环境因素工艺条件生物因素：生物因素：设备性能：设备性能：第2页/共138页2. 发酵过程控制的一般步骤 确定能反映过程变化的各种理化参数及其检测方法 研究这些参数的变化对发酵生产水平的影响及其机制，获取最适水平或最佳范围 建立数学模型定量描述各参数之间随时间变化的关系 通过计算机实施在线自动检测和控制，验证各种控制模型的可行性及其适用范围，实现发酵过程最优控制 第3页/共138页3. 参数检测 代谢参数按性质可分为三类：物理参数：温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、 pH

3、、产物浓度、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌体浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、摄氧率、关键酶活力等第4页/共138页3. 参数检测 参数按获取方式可分为两类： 如T、pH、罐压、空气流量、搅拌转速、溶氧浓度等 如摄氧率()、呼吸强度(QO2)、比生长速率（) 、体积溶氧系数(KLa)、呼吸商(RQ)等。直接参数直接参数： 间接参数间接参数：将直接参数通过公式计算获得的：将直接参数通过公式计算获得的参数，参数，第5页/共138页3. 参数检测 参数的测量形式离线测量：基质（糖、脂类、无机盐等）、前体和代谢产物（抗生素、酶、有机酸、氨基酸等）在线测量：如T 、pH、DO、溶解CO2、尾气CO2、黏度

4、、搅拌转速等 优点：及时、省力，可从繁琐操作中解脱出来，便于计算机控制。 困难：传感器要求较高。 第6页/共138页v对传感器的要求 能经受高压蒸汽灭菌； 传感器及其二次仪表具有长期稳定性； 最好能在过程中随时校正，灵敏度好； 探头材料不易老化，使用寿命长； 安装使用和维修方便； 解决探头敏感部位被物料（反应液）粘住、堵塞 问题； 价格合理，便于推广。 3. 参数检测第7页/共138页3. 参数检测v参数检测方法温度测量 感温元件：热电偶（温度信号 电信号） 二次仪表：将热电偶输出的电信号转换成 被测介质的温度第8页/共138页v参数检测方法 搅拌转速和搅拌功率的测量搅拌转速：磁感应式，光感应

5、式， 测速电机；搅拌功率：功率表，测定力矩求功率法。3. 参数检测第9页/共138页3. 参数检测v参数检测方法 空气流量测定体积流量型： 会引起流体能量损失，受温度和压力变化的影响； 同心孔板压差式流量计； 转子流量计。质量流量型： 根据流体固有性质（质量、导电性、热传导性能）设计的流量计。第10页/共138页v参数检测方法 罐压测量 压力表 压力传感器 3. 参数检测第11页/共138页v参数检测方法 料液计量与液位控制 压差法：H=（P2/P1）H 直接重量测量法：直接称重 体积计量法：计算进出料液 流量计量法：计算流量和时间 液位探针3. 参数检测第12页/共138页v参数检测方法 发

6、酵液粘度测定 毛细管粘度计 回转式粘度计 涡轮旋转粘度计3. 参数检测第13页/共138页v参数检测方法 pH测量 复合pH电极 pH测量仪器3. 参数检测第14页/共138页v参数检测方法 溶解氧的测量 化学法 极谱法 复膜氧电极法 3. 参数检测复膜氧电极示意图（a）极谱型 （b）原电池型第15页/共138页v参数检测方法 溶解二氧化碳测量 复膜式电极法 渗透膜碳酸氢钠法 发酵尾气的在线分析 CO2分析 O2分析3. 参数检测第16页/共138页v参数检测方法 细胞浓度的测量 化学法：如DNA、RNA分析等 物理法：如重量分析、分光光度分析、 浊度分析等新技术：以电容法为测量原理的在线 活

