细胞培养小结

1、CO2培养箱，下面的松开是关，这个阀门只要打开一点点就行，有那么一点儿感觉紧了就可以了，折上管子，看见读数在0.03MPa，先让温度升至37，稳定之后再打开CO2，大概需要4-5个小时。细胞培养：1、 材料：DMEM培养基或1640培养基、胎牛血清、双抗（青霉素，链霉素）、0.25%胰蛋白酶（含0.02%的EDTA），PBS等。培养液的制备：DMEM（或1640）+10%血清+1%双抗。（若用50ml的离心管即45ml DMEM+5ml 血清+0.5ml 双抗）二、培养过程：1.复苏：复苏细胞是从零下80冰箱或液氮罐中取出冻存管，迅速投入37水浴中，使其融化（1分钟左右）（部分融化），用培养基

2、缓慢稀释至原体积的56倍，大部分细胞完全贴壁后（4-6小时），吸出含有冻存液的培养基，并换成完全培养基；或取出冻存管以后，放入37的水浴至半融化状态，然后将冻存管内的液体移至培养盒，补充培养基4-5ml。放入培养箱12小时左右使其贴壁生长，第二天换液。2. 换液：首先将培养皿内液体倒出，用PBS冲洗2-3遍（目的是使分泌物和死亡的细胞脱落），然后再加入适量的新的培养基。3. 传代：培养皿内细胞长满后，需要进行传代培养，首先将培养皿内液体倒掉，用PBS冲洗2-3遍，加入2-3ml胰酶，培养一段时间（929为三四分钟，培养箱内）（培养时间可根据文献或经验）【下次试试放在培养箱里】，在显微镜下观察细

3、胞全部悬浮即消化完成（此时细胞成圆形），立即加入3-4ml培养液，使其稀释胰酶（否则会杀死细胞），难脱落的可以敲打培养盒使其悬浮脱落。用移液管进行吹打，使贴壁细胞完全脱落，吹打的时候要从上往下，从靠近瓶口端向瓶底端吹打。并且要注意尽量不产生泡沫。吹打完成后，将液体移至离心管，1000转离心2-3分钟左右，弃上清液。加入适量新鲜的培养液（23ml），吹打混匀，并进行分装，补充培养液。4. 冻存：细胞传到第三代，传代后的第二天，细胞正处于减数分裂期，在这个时期冻存（细胞的活性最大），要冻存的培养盒中保证传代时的浓度比较大。用传代的步骤，到“弃上清液”这步，加入冻存液（5-10%DMSO+培养基）。

4、每个冻存管是1ml量。传代：传三次才会稳定，大概十天左右，细胞长到70%-90%就应该传代，具体没有时间的安排。三、 实验数据1. 细胞计数取出培养皿，倒掉上清液，用PBS清洗两遍加2ml胰酶，消化完成后，加部分培养基，离心（1000r/min 2-3min）倒掉上清液，取一滴在玻璃皿的侧面，使其均匀分布于玻璃皿（量不能过大或过小），放在显微镜下观察，如下图。数细胞个数时，中线上的不数，只边上4个小格子，若在线上，则只数上、左边上的细胞（是为了避免重复），记个数为M，M/4×104，与查出所需的浓度相比，确定需稀释倍数。(注：加入板中的体积是0.1ml，细胞个数=目标浓度*0.1*稀释后体积)将稀释后的细胞加入到如下板中，空白组中不加。 空白组：不加细胞，只加培养基，不加药 外面一圈加100l PBS对照组：正常细胞，不加药种药待96孔板中细胞贴壁后（一般是前一天种细胞，24小时后种药），直接向每孔中加入10ul药，放在培养箱中培养。加染色剂培养到规定的时间后，将培养基全部吸