7、细胞浓度测量传感器 3. 参数检测原位活细胞在线检测仪原位活细胞在线检测仪第17页/共138页1. 初级代谢物的生产调节初级代谢物：指一类低分子量的终点产物及这些终点产物的生物合成途径中的中间体。 (1) 避开固有的反馈调节(2) 细胞通透性的变更第18页/共138页 反馈调节包括 反馈抑制：某一生物合成途径的最终代谢物抑制该途径的第一或第二个酶的活性。 反馈阻遏：抑制酶的形成，是由途径终点产物或其衍生物施行的。（1）避开固有的反馈调节第19页/共138页黄色短杆菌赖氨酸生物合成调节机制黄色短杆菌赖氨酸生物合成调节机制1-天冬氨酸激酶；天冬氨酸激酶；2-DDP合成酶；合成酶；3-高丝氨酸脱氢酶

8、；高丝氨酸脱氢酶；4-琥珀酰高丝氨酸合成酶；琥珀酰高丝氨酸合成酶；5-苏氨酸脱氢酶苏氨酸脱氢酶第20页/共138页（1 1）避开固有的反馈调节 方法限制菌在胞内积累终点产物的能力以解除负反馈调节作用 从遗传上改变酶的活性和酶的形成系统，筛选有抗反馈作用的基因突变型（对反馈作用不敏感）。 具体应用积累中间产物积累终点产物耐反馈作用的突变株的筛选：抗结构类似物突变株 第21页/共138页第22页/共138页第23页/共138页第24页/共138页抗结构类似物突变株的筛选机制 末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反馈作用，但是它们不能参与生物合成。在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细

9、胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变株仍能制造末端产物并长成菌落。 突变株耐结构类似物的原因： 酶的结构起了变化（指耐反馈抑制的突变株） 酶的合成系统起了变化（指耐反馈阻遏的突变株）第25页/共138页（1 1）避开固有的反馈调节 双突变株的概念：单一菌株内同时发生耐反馈抑制和耐反馈阻遏的突变作用。 思考题： 某一菌株对所要生产的产物的类似物有天然的耐受力，这种时候能否利用类似物筛选突变株呢？ 回复筛选：用突变除去反馈敏感的酶和用第二次突变置换它，常产生分泌终点产物的回复子。 第26页/共138页细胞通透性的变更 细菌细胞膜通透性

10、的增加是谷氨酸过量生产的原因之一。 能过量生产谷氨酸的细菌有两个共同特征： -酮戊二酸脱氢酶缺失：表明这类细菌的TCA上的酶受阻，保证了碳引向谷氨酸的合成歧路。 对生物素的营养需求：表明这类细菌的生物素的生物合成受阻，导致细胞膜通透性的改变，使细胞可以分泌出谷氨酸。 第27页/共138页2. 次级代谢物的生产调节(1) 次级代谢的特点及与初级代谢的关系(2) 调节方法 诱导作用 避开固有的负反馈 操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成 耐负反馈调节的抗性突变株的筛选 初级代谢物的调节作用 能荷调节 e.g.磷酸盐影响金霉素的合成第28页/共138页（1）次级代谢的特点及与初级代谢的关系 次级代

11、谢酶的特异性较初级代谢酶的特异性低，故受遗传及环境因素的影响大。 次级代谢物的合成途径比初级代谢的种类多，但大多数次级代谢物都是由少数关键中间代谢物组装的。 次级代谢产物的合成一般是在生长期后，即培养基中的养分快耗尽，菌的比生长速率降低时才合成。 第29页/共138页操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成 改变培养基成分来避免分解阻遏作用 改变培养基成分来避免反馈抑制和阻遏作用 e.g.链霉素发酵中限制磷酸盐的加量，避免其对参与生物合成的磷酸酯酶的反馈抑制和阻遏作用 培养基中添加前体物来避免分支途径终产物对发酵产品的间接抑制作用第30页/共138页n 分解阻遏作用的解除主要是在多个碳源中选择慢

12、碳分解阻遏作用的解除主要是在多个碳源中选择慢碳源或者采用缓慢流加快碳源的工艺源或者采用缓慢流加快碳源的工艺 在含有葡萄糖和乳糖的培养基中的青霉素发酵代谢曲线在含有葡萄糖和乳糖的培养基中的青霉素发酵代谢曲线第31页/共138页耐负反馈调节的抗性突变株的筛选 筛选耐结构类似物的突变株 e.g. 不需添加色氨酸的硝吡咯菌素的高产菌株 回复筛选 e.g. 高产金霉素产生菌 筛选耐药性菌株 e.g. 利用抗生素筛选耐药性菌株 第32页/共138页第33页/共138页(三)温度对发酵的影响及其控制1. 影响发酵温度的因素2. 温度对微生物生长的影响3. 温度对基质消耗的影响4. 温度对产物合成的影响5.

13、最适温度的选择与控制 第34页/共138页(1)发酵热 发酵过程中所产生的热量，叫做发酵热。 Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射 第35页/共138页(2)生物热 来源 ：微生物对营养物质的分解所释放的能量 影响因素： 菌株 培养基成分 发酵时期 生物热与其它参数的关系 呼吸强度QO2 糖利用速率当产生的生物热达到高峰时，菌的呼当产生的生物热达到高峰时，菌的呼吸强度最大，糖的利用速率也最大，吸强度最大，糖的利用速率也最大，可用耗氧量、糖耗来衡量生物热。可用耗氧量、糖耗来衡量生物热。第36页/共138页2. 温度对微生物生长的影响 当时，可忽略，微生物处于生长状态。、皆与T有关，其关系均可用

14、阿累尼乌斯公式描述： EE 死亡速率比生长速率对温度变化更为敏感 xxdtdxdtdxx1RTE1eARTE2eA第37页/共138页嗜冷、嗜中温、嗜热菌的典型生长与温度关系嗜冷、嗜中温、嗜热菌的典型生长与温度关系第38页/共138页2. 温度对微生物生长的影响(续) 在其最适温度范围内，生长速率随温度升高而增加，当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降。 不同生长阶段的微生物对温度的反应不同 处于延迟期的细菌对温度的影响十分敏感。 对于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，则升温的破坏作用较弱。 处于生长后期的细菌，其生长速度一般主要取决于溶解

15、氧，而不是温度。 第39页/共138页(1) 糖比消耗速率qs Righelato假定：m维持因子，即生长速率为零时的葡萄糖的消耗。m项与渗透压调节、代谢产物的生成、迁移性及除繁殖以外的其它生物转化等过程所需的能量有关。这些过程受温度的影响，所以m也和温度相关。B生长系数，即同一生长速率下的糖耗，B值越大，说明同样比生长速率下，用于纯粹生长的糖耗越大。 改变温度可以控制qs和 Bmqs第40页/共138页（2）T对B、m和的影响 qs一定： 当TTm时， m ， , B 底物转化效率低当T=Tm时，mT(K)m温度对温度对B、m和不同和不同qs下对下对值的影响值的影响第41页/共138页4.

16、温度对产物合成的影响 影响发酵过程中各种反应速率，从而影响微生物的生长代谢与产物生成。 e.g. 青霉菌发酵生产青霉素青霉菌发酵生产青霉素 青霉菌生长活化能青霉菌生长活化能E1=34kJ/mol 青霉素合成活化能青霉素合成活化能E2=112kJ/mol 青霉素合成速率对温度较敏感青霉素合成速率对温度较敏感第42页/共138页 改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成 。 影响生物合成方向。 e.g. 四环素发酵中金色链霉菌：T5.0：酵母形态变小，发酵液变黑，且污染大量细菌 pH0.5% 低pH6.8控制加糖 7% ， OTR逐渐至OTR=，即 ，高位平衡 当处于高位平衡时，表明供氧性能好。

17、高位平衡通常发生在正常情况的前、后期。LLaCCKOTR0dtdCLOTR,CC,CLL0dtdCL第64页/共138页n平衡点分析平衡点分析：当当CL（如对数生长期如对数生长期很大很大）， ，OTRCm, 卷须霉素: 而有些菌株 Ccr CCr，生产阶段满足生产阶段满足CLCm。 第70页/共138页（1 1）发酵异常指标 发酵中污染杂菌，溶解氧发生异常变化。 对于好气性杂菌，溶解氧会一反往常在较短时间内跌到零附近，跌零后长时间不回升。 对于厌气性杂菌，溶解氧升高。 污染噬菌体或其它不明原因引起 发酵液变稀，此时溶解氧迅速上升。 操作故障或事故分析 谷氨酸正常发酵和异常发酵的溶解氧曲线正常发

18、酵溶解氧曲线-异常发酵溶解氧曲线异常发酵光密度曲线第71页/共138页（2）补料控制指标 中间补料是否得当可以从溶解氧的变化看出。 发酵过程中出现“发酸”现象，此时溶解氧很快下降。 第72页/共138页（3）代谢方向控制指标 测量溶解氧可以确定CCr、Cm值 通过溶氧测量可以掌握由好气转为厌气培养的关键时机 e.g.天门冬酰胺酶发酵：45%饱和度 在酵母以及其他微生物菌体的生产中，溶氧值是控制其代谢方向的最好的指标之一 。第73页/共138页（4）设备性能、工艺合理性指标 评价设备性能、工艺合理性的最终指标：发酵单位 设备反映供氧性能： 搅拌桨形式 叶片形式 搅拌器直径d 搅拌档数m和搅拌器间

19、距s 档板宽度w和档板数z 通气：空气分布器的类型和位置 n，P/V 设备操作参数 罐压 WS或VVM搅拌搅拌设备几何参数设备几何参数第74页/共138页（4）设备性能、工艺合理性指标工艺条件反映耗氧和供氧特征 菌种性能：耗O2 培养基性能：耗O2、供O2 温度：耗O2、供O2 RQ（O2与CO2水平比较）：耗O2 表面活性剂：耗O2、供O2第75页/共138页改进工艺：控制补料速度、改进工艺：控制补料速度、T 的调节、中间补水、的调节、中间补水、 添加表面活性剂等等添加表面活性剂等等 对现有发酵工对现有发酵工厂进行技术改造厂进行技术改造 浅层次浅层次 修改设备和工艺修改设备和工艺 规模和控制

20、水平上档次规模和控制水平上档次 引入新型发酵类型引入新型发酵类型 深层次深层次 第76页/共138页 工艺的改进是否有效可通过溶解氧水平进行评价：工艺的改进是否有效可通过溶解氧水平进行评价： P/V的改变对溶解氧和产量的影响的改变对溶解氧和产量的影响 e.g.利福霉素发酵利福霉素发酵：5080h波谷阶段波谷阶段，P/V，KLa，供氧供氧；3W/L比比1 W/L批号的发酵单位增加约批号的发酵单位增加约900u/ml 搅拌转数搅拌转数n 对溶解氧和产量的影响对溶解氧和产量的影响e.g.赤霉素发酵赤霉素发酵：15 50h期间期间，n从从155 提高至提高至180r/min， 赤霉素单位赤霉素单位第7

21、7页/共138页（1 1）溶解氧控制的一般原则 生长阶段： 即可 产物合成阶段： 即可v过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑制作用CrLCC mLCC 第78页/共138页（2）溶解氧控制作为发酵中间控制的手段之一 v控制原理 发酵过程中， 糖量 x , QO2 CL 糖量 QO2 CL 补糖使CL下降，而CL回升的快慢取决于供氧效率。 对于一个具体的发酵，存在一个最适氧浓度（Cm）水平，补糖速率应与其相适应。 mLCC，加大补糖速率加大补糖速率 mLCC ，减小补糖速率减小补糖速率实现用溶解氧水平控制补料速率实现用溶解氧水平控制补料速率 第79页/共138页 补糖速率控制在正好使生产菌处

22、于所谓“半饥饿状态”，使其仅能维持正常的生长代谢，即把更多的糖用于产物合成，并永远不超过罐设计时的KLa水平所能提供的最大供氧速率。 v控制原则（2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一 第80页/共138页v控制方法 溶氧和补糖控制系统 溶氧和pH控制的系统 （2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一 第81页/共138页溶氧在加糖控制上的应用溶氧在加糖控制上的应用第82页/共138页溶氧与溶氧与pH协同控制系统协同控制系统第83页/共138页（3）溶解氧控制的工艺方法：从供氧、需氧两方面考虑 供氧方面：提高氧分压（氧分含量），即 ，提高供氧能力改变搅拌转速：通过改变KLa来提高供氧能力 通气速

23、率Ws ：Ws增加有上限，引起“过载”、泡沫提高罐压： ，但同时会增加CO2的溶解度，影响pH及可能会影响菌的代谢，另外还会增加对设备的强度要求。 CC第84页/共138页改变发酵液理化性质（， ，Ii） 加消泡剂，补加无菌水，改变培养基成分改变KL改变温度： ，提高推动力（C*CL）C,T（3）溶解氧控制的工艺方法（续）溶解氧控制的工艺方法（续）n 供氧方面：供氧方面：第85页/共138页（3）溶解氧控制的工艺方法（续） 耗氧方面 限制性基质的流加控制（补料控制）：在OTR一定情况下，控制基质浓度限制、x 限制 控制溶解氧第86页/共138页（4）溶解氧自动控制系统 改变通气速率的溶氧控制系

24、统 改变搅拌转速的溶氧控制系统 改变通气量、转速、罐压所组成的多参数溶氧控制系统 第87页/共138页溶解氧对被孢霉合成花生四烯酸 (AA) 的影响 溶氧量对溶氧量对AA产量的影响产量的影响注：摇床转速注：摇床转速150r/min, 25 KLa越大越大，培养基中溶培养基中溶解氧越多解氧越多, , AA合成速合成速度越快度越快第88页/共138页溶解氧控制对鸟苷产量的影响不同的不同的DO控制条件下鸟苷积累的比较控制条件下鸟苷积累的比较DO()：5，l0，20，30发酵过程发酵过程 DO 变化与鸟苷变化与鸟苷 积累的关系积累的关系DO 控制在控制在1020，产物积累产物积累，鸟苷含量最高。，鸟苷

25、含量最高。DO在在5和和30，前期产物积累前期产物积累，但后期基本不增加，但后期基本不增加.DO水平的超高阶段水平的超高阶段(发酵周期发酵周期28h44h)，鸟苷积累量基本不，鸟苷积累量基本不增加；调整增加；调整DO 在适当水平上，鸟苷积累量继续上升。在适当水平上，鸟苷积累量继续上升。 第89页/共138页（六）CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制1. 定义 2. 发酵过程中CO2释放率的变化3. . CO2对发酵的影响 第90页/共138页1. 定义 呼吸商（RQ）：指菌体呼吸过程中，CO2释放率和菌的耗 氧速率之比，RQ反映菌的代谢情况。 菌体耗氧速率 OUR，molO2/Lh 菌体CO2释

26、放率CER，molCO2/LhOURCERRQ 第91页/共138页（1 1）影响尾气中CO2浓度的因素 通入空气量： 呼吸强度： CO2溶解度： 菌体量：出2COC,VVM出，2CO2CO2OCQQ出出，；、2CO2COCPC,TPT出，2CO2COCCERxQx第92页/共138页（2）CER变化规律 CO2积累量渐增，与x曲线对应，基本类似S型曲线变化； 当工艺和设备参数一定的情况下，CER与x有比例关系（CER菌体生长速率）； CO2浓度变化与O2浓度变化成反向同步关系。第93页/共138页CERdtCERdt，菌体干重的时间曲线，菌体干重的时间曲线1- CERdt1- CERdt；2

27、-2-菌量菌量第94页/共138页（3）CER的测量与计算 测量方法：热导、红外分析仪、质谱仪 计算 fCCC1CCVFxQCER2CO2O2CO2COL2CO进出出出惰进进第95页/共138页（1 1）研究参数CO2的意义 作为代谢产物或中间前体，尾气中CO2积累与生物量 成正比，通过C质量平衡估算生长速率和细胞量。 高浓度CO2对发酵多表现为抑制作用，应实施测量与 控制； 尾气CO2不仅直接反映代谢情况，而且和其它参数及补料操作密切相关，可作为工艺优化的指标。 第96页/共138页（2）CO2对细胞的作用机制 “麻醉”作用 CO2及HCO3-都会影响细胞膜的结构，使膜的流动性及表面电荷密度

28、发生变化，导致许多基质的跨膜运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，细胞生长受到抑制，形态发生改变。 第97页/共138页（3）CO2对菌体生长及产物形成的影响 CO2, 基质分解速率，ATP ，中间产物或形态变异导致产量 高浓度CO2抑制作用的独立性: 只要CO2在培养液中浓度过量，即使供氧充足（CLCCr），CO2的抑制作用不能解除，这种负作用在放大过程更明显。 正确评价通气的作用： 供氧： 排废气： 水分及挥发性组分的散失 LaK,VVM第98页/共138页（4）CO2释放与发酵过程参数pH及操作参数补糖速率的关系 在青霉素发酵中补糖将引起排气CO2增加，同时pH下降。

29、 糖、CO2、pH三者的相关性，被青霉素工业生产上用于补料控制的参数，并认为排气CO2的变化比pH变化更为敏感，所以测定排气CO2释放率 （CER）来控制补糖速率。 补糖与溶氧及pH协同控制 补糖速率与CER控制 补糖对排气补糖对排气CO2和和pH的影响的影响第99页/共138页（4）尾气CO2与O2的相关性 相关程度表示： 尾气CO2与O2相关性：反向同步关系 呼吸商（RQ）与发酵的关系不同菌株、同一菌株不同代谢途径、同一菌株利用不同基质、同一菌株在不同发酵阶段，RQ值不相同。RQ值可以表征发酵状况。 OURCERRQ fCC1CCCVFxQOUR2O2CO2O2OL2O出出出惰进进第100

30、页/共138页青霉素发酵不同阶段青霉素发酵不同阶段： 菌体生长阶段菌体生长阶段：RQ0.909 维持阶段维持阶段：RQ=1 生产阶段生产阶段：RQ=4如果产物的还原性比基质大时，其如果产物的还原性比基质大时，其RQ值就增加；反之，值就增加；反之，当产物的氧化性比基质大时当产物的氧化性比基质大时，RQ值就要减少值就要减少，其偏离程其偏离程度决定于单位菌体利用基质形成产物的量。度决定于单位菌体利用基质形成产物的量。 产物形成对产物形成对RQ影响最大影响最大第101页/共138页（七）基质浓度对发酵过程的影响及补料控制1. 基质浓度对发酵的影响 2. 补料控制第102页/共138页（1） 基质浓度对

31、微生物生长的影响 sKS情况下，比生长速率与基质浓度呈直线关系： 一般情况下符合Monod方程式 基质浓度高时 SkSmaxSkSSmaxSkkiimax第103页/共138页第104页/共138页(2) 基质浓度对产物合成的影响 低浓度限制 低水平诱导 高浓度抑制及分解阻遏作用e.g.葡萄糖氧化酶发酵：葡萄糖用量从8%降至6%，补入2%氨基乙酸或甘油，使酶活力分别提高26%或6.7%。 谷氨酸发酵（乙醇为碳源）：当乙醇浓度为2.5g/L和35g/L时，可延长谷氨酸生产时间，但在更高浓度下，菌体生长受到抑制，谷氨酸产量降低。第105页/共138页（1）补料的目的 解除基质过浓的抑制 解除产物的

32、反馈抑制 解除分解代谢物阻遏作用 避免因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多而造成波谷现象。 在生产上，补料还经常作为纠正异常发酵的一个重要手段。第106页/共138页（2）补料的内容n 补充微生物能源和碳源补充微生物能源和碳源n 补充菌体所需要的氮源补充菌体所需要的氮源n 补充微量元素或无机盐补充微量元素或无机盐n 添加前体、诱导剂等添加前体、诱导剂等第107页/共138页（3）补料的原则 中间补料的数量为基础料的13倍 。 补料的原则就在于控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。 现有的各种补料措施都是通过实验方法确定的。 第108页/共138页 大多数补料分批发酵均补

33、加生长限制性基质大多数补料分批发酵均补加生长限制性基质以经验数据或预测数据控制流加；以经验数据或预测数据控制流加；用传感用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加；加；以以溶氧、pH、RQ、排气中CO2分压及代谢物质浓度等参数间接控制流加；等参数间接控制流加；以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基质的浓度，间接控制流加。计算限制性基质的浓度，间接控制流加。（4）补料控制的策略第109页/共138页（5）反馈控制参数的确定 为了有效地进行中间补料，必须选择恰当的反馈控制为了有效地进行中间补料，

34、必须选择恰当的反馈控制参数，以及了解这些参数与微生物代谢、菌体生长、参数，以及了解这些参数与微生物代谢、菌体生长、基质利用以及产物形成之间的关系。基质利用以及产物形成之间的关系。 e.g. 谷氨酸发酵 在谷氨酸发酵过程中的某阶段，生产菌的摄氧率和基质消耗速率之间存在着线性关系。mmolmmolOxqOURk2S糖耗耗氧量第110页/共138页K=1.51K=1.75K=2.16谷氨酸发酵中谷氨酸发酵中K值对糖浓度的控制的影响值对糖浓度的控制的影响第111页/共138页（6）补料速率的确定 优化补料速率是补料控制中十分重要的一环，补料补料速率要根据微生物对营养等的消耗速率及所设定的速率要根据微生

35、物对营养等的消耗速率及所设定的培养液中最低维持浓度而定。培养液中最低维持浓度而定。 补糖速率最佳点与设备的供氧能力有关。 e.g.青霉素发酵：青霉素发酵：KLa大的设备补料速率相应大些；供氧低的设备，补料速率相应减少，产量比供氧能力好的设备降低23。第112页/共138页（7）实例：四环素发酵中的补糖控制 补糖时间对四环素发酵单位的影响补糖时间适当补糖时间适当 （ 45h后加）后加）补糖时间过晚补糖时间过晚 （62h开始加）开始加） 补糖时间过早补糖时间过早 （20h后加）后加）第113页/共138页n 维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作

36、用第114页/共138页补糖对四环素发酵的影补糖对四环素发酵的影响响 在最适补加葡萄在最适补加葡萄糖的条件下，能正糖的条件下，能正确控制菌丝量的增确控制菌丝量的增加、糖的消耗与发加、糖的消耗与发酵单位增长三者之酵单位增长三者之间的关系，就可获间的关系，就可获得比采用丰富培养得比采用丰富培养基时更长的生物合基时更长的生物合成期。成期。n 维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用第115页/共138页（八）高密度发酵及过程控制1. 高密度发酵2.高密度发酵策略3.高密度发酵技术4.高密度发酵存在的问题第116页/共138页1. 高密度发酵 代谢产

37、物的合成是靠菌体作为生产者来完成的。 高细胞密度发酵就是为了适应这一要求而得到广泛的重视。 高密度发酵：在发酵过程中保持较高的细胞密度，同时细胞或菌体的生产能力保持在较佳的状态。 第117页/共138页高细胞密度发酵成功的实例菌种菌种特征特征基础培养基基础培养基发酵罐发酵罐类型类型培养方法培养方法细胞干重细胞干重（g/L）培养时间（培养时间（h）产率产率 (g/L)/d大肠杆菌大肠杆菌需氧、葡萄需氧、葡萄糖过量、形糖过量、形成乙醇成乙醇葡萄糖矿物盐葡萄糖矿物盐或甘油矿物盐或甘油矿物盐搅拌罐搅拌罐葡萄糖（甘油）葡萄糖（甘油）非限制指数补料非限制指数补料140150304090100枯草杆菌枯草杆

38、菌嗜温菌嗜温菌含葡萄糖的完含葡萄糖的完全培养基全培养基搅拌罐搅拌罐补料分批培养，补料分批培养，以葡萄糖调节以葡萄糖调节pH18530160毕氏酵母毕氏酵母嗜温菌嗜温菌葡萄糖矿物盐葡萄糖矿物盐搅拌罐搅拌罐补料分批培养，补料分批培养，补甲醇补甲醇10050120120150酿酒酵母酿酒酵母嗜温菌嗜温菌含葡萄糖的完含葡萄糖的完全培养基全培养基搅拌罐搅拌罐连续培养，流加连续培养，流加葡萄糖葡萄糖2108050150第118页/共138页2.高密度发酵策略 使用最低合成培养基以便进行准确的培养基设计和计算生长得率。 优化细胞生长速率，使得碳源能被充分利用和获得较高的产率，用养分流加来限制菌的生长速率还能

39、控制培养物对氧的需求和产热速率。 可用碳源作为限制性养分，且采用补料分批发酵来实现高密度发酵。 第119页/共138页3.高密度发酵技术 用于高密度发酵的生物反应器类型： 搅拌罐，透析膜反应器， 气升式反应器，气旋式反应器 在工业化生产中，通常采用的是搅拌罐与补料工艺来进行高细胞密度发酵。 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略，限制性基质（葡萄糖）的流加模式有3种：恒速流加补料、变速流加补料和指数流加补料。 第120页/共138页4. 高密度发酵存在的问题 水溶液中的固体与气体物质的溶解度，基质对生长的限制或抑制作用，基质与产物的不稳定性和挥发性，产物或副产物的积累达到抑制生长的水平

40、，高浓度的CO2与热的释放速率，高的氧需求以及培养基的粘度不断增加等 。第121页/共138页1. 泡沫的产生及其影响 泡沫的产生 通气和搅拌 代谢气体的逸出 存在稳定泡沫的表面活性物质第122页/共138页1. 泡沫的产生及其影响 泡沫的类型泡沫的类型一类存在于发酵液的液面上。这类泡沫气相所占比一类存在于发酵液的液面上。这类泡沫气相所占比例特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辨例特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辨的界线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液的界线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见的泡沫。中所见的泡沫。另一类出现在粘稠的菌丝发酵液当中。这种泡沫分另一类出现

41、在粘稠的菌丝发酵液当中。这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没散很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没有明显的波面界限，在鼓泡的发酵液中气体分散相有明显的波面界限，在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比例由下而上地逐渐增加。占的比例由下而上地逐渐增加。第123页/共138页 泡沫的不利影响 降低了发酵罐的装料系数 增加了菌群的非均一性 增加了染菌机会 大量起泡引起“逃液”，导致产物的损失 泡沫严重时会影响通气搅拌的正常进行 消泡剂的加入将给提取工序带来困难1. 泡沫的产生及其影响第124页/共138页2.发酵过程中泡沫的消长规律 影响因素 通气搅拌的强度 培养基的配比及原材料组成

42、 培养基的灭菌方法和操作条件 微生物代谢活动造成发酵液性质变化 染菌 第125页/共138页霉菌发酵过程中培养液的性质与泡沫的关系霉菌发酵过程中培养液的性质与泡沫的关系第126页/共138页3. 泡沫的控制 （1）机械消泡（2）化学消泡 （3）从微生物本身特性着手，防止泡沫形成 筛选不产生泡沫的微生物突变株 几种微生物混合培养 第127页/共138页（1）机械消泡 原理：靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。 优缺点 优点：不需引入外来物质，可节省原材料，减少 污染机会，并可减少培养液性质复杂化的程度。 缺点：不如化学消泡迅速可靠，需要一定的设备和消耗一定的动力；不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素 第